Aus der Abteilung Allgemein- und Viszeralchirurgie (Prof. Dr. med. B. M. Ghadimi)
im Zentrum Chirurgie
der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen
Der HER-2-Status im lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinom:
Positivitätsrate, mögliche prädiktive und prognostische Bedeutung
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Georg-August-Universität zu Göttingen
vorgelegt von Hanna Styczen
aus
Nowy Sacz (Neusandez/Polen)
Göttingen 2013
D e k a n: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer
I. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. T. Liersch
II. Berichterstatter/in: Prof. Dr. med. Trümper
III. Berichterstatter/in: Prof. Dr. med. Ströbel
Tag der mündlichen Prüfung: 12.11.2013
I
Inhaltsverzeichnis
I. Abkürzungsverzeichnis ... IV
II. Abbildungsverzeichnis... VIII
III. Tabellenverzeichnis ... IX
1 Einleitung ... 1
1.1 Ätiopathogenese kolorektaler Karzinome ... 2
1.2 Klassifikation kolorektaler Karzinome ... 3
1.2.1 TNM-Klassifikation ... 4
1.2.2 Stadieneinteilung nach UICC... 4
1.3 Therapiealgorithmen für die Therapie des Rektumkarzinoms ... 5
1.3.1 Neoadjuvante Therapie des lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinoms ... 6
1.3.2 Operative Strategien der Rektumresektion ... 8
1.3.3 Adjuvante Systemtherapie ... 9
1.4 Konzepte zur Individualisierung der onkologischen Therapie beim lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinom (UICC II/III) ... 9
1.5 Prädiktive und prognostische Marker in der Therapie des Rektumkarzinoms...10
1.6 Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2/neu) ...11
1.6.1 Struktur und Funktion ... 11
1.6.2 Tumorbiologische Bedeutung von HER-2 ... 13
1.6.3 Klinisch-therapeutische Relevanz des HER-2-Status bei HER-2- positiven Karzinomen ... 14
1.6.4 Detektionsmethoden des HER-2-Status ... 15
1.7 Zielsetzung und Fragestellung ...16
2 Patientenkollektiv, Materialien und Methoden... 17
2.1 Untersuchtes Patientenkollektiv ...17
2.2 Prätherapeutisches Tumorstaging ...18
II
2.3 Studiendesign ...18
2.4 Prätherapeutische Parameter ...21
2.5 Materialien ...23
2.6 Perioperative Qualitätssicherung, histopathologische Aufbereitung und Beurteilung des residuellen Tumorgewebes ...23
2.7 Histopathologische Beurteilung nach neoadjuvanter Radiochemotherapie ...25
2.8 Immunhistochemische Analysen ...25
2.8.1 Schnittanfertigung ... 27
2.8.2 Färbeprotokoll ... 27
2.8.3 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen ... 28
2.9 Dual-in-situ-Hybridisierung ...34
2.9.1 Färbeprotokoll der Dual-ISH ... 36
2.9.2 Auswertung der Dual-ISH-Färbungen ... 36
2.10 Follow-Up-Untersuchungen ...40
2.11 Statistische Analysen ...40
3 Ergebnisse ... 41
3.1 Resektionsverfahren ...41
3.2 Histopathologisches Tumorstaging ...42
3.3 Klinischer Langzeitverlauf ...45
3.4 HER-2-Status in prätherapeutischen Biopsien ...47
3.5 HER-2-Status im Rektumkarzinomresektat ...48
3.6 Vergleich des HER-2-Status aus prätherapeutischen Biopsien mit dem HER-2-Status aus Tumorgewebe nach Rektumresektion ...49
3.7 Korrelation des HER-2-Status prätherapeutischer Biopsien und von Tumorresektaten mit klinischen Parametern ...50
3.8 Korrelation des HER-2-Status mit dem tumorfreien und tumorspezifischen Überleben ...54
3.8.1 Korrelation des HER-2-Status aus prätherapeutischen Biopsien mit dem DFS und CSS ... 55
3.8.2 Korrelation des HER-2-Status aus Tumorgewebe nach Rektumresektion mit dem DFS und CSS ... 58
III
3.9 Subgruppenanalyse: Korrelation des HER-2-Status mit dem DFS und CSS
unter Berücksichtigung des Nodalstatus ...62
3.10 Univariate und multivariate Analysen ...64
4 Diskussion ... 65
4.1 Expressions- und Genamplifikationsmuster von HER-2 beim Rektumkarzinom ...65
4.2 HER-2 als histopathologischer Biomarker ...68
4.3 Prognostische Relevanz der HER-2-Überexpression und HER-2- Genamplifikation hinsichtlich des Gesamtüberlebens ...70
4.4 Vergleich des prognostischen Potentials von HER-2 in weiteren Tumorentitäten ...71
4.5 Anti-HER-2-Therapien: klinische Relevanz und Ausblick ...73
4.6 Tumorbiologie von HER-2 und EGFR ...76
5 Zusammenfassung ... 77
6 Anhang ... 79
6.1 TNM- und UICC-Klassifikationen ...79
6.2 Verwendete Materialien und Geräteliste ...80
6.3 Studienprotokolle...81
7 Literaturverzeichnis ... 83
IV
I. Abkürzungsverzeichnis
A. Arteria
AEG Adenokarzinom des gastroösophagealen Übergangs
AIO Arbeitsgemeinschaft Internistische Onkologie
AP Alkalische Phosphatase
APC Adenomatöse Polyposis Coli (Tumorsuppressorgen)
APE Abdomino-perineale Rektumexstirpation
ARO Arbeitsgemeinschaft Radiologische Onkologie
ARR Anteriore Rektumresektion
CAO Chirurgische Arbeitsgemeinschaft für Onkologie
CEA Carcino-Embryonales-Antigen; Tumormarker
c-erb-B2 Cellular avian erythroblastosis homologue B2
Chr Chromosom
CISH Chromogenic-in-situ-hybridization
cm Zentimeter
CRM Zirkumferentieller Resektionsrand
CSS Cancer Specific Survival, krankheitsspezifisches Überleben
CT Computertomographie
CTx Chemotherapie
DAB Diaminobenzidin
DFS Disease Free Survival, krankheitsfreies Überleben
V
DIG Digoxigenin
DNA Deoxyribonucleic Acid
DNP Dinitrophenyl
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
FAP Familiäre adenomatöse Polyposis
FDA Food and Drug Administration
FISH Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung
FMR Fernmetastasierungsrate
FOLFOX Therapieregime mit 5-FU, Folinsäure und Oxaliplatin
5-FU 5-Fluorouracil
G Grading, Differenzierungsgrad
GRCSG German Rectal Cancer Study Group
Gy Grey
HER-2 Human Epidermal Growth Factor Receptor-2
HNPCC Hereditäres nicht-Polyposis-assoziiertes kolorektales Karzinom
H2O2 Wasserstoffperoxid
HRP Horseradish Peroxidase
IHC Immunhistochemie
ISH In-Situ-Hybridisierung
KFO Klinische Forschergruppe
KRK Kolorektales Karzinom
VI
LK Lymphknoten
LKR Lokalrezidivrate
MAPK Mitogen-activated protein kinase
Min Minuten
mKRK metastasiertes kolorektales Karzinom
ml Milliliter
MRT Magnetresonanztomographie
OS Overall Survival
pCR pathologische Komplettremission
PCR Polymerase Chain Reaction
PME Partielle Mesorektale Exzision
R Resektionsstatus, Residualstatus
RCT Radiochemotherapie
RNA Ribonucleic acid
RT Radiotherapie
rUS rektale Endosonographie
TARR Tiefe anteriore Rektumresektion
TKI Tyrosinkinase-Inhibitoren
TME Totale Mesorektale Exzision
TNM Klassifikationssystem maligner Tumore
ToGA-Studie Trastuzumab for HER2-positive metastatic Gastric cancer - Trial
VII
TRG Tumor Regression Grading/ Tumorregressionsgrad UICC Union Internationale Contre le Cancer
WHO World Health Organization
VIII
II. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: „Adenom-Karzinom-Sequenz“ --- 3
Abbildung 2: Langzeitergebnisse der CAO/ARO/AIO-94-Studie und erste Ergebnisse der CAO/ARO/AIO-04-Studie --- 7
