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Auskünfte: Jörg Hummerjohann, E-Mail: joerg.hummerjohann@alp.admin.ch, Fax +41 31 323 82 27, Tel. +41 31 323 82 56

Häufigkeit von Paratuberkulose- Erregern in Schweizer Rohmilch

AGRARForschung 15 (2): 104-107, 2008

Zusammenfassung

M

Mycobacterium avium subsp.

paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose bei Rindern und anderen Tieren.

Die Krankheitssymptome sind eine chronische Darmentzün- dung mit Durchfall und Abma- gerungserscheinungen. Sowohl subklinisch infizierte als auch erkrankte Rinder scheiden MAP mit dem Kot und der Milch aus.

Da der Keim bei der Pasteurisie- rung der Milch nicht vollständig abgetötet wird, kann der Mensch beim Konsum von Milch MAP aufnehmen.

Zusammenhang zwischen MAP und Morbus Crohn?

Zurzeit wird kontrovers disku- tiert, ob es einen kausalen Zusam- menhang zwischen MAP, das üb- rigens auch im Trinkwasser und in gedüngtem Gemüse und Salat vorkommen kann, und dem so- genannten Morbus Crohn, einer entzündlichen Darmerkrankung des Menschen, gibt. Deren Ur- sache ist bislang wenig bekannt und wahrscheinlich von mehre- ren Faktoren abhängig (Green- stein 2003; Naser et al. 2004;

Korzenik 2005; Bundesministe- rium für Ernährung, Landwirt- schaft und Verbraucherschutz 2007; Feller et al. 2007).

MAP in Milch und Milchprodukten

In Grossbritannien wurden in vier von 244 Proben (1,6 %) roher Molkereimilch MAP per kultu- rellem Verfahren und 7,8 % per IMS-PCR detektiert (Grant et al.

2002). In kommerzieller, pasteu- risierter Milch wurden lebende MAP mit einer relativen Häufig- keit von 1,8% (UK), bzw. 2,8 % (USA) nachgewiesen (Grant et

al. 2002; Ellingson 2005). In ei- ner früheren Studie von Agro- scope Liebefeld-Posieux konnte anhand von mit hohen MAP- Konzentrationen kontaminier- ten Modellkäsen gezeigt werden, dass die Anzahl der Mykobak- terien während der Käseherstel- lung um mehrere Zehnerpoten- zen verringert wird, aber nach 120 Tagen Reifungszeit im Halb- hart- und Hartkäse noch nach- weisbar ist (Spahr und Schaf- roth 2001).

Für eine umfassende Risikobe- urteilung ist es daher notwendig zu wissen, ob vermehrungsfähige MAP über die Milch in die Le- bensmittelkette gelangen. In der Schweiz hatte man eine Häufig- keit von 8,0 % von MAP im Se- rum auf Herden-Niveau (Stärk et al. 1997) bestimmt. Ausserdem wurden in 19,7 % der Sammel- milch ab Landwirtschaftsbetrieb MAP-Erbsubstanz mittels IS900- PCR nachgewiesen (Corti und Stephan 2002), diese Zahl lässt aber kaum Rückschlüsse auf die Häufigkeit vermehrungsfähiger MAP-Zellen zu.

Tab. 1. Herkunft der Milchproben, die auf MAP untersucht wurden

Anzahl Kanton Probenahme

98 Zug April 03 – Nov.03

19 Thurgau April 03 – Nov. 03

32 Appenzell April 03 – Nov. 03

19 Waadt Juli 03 – Nov. 03

14 Freiburg April 03 – Nov. 03

48 Bern April 03 – Nov.03

2 Genf April 03

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Wie hoch die Häufigkeit (Präva- lenz) von vermehrungsfähigen MAP in Schweizer Rohmilch ist, war bislang unbekannt und wur- de daher in der vorliegenden Stu- die untersucht.