Abbildung 3: Signaltransduktionswege von EGFR --- 12
Abbildung 4: Studiendesign --- 20
Abbildung 5: Modell der IHC-HER-2-Gewebefärbung --- 26
Abbildung 6: HER-2-IHC-Testalgorithmus beim Magen- und Rektumkarzinom --- 31
Abbildung 7: HER-2-Scoring beim Rektumkarzinom --- 32
Abbildung 8: HER-2-Diagnostik beim Rektumkarzinom --- 33
Abbildung 9: Modell der Dual-ISH-Färbungen --- 35
Abbildung 10: HER-2-Dual-ISH-Testalgorithmus --- 38
Abbildung 11: HER-2-Dual-ISH-Färbungen --- 39
Abbildung 12: HER-2-Status in prätherapeutischen Biopsien --- 47
Abbildung 13: HER-2-Status im Rektumkarzinomresektat --- 48
Abbildung 14: Vergleich des HER-2-Status der Biopsie mit dem korrespondierenden Resektat --- 49
Abbildung 15: Korrelation des HER-2-Status aus prätherapeutischen Biopsien mit dem DFS --- 55
Abbildung 16: Korrelation des HER-2-Status aus Biopsien mit dem CSS --- 56
Abbildung 17: Korrelation des HER-2-Status aus Biopsien von Patienten mit einem (y)pN+ Status und dem CSS --- 57
Abbildung 18: Tumorfreies 5-Jahres- und 12.5-Jahres-Überleben im Vergleich --- 58
Abbildung 19: Therapieschemata in Abhängigkeit des HER-2-Status und Korrelation mit dem DFS --- 59
Abbildung 20: Tumorspezifisches 5-Jahres-Überleben --- 60
Abbildung 21: Tumorspezifisches 12.5-Jahres-Überleben --- 61
Abbildung 22: Subgruppenanalyse --- 62
IX
III. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: TNM-Klassifikation --- 4
Tabelle 2: Stadieneinteilung nach UICC --- 5
Tabelle 3: Unterteilung der Patientenkollektive --- 19
Tabelle 4: Patientenkohorten und prätherapeutische Charakterisierung --- 22
Tabelle 5: Tumorregressionsgrad--- 25
Tabelle 6: HER-2-Diagnostik beim Mamma-, Magen- und Rektumkarzinom --- 29
Tabelle 7: Charakterisierung der Subkollektive nach Operationsmethoden --- 41
Tabelle 8: Charakterisierung der Subkollektive mit postoperativen, kliniko- pathologischen Parametern --- 44
Tabelle 9: Korrelation der Follow-Up-Daten --- 46
Tabelle 10: HER-2-Expression und -Genamplifikation in cUICC-II/-III Rektumkarzinomen ---- 51
Tabelle 11: Vergleich des HER-2-Status mit prätherapeutischen und operativen Parametern --- 52
Tabelle 12: Vergleich des HER-2-Status mit postoperativen Parametern --- 53
Tabelle 13: Univariate und multivariate Analysen --- 63
1
1 Einleitung
Das kolorektale Karzinom (KRK) ist nach dem Mammakarzinom der Frau und dem Prostatakarzinom des Mannes die zweithäufigste Malignomerkrankung in Deutschland und dritthäufigste Krebserkrankung in den Vereinigten Staaten von Amerika (Robert Koch Institut 2012; Jemal et al. 2011). Aufgrund des demographischen Wandels ist besonders in den westlichen Industrieländern ein Anstieg der Neuerkrankungen (absolute Fallzahlen) in den letzten zwei Jahrzehnten zu verzeichnen.
Im Jahr 2008 wurden in Deutschland 65.390 Neuerkrankungen (35.350 Männer und 30.040 Frauen) des KRK registriert, von denen 30% im Rektum lokalisiert waren. Niedersachsen ist bezüglich der Inzidenzrate überdurchschnittlich vertreten (gemessen an der Inzidenzrate in der gesamtes Bundesrepublik) und belegt geschlechtsunabhängig leider eine Spitzenposition. Während die altersstandardisierte Sterberate (Mortalität) in den letzten 10 Jahren um mehr als 20% gesunken ist, bleibt das KRK die zweithäufigste Krebstodesursache in Deutschland (Robert Koch Institut 2012).
Auf Grund der hohen Prävalenz und Mortalität stellt das KRK nicht nur einen bedeutenden medizinisch relevanten Faktor dar, sondern hat auch im Hinblick auf den Anstieg der Inzidenzen im fortgeschrittenem Alter und der in unserer Gesellschaft immer weiter steigenden Lebenserwartung einen hohen sozioökonomischen Stellenwert (Liersch et al.
2005).
Laufende klinische Studien zum KRK und insbesondere zum Rektumkarzinom setzen ihren Fokus auf die Intensivierung der bereits etablierten multimodalen Therapie, um die Fernmetastasierungsrate als Prognose-limitierenden Faktor zu verringern, sowie auf die Identifikation prädiktiver und prognostischer Biomarker und mögliche neue Ansätze für eine personalisierte Behandlung. In diesem Kontext wurde in der vorliegenden Arbeit HER-2 im lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinom als Biomarker untersucht, der bereits als Biomarker und Target für eine Antikörper-adaptierte Therapie im Mamma- sowie im metastasierten Magenkarzinom bekannt ist und sich in der Klinik etabliert hat.
Einleitung
2
1.1 Ätiopathogenese kolorektaler Karzinome
Zu den Risikofaktoren, die ursächlich an der Entwicklung eines KRK beteiligt sind, zählen genetische Prädispositionen, Ernährungsstile (fettreiche und fleischreiche Kost), Risikoerkrankungen wie beispielsweise chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (insbesondere Kolitis ulcerosa) sowie endogene/ metabolische Einflüsse wie langjähriges Zigarettenrauchen, hoher Alkoholkonsum und körperliche Inaktivität. Überdies steigt die Inzidenz des KRK mit fortgeschrittenem Alter an - das heißt 90% der KRK werden nach dem 50. Lebensjahr diagnostiziert.
Ätiopathogenetisch entstehen KRK in über 90% der Fälle auf dem Boden von benignen intraepithelialen Neoplasien (Arasteh et al. 2009). Dieses als „Adenom-Karzinom-Sequenz“
bezeichnete Modell wurde erstmals von Muto et al. (1975) postuliert und durch Vogelstein et al. (1988) erweitert. Über einen Zeitraum von 10-15 Jahren führt die sequentielle Abfolge von verschiedenen genetischen Mutationen, infolgedessen Proto-Onkogene (z.B. KRAS) aktiviert und/ oder Tumorsuppressorgene (z.B. APC-Gen) inaktiviert werden, zu einer malignen Transformation des Normalgewebes mit einem unkontrollierten malignen Wachstum (s. Abbildung 1). Das Entartungsrisiko ist dabei abhängig von dem histologischen Aufbau (tubulös, villös, tubulovillös) und der Größe der Adenome (Arasteh et al. 2009).
Die „Adenom-Karzinom-Sequenz“ kann im Rahmen genetischer Syndrome wie beispielsweise der erblich bedingten familiären adenomatösen Polyposis (FAP) beschleunigt sein und bereits im jungen Lebensalter mit einem hohen Entartungsrisiko einhergehen.
Ursächlich für die FAP ist eine Keimbahnmutation, durch die das Tumorsuppressorgen APC inaktiviert wird. Weiterhin werden in seltenen Fällen neben der beschriebenen „Adenom- Karzinom-Sequenz“ auch genetische Mutationen verschiedener DNA-Reparatur-Gene (z.B.
MLH1, MSH2, MSH6) für die Entstehung eines KRK verantwortlich gemacht. Im hereditären non-polypösen Kolonkarzinom-Syndrom (HNPCC; Lynch-Syndrom), welches 5% der KRK ausmacht, konnten Differenzen der Sequenzlängen innerhalb kurzer, repetitiver DNA- Abschnitte (Mikrosatelliteninstabilität) nachgewiesen werden, die auf Grund defekter DNA- Reparatur-Proteine zu einer fehlerhaften DNA-Replikation führen und somit die Karzinogenese begünstigen.
3
Normalepithel
tubulär, geringgradige Dysplasie
tubulovillös, mittelgradige Dysplasie
villös, hochgradige Dysplasie
Karzinom HyperproliferiertesEpithel Adenom I Adenom II Adenom III
Mutation/
Verlust APC
Mutation/
Verlust p53 Mutation
KRAS
Mutation/
Verlust DCC veränderte DNA-
Methylierung
Inaktivierung von Reparaturgenen / Mikrosatelliteninstabilität
weitere genetische Alterationen
Abbildung 1: „Adenom-Karzinom-Sequenz“ (modifiziert nach Davies et al. 2005, S.202)
Die Abbildung stellt die Karzinogenese von KRK an Hand des Modells der „Adenom-Karzinom-Sequenz“ dar (Vogelstein et al. 1988). Innerhalb eines Zeitraums von 10-15 Jahren wandelt sich das Normalgewebe in sequenzieller Abfolge durch unterschiedliche Faktoren in ein polypöses Adenom bis hin zu einem invasiven Karzinom um. Verantwortlich für die maligne Transformation können Mutationen oder Inaktivierung von bestimmten Tumorsuppressorgenen und Proto-Onkogenen sowie eine Mikrosatelliteninstabilität (Inaktivierung von Reparaturgenen) sein.
1.2 Klassifikation kolorektaler Karzinome
Kolorektale Karzinome werden entsprechend ihrem Tumorsitz in Kolon- und Rektumkarzinome unterteilt. Nach den aktuellen UICC (Union internationale contre le cancer)- und TNM-Klassifikationen gelten Adenokarzinome als Rektumkarzinome, sofern der Abstand zwischen distalem Tumorrand und der Anokutanlinie (gemessen mit der tiefen, starren Rektoskopie) ≤ 16cm entfernt liegt (Becker und Liersch 2006; Liersch et al. 2005).
Demnach sind sämtliche Tumore oberhalb von 16cm (ab anokutan) als Kolonkarzinome definiert und werden standardmäßig primär operiert sowie mit einer postoperativen Chemotherapie (CTx) behandelt, sofern es sich um die UICC-Tumorstadien II - „high-risk“ (T4 Tumor, Tumorperforation, etc.) - und UICC-Tumorstadien III (mit LK-Metastasen) handelt (s.
Tabelle 2). Sämtliche untersuchten Patienten in dieser Arbeit wurden nach den in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschriebenen Klassifikationen eingeteilt. Die aktuellen TNM- und UICC- Klassifikationen sind zusätzlich im Anhang hinterlegt.
Einleitung
4 1.2.1 TNM-Klassifikation
Die TNM-Klassifikation stuft maligne Tumore nach Tumorinfiltration (T-Status), Lymphknotenstatus (N-Status) und dem Auftreten von Metastasen (M) ein (s. Tabelle 1).
An Hand des prätherapeutischen klinischen Stagings (Ergebnisse aus klinischem Untersuchungsbefund, rektaler Endosonographie, Röntgen-Thorax, aus einer möglichenfalls erfolgten chirurgischen Exploration, Zytologien und Biopsien) wird eine vorläufige klinische cTNM-Klassifikation ermittelt. Diese wird nach erfolgter Rektumresektion revidiert, sobald die pathologische Analyse des Rektumkarzinomresektates und der entnommenen lokoregionären Lymphknoten (LK) erfolgt ist (pTNM-Klassifikation). Die histopathologische Aufbereitung des nativen Resektates erfolgt nach standardisierten etablierten Richtlinien und Klassifikationen (s. Kapitel 2.6). Für die zuverlässige Ermittlung der lymphogenen Metastasierung wird die histopathologische Beurteilung von ≥ 12 lokoregionären LK gefordert (Schmiegel et al. 2010).
Tabelle 1: TNM-Klassifikation (modifiziert nach Sobin 2003, S. 19-22)
T-Status
Tis Carcinoma in situ
T1 Infiltration der Submukosa T2 Infiltration der Muscularis propria
T3 Infiltration der Subserosa und des perirektalen Gewebes T4 Penetration angrenzender Organe oder in viszerales
Peritoneum
N-Status
N1 Metastasen in 1-3 regionären LK
N2 Metastasen in 4 oder mehr regionären LK
Metastasen
M1 Fernmetastasen
1.2.2 Stadieneinteilung nach UICC
Die Stadieneinteilung nach UICC ist im Gegensatz zu der TNM-Klassifikation eine Einteilung zur Prognoseabschätzung und dient zumeist einer praktikableren Therapiestratifizierung (s.
Tabelle 2).
5
Das klinische präoperative Staging (s. Kapitel 1.2.1) ermöglicht dabei die prätherapeutische cUICC-Klassifikation und daran orientiert finden die multimodalen Therapiekonzepte beim Rektumkarzinom statt.
Tabelle 2: Stadieneinteilung nach UICC (modifiziert nach Sobin 2003; S. 19-22)
UICC T-Status N-Status Metastasen
Stadium 0 Tis N0 M0
Stadium I T1, T2 N0 M0
Stadium II A T3 N0 M0
Stadium II B T4 N0 M0
Stadium III Jedes T N1, N2 M0 Stadium III A T1, T2 N1 M0 Stadium III B T3, T4 N1 M0 Stadium III C Jedes T N2 M0 Stadium IV Jedes T Jedes N M1
1.3 Therapiealgorithmen für die Therapie des Rektumkarzinoms
Die Entscheidung über die onkologisch adäquate Behandlung von Patienten mit einem Rektumkarzinom erfolgt in Abhängigkeit von der prätherapeutischen Diagnostik (Stagingprozeduren) und Tumorstadien-adaptiert. Die differenzierten Behandlungskonzepte erfordern eine fachübergreifende Kooperation zwischen Gastroenterologie, Radiologie, Strahlentherapie/ Radioonkologie, Allgemein- und Viszeralchirurgie, Pathologie und internistischer Onkologie.
Lokal begrenzte Rektumkarzinome (UICC-I-Stadium) mit "low-grade" Differenzierung (cT1, Differenzierungsgrad G1-G2) werden primär lokalen Resektionsverfahren (transanaler mikrochirurgischer Vollwandexzision oder transanaler Exzision) zugeführt (Gaedcke und Liersch et al. 2011). Schlecht differenzierte "high-grade" -Karzinome (cT1, G3-4) werden auf Grund einer zu erwartenden LK-Metastasierungsrate (bis zu 10%) nicht lokal, sondern radikal offen-chirurgisch unter Mitnahme des mesorektalen Lymphabstromgebiets reseziert (entweder mittels einer partiellen mesorektalen Exzision (PME) oder einer totalen mesorektalen Exzision (TME)). Ebenfalls werden cT2-Rektumkarzinome ohne Nachweis von LK-Metastasen im Staging (UICC-I-Stadium) primär transabdominell per TME operiert.
Einleitung
6
Bei klinisch lokal fortgeschrittenen cUICC-II/-III-Rektumkarzinomen besteht in Abhängigkeit der Tumorlokalisation die Indikation zur multimodalen Therapie. Diese setzt sich aus folgenden Therapiekomponenten zusammen:
- Präoperative konventionelle fraktionierte RT (50.4 Gy über 5 Wochen in 28 Einzelfraktionen à 1.8 Gy pro Tag) kombiniert mit 5-Fluorouracil (5-FU) -basierter CTx gefolgt von einem 4-6-wöchigen therapiefreien Intervall und anschließender radikaler Rektumresektion inklusive TME und einer postoperativen CTx (Liersch et al.
2005).
- Tumore, die im oberen Rektumdrittel lokalisiert sind, werden primär operiert (im Rahmen der GAST-05-Studie randomisiert per PME oder TME) und erhalten eine adjuvante CTx mit 5-FU.
1.3.1 Neoadjuvante Therapie des lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinoms
Die multimodale Therapie des lokal fortgeschrittenen Rekumkarzinoms hat in den letzten 10 Jahren erhebliche Fortschritte erzielt. Auf Grund der exzellenten Ergebnisse der CAO/ARO/AIO-94-Studie (s. Abbildung 2; Fördernummer der Krebshilfe: 70-587) ist die neoadjuvante Radiochemotherapie (RCT) bei Tumoren, die im mittleren und unteren Rektumdrittel lokalisiert sind, der Gold-Standard (Soreide 1997; Schmiegel et al. 2010). Im Unterschied dazu werden cUICC-II/III-Rektumkarzinome mit Lokalisation im oberen Rektumdrittel im Rahmen der prospektiven multizentrischen GAST-05-Studie (internationale Studiennummer: ISRCTN35198481) primär operiert und erhalten nach Randomisation entweder eine TME oder PME. Die postoperative Behandlung wird mit einer adjuvanten CTx (5-FU mono oder 5-FU in Kombination mit Oxaliplatin als modifiziertes FOLFOX-Schema) komplettiert (Gaedcke und Liersch et al. 2011; Liersch et al. 2005; Schmiegel et al. 2010).