Aufwendige Analytik 232 Sammelmilchproben des Sommers 2003, repräsentativ für weite Teile der Schweiz (Tab. 1), wurden nach der Methode von Grant et al. (2002) auf die An- wesenheit von MAP getestet, wo- bei auf den Einsatz des BACTEC Systems verzichtet wurde. Dabei wurden 50 ml pro Probe zuerst mit 0,75 % Hexadecylpryridi- niumchlorid (HPC; Fluka Che- mie AG, Buchs) dekontaminiert und in 1 ml PBS-T resuspen- diert. Dann wurde mit 10 µl an- stelle von 250 µl eine Anrei- cherung auf HEYM-Schrägagar (mit 2 µg/ml Mycobactin J; BD AG, Basel) durchgeführt. Parallel dazu erfolgte eine Anreicherung in flüssigem Middle-brook 7H9- Medium (BD AG, Basel), die mit 500 µl Resuspension ange- impft worden war. Da MAP zu den langsam wachsenden My- kobakterien gehört, wurde eine Inkubationszeit von 18 Wochen bei 37°C gewählt. Das Flüssig- medium wurde nach neun und 18 Wochen auf die Anwesen- heit von säurefesten Stäbchen mit Ziehl-Neelsen-Färbung (Che- mie Brunschwig AG, Basel) ge- prüft (Abb. 1), positive respek- tive verdächtige Proben wurden auf HEYM-Schrägagar umge- züchtet. Die Schrägagarkultu- ren wurden wöchentlich auf das Wachstum von kleinen, trans- parenten Kolonien kontrolliert,

Abb. 1. Mycobacteri- um avium ssp. para- tuberculosis (MAP):

Koloniemorphologie auf HEYM-Schräga- gar (oben) und Ziehl- Neelsen-Färbung im Lichtmikroskop (säu- refeste, rote Stäbchen, unten). Gezeigt ist der Referenzstamm My- cobacterium avium subsp. paratuberculo- sis DSM 44135. (Fotos:

Philipp Ritter, ALP)

die nach einigen Tagen weiss- lich und langsam «schrumpelig»

werden (Abb. 1). Diese Koloni- en wurden ebenfalls auf Säure- festigkeit getestet. Mykobakte- rien verdächtige Isolate wurden dankenswerterweise am Institut für Infektionskrankheiten der Universität Bern oder am Ins- titut für Lebensmittelsicherheit und -hygiene der Universität Zü- rich mit klassischen und moleku- larbiologischen Methoden diffe- renziert.

Keine MAP in Schweizer Rohmilch nachgewiesen In den 232 getesteten Milchpro- ben konnten keine MAP nach- gewiesen werden. Bei 16 Proben wurde verdächtiges Wachstum auf HEYM-Schrägagar festge- stellt, von denen allerdings nur drei eine reproduzierbare Säu- refestigkeit aufwiesen (Tab. 2).

Diese Mykobakterien wurden als

«andere Mykobakterien» (z.B.

Mycobacterium porcinum) dif- ferenziert.

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Der Referenzstamm Mycobacte- rium avium subsp. paratubercu- losis DSM 44135, der als Posi- tiv-Kontrolle in einer Milchprobe pro Untersuchungsserie künst- lich zugegeben wurde, wurde stets anhand von Koloniemor- phologie und Säurefestigkeit reisoliert und bestätigt.

Dringend benötigt: Referenz- methode für MAP-Nachweis In der vorliegenden Studie konn- ten keine MAP nachgewiesen werden. Daraus kann man schlie- ssen, dass die Anzahl vermeh- rungsfähiger Zellen auf jeden Fall deutlich unter der Häufig- keit des MAP-DNA-Nachweises der Studie von Corti und Stephan (2002) liegt. Die Schweizer Situ- ation ist vergleichbar mit derjeni- gen in Irland, da dort nur aus einer von 389 Rohmilchproben MAP kultiviert werden konnte, und das trotz des Nachweises von 12,9%

PCR-positiver Proben (O’Reilly et al. 2004).

Kann man jetzt behaupten, dass die Schweizer Rohmilch voll- ständig frei von vermehrungsfä- higen MAP ist? Sicherlich nicht, da zum einen für eine solche ab- solute Aussage sehr viel mehr Proben analysiert werden müss- ten und zum anderen, und das ist viel wichtiger, weist die vorhan- dene Methode auch Schwachstel- len auf. Eine Unterbestimmung gegenüber dem «reellen» Wert ist möglich durch den allerdings unerlässlichen Dekontaminati- onsschritt und wegen eines mög- lichen Überwachsens der lang-

sam wachsenden Mykobakterien durch schnell wachsende Be- gleitflora (Methodenübersicht:

Grant und Rowe 2001). Diese Probleme machen deutlich, dass eine Standardisierung der Un- tersuchungsmethoden dringend notwendig ist. Dasselbe gilt üb- rigens auch für die verwendeten PCR-Methoden zum Nachweis von MAP-DNA. Es wurde näm- lich gezeigt, dass die IS900-PCR nicht vollständig spezifisch für MAP ist (Cousins et al. 1999).