Innerhalb der CAO/ARO/AIO-94-Studie war es möglich, durch die Behandlung mit dem neoadjuvanten RCT-Regime einen Downsizing (Regression der Tumorinfiltration; T-Status Downsizing)- und Downstaging-Effekt zu erzielen. Zudem erhöht sich entgegen der initialen Einschätzung nach neoadjuvanter RCT die Wahrscheinlichkeit (bis zu 19%, Sauer et al. 2004) eines kontinenzerhaltenden Resektionsverfahrens (unter Sphinktererhalt) und kann somit zu einer Verbesserung der Lebensqualität des Patienten beitragen (Sauer et al. 2004; Francois et al. 1999).
7
Rektumresektion + TME RCT + 5-FU CTx 5-FU
Rektumresektion + TME Rektumresektion + TME
RCT + 5-FU + Oxaliplatin
RCT + 5-FU CTx 5-FU
CTx 5-FU + FOL + Oxaliplatin
CAO/ARO/AIO-94-Studie
Lokalrezidive Nach 5 Jahren:
6% vs. 13% p=0.006 Sauer et al. 2004
Nach 10 Jahren:
7.1% vs. 10.1% p=0.048 Sauer und Liersch et al. 2012 CAO/ARO/AIO-04-Studie
pCR
13% vs. 17% p=0.04 Rödel und Liersch et al. 2012
Abbildung 2: Langzeitergebnisse der CAO/ARO/AIO-94-Studie und erste Ergebnisse der CAO/ARO/AIO-04-Studie
Dargestellt sind die Ergebnisse der CAO/ARO/AIO-94- und der CAO/ARO/AIO-04-Studie (Sauer et al. 2004;
Sauer und Liersch et al. 2012; Rödel und Liersch et al. 2012). Der Prüfarm der CAO/ARO/AIO-94-Studie mit neoadjuvanter RCT, anschließender OP mit TME und adjuvanter CTx (5-FU) wird in der Nachfolgestudie zum Kontrollarm. Die CAO/ARO/AIO-04-Studie umfasst ein intensiviertes Behandlungsschema mit neoadjuvanter RT in Kombination mit einer CTx bestehend aus 5-FU und Oxaliplatin, nachfolgender Rektumresektion und TME und einem adjuvanten modifizierten FOLFOX-Schema.
Die Studie zeigte eine Verbesserung der 5-Jahres-Lokalrezidivrate durch die präoperative RCT von 13% in der Kontrollgruppe (primäre Operation mit adjuvanter RCT) auf 6% (Sauer et al. 2004). Ein signifikanter Effekt bezüglich der Korrelation des krankheitsfreien Überlebens (Disease Free Survival, DFS) oder des Gesamtüberlebens (Overall Survival, OS) mit den unterschiedlichen Behandlungsmethoden konnte nach 5 Jahren sowie entsprechend in den aktuell vorgestellten Resultaten nach 10 Jahren nicht beobachtet werden (Sauer und Liersch et al. 2012). Durch die Kombination der RT mit einer intensivierten CTx bestehend aus 5-FU und Oxaliplatin konnte in der CAO/ARO/AIO-04-Studie (Nachfolge-Studie der CAO/ARO/AIO- 94-Studie; Studiennummer: NCT 00349076) eine signifikant bessere, histologisch bestätigte Rate an pathologischer Komplettremission (pCR; (y)pT0(y)pM0-Status) im Vergleich zur RCT mit alleiniger Applikation von 5-FU gezeigt werden (17% pCR-Rate im experimentellen Arm mit RCT 5-FU und Oxaliplatin versus 13% pCR-Rate im Kontrollarm RCT mit 5-FU mono;
p=0.038; Rödel und Liersch et al. 2012). Jedoch bleibt es abzuwarten, ob sich dieser frühe Surrogatparameter pCR auch auf den Langzeiterfolg gemessen an DFS oder OS auswirken wird.
Einleitung
8
1.3.2 Operative Strategien der Rektumresektion
Die onkologische Rektumchirurgie ist von entscheidender Bedeutung für die Prognose des Patienten. Dabei hat neben der angestrebten R0-Resektion auch die partielle oder totale Entfernung des Mesorektums (retrorektaler Fettkörper und das drainierende Lymphknotenabflussgebiet) einen hohen Stellenwert im Hinblick auf die Reduktion von Lokalrezidiven (Arbman et al. 1996; Wibe et al. 2002; Porter 1999; Hermanek et al. 2003).
Grundlage für die onkologisch adäquate Rektumresektion stellen dabei Resektionsprinzipien wie die "No-Touch-Technik" während der Präparation sowie die "En-bloc-Resektion" von tumorinfiltrierten Organen dar (Hermanek 1992; Schmiegel et al. 2010).
Während bei Tumoren, die im unteren und mittleren Rektumdrittel lokalisiert sind, eine tiefe anteriore Rektumresektion (TARR) mit einer TME durchgeführt wird, wird bei einem Tumorsitz im oberen Rektumdrittel eine anteriore Rektumresektion (ARR) mit einer PME oder eine TARR mit TME durchgeführt. In der GAST-05-Studie wird derzeit prospektiv geprüft, ob eine PME der TME onkologisch gleichwertig ist.
Eine abdomino-perineale Rektumexstirpation (APE; Entfernung des gesamten Sphinkterapparates) ist bei einem Tumorsitz < 2cm zur Linea dentata oder bei Infiltration der Sphinktermuskulatur erforderlich und umfasst immer eine TME (Becker und Liersch 2006).
Die Qualität der TME wird perioperativ mittels Darstellung und Kanülierung der A.
mesenterica inferior und Injektion von ca. 20 ml Methylenblau durch einen gegebenenfalls vorhandenen Farbstoffaustritt beurteilt und unabhängig durch den Pathologen gemäß der Klassifikation des britischen Medical Research Council (M.E.R.C.U.R.Y 2002; Hermanek et al.
2003) befundet. Abschließend erfolgt die histopathologische Aufarbeitung des Rektumkarzinomresektates mit Erfassung histopathologischer Parameter (unter anderem Residual-Status, zirkumferenzieller mesorektaler Resektionsrand (CRM), Anzahl der karzinomatös befallenen LK), welche die Basis einer effizienten adjuvanten Therapie darstellt.
9 1.3.3 Adjuvante Systemtherapie
Nach der aktuellen S3-Leitlinie ist eine adjuvante RCT (mit Applikation von 5-FU) für Patienten mit Tumorsitz in den unteren beiden Rektumdritteln dann indiziert, wenn keine neoadjuvante RCT durchgeführt wurde oder aber wenn eine R1-Resektion vorliegt (Schmiegel et al. 2010). Eine kombinierte RCT senkt die Lokalrezidivrate und verbessert das Gesamtüberleben im Vergleich zu einer alleinigen Operation (Krook et al. 1991; Tveit et al.
1997; Wolmark et al. 2000). Während Patienten mit Tumorlokalisation in den unteren beiden Rektumdritteln nach erfolgter RCT und Rektumresektion eine adjvuante CTx mit 5-FU oder CTx nach dem FOLFOX-Schema (Applikation von 5-FU, Oxaliplatin und Folinsäure in 12 Zyklen) erhalten, werden Patienten mit Tumorsitz im oberen Drittel nach primärer OP standardmäßig adjuvant mit dem FOLFOX-Regime behandelt.
1.4 Konzepte zur Individualisierung der onkologischen Therapie beim lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinom (UICC II/III)
Patienten mit einem primären cUICC-II/III-Rektumkarzinom sprechen sehr heterogen auf die neoadjuvante RCT an. Dabei reicht das Ansprechen auf die RCT von einer histopathologisch kompletten Remission ("Komplettresponder" in 10-15%) über ein intermediäres Ansprechen („Intermediäre Responder“) bis hin zur Therapieresistenz ("