Damit besteht auch die Möglich- keit, dass die von Corti und Ste- phan (2002) bestimmte Häufig- keit von 19,7 % überbestimmt ist. Eine Suche nach spezifi- scheren PCR-Methoden zur De- tektion von MAP hat daher be- gonnen (Englund 2003; Tasara und Stephan 2005). Die letztge- nannte Arbeitsgruppe wies mit dem neuen PCR-System Erb- substanz von MAP in nur 3 von 100 Proben von Schweizer Sam- mel-Rohmilch nach (Bosshard et al. 2006).

Schlussfolgerungen und Ausblick

Ein massives Vorkommen kul- tivierbarer MAP in Schweizer Rohmilch lässt sich nach dem bisherigen Erkenntnisstand aus- schliessen. Allerdings kann erst nach Studien mit einer noch zu entwickelnden international an- erkannten Referenzmethode eine gesicherte Risiko-Beurteilung bezüglich MAP in Milch- und Milchprodukten auch für die Schweiz vorgenommen werden.

Dabei ist zu beachten, dass mög-

Tab. 2. Resultate der mikrobiologischen Analysen von Rohmilch auf MAP Probenanzahl Wachstum auf Ziehl-Neelsen- Endresultat

HEYM-Schrägagar Färbung

216 - - keine Mykobakterien

8 +/- - keine Mykobakterien

5 + +/- keine Mykobakterien¹

3 + + andere Mykobakterien¹

- = negativ, + = positiv, +/- = schwach positiv

1 nach Differenzierung bzw. wiederholtem Test auf Koloniemorphologie und Säurefestigkeit

lichst auch Gehalte (also quan- titative Angaben) von MAP in Rohmilch erfasst werden, damit z. B. anhand der Daten von Spahr und Schafroth (2001) berechnet werden kann, ob ein Vorkom- men von MAP im verkaufsferti- gen Halbhart- beziehungsweise Hartkäse in der Schweiz über- haupt potenziell möglich ist. In einer aktuellen Studie konnten keine vermehrungsfähigen MAP in Schweizer Rohmilchkäse aus dem Einzelhandel nachgewiesen werden (Stephan et al. 2007).

Weiterhin gilt es abzuklären, wie hoch der MAP-Eintrag in die Nahrungsmittelkette über ande- re Wege wie z.B. Trinkwasser, Gemüse oder Fleisch ist (z.B.

Pickup et al. 2005). Und dies alles unter der Voraussetzung, dass sich der Verdacht auf den Zusammenhang zwischen Mor- bus Crohn und MAP in der Zwi- schenzeit erhärtet hat.

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SuMMARY

Incidence of paraturbeculosis pathogens in Swiss raw milk

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), cause of paratuberculosis in cattle and other animals, is meant to be sus- picious for being involved in Crohn’s disease, an inflammato- ry bowel disease of humans. As the bacterium is able to partial- ly survive the pasteurization of milk and the process of cheese ripening, it is important to know the presence of living MAP in Swiss raw milk. In the current study, 232 bulk milk samples from different parts of Switzerland were analysed for the presence of living MAP by cultural method. As MAP was not able to be de- tected in any sample, one can conclude, that Swiss raw milk is not massively and widespread contaminated with MAP. How- ever, a final risk assessment can only be performed, if studies are present using a reference method for MAP detection which is still needed to be developed.

Key words: Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, raw milk, Crohn’s disease

RéSuMé

Fréquence de l’agent de la paratuberculose dans le lait cru suisse

Depuis quelque temps, on soupçonne Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), l’agent de la paratuberculose chez les bovins et d’autres animaux, de jouer un rôle dans la ma- ladie de Crohn, une maladie inflammatoire chronique de l’intestin chez l’homme. La bactérie étant en mesure de survivre à la pas- teurisation du lait et à la maturation du fromage, il est important de connaître dans quelle ampleur les MAP capables de se mul- tiplier sont présentes dans le lait cru en Suisse. Dans la présen- te étude, 232 échantillons de lait de collecte provenant de diffé- rentes régions de Suisse ont été analysés au moyen de cultures quant à la présence de MAP vivantes. Dans aucun échantillon, on n’a détecté des MAP cultivables. C’est pourquoi on peut en conclure que le lait cru suisse n’est pas contaminé massivement et à large échelle par des MAP. Une évaluation définitive des ris- ques ne pourra toutefois être effectuée que lorsque l’on dispose- ra d’études effectuées avec une méthode de référence - qui doit encore être mise au point - pour la détection des MAP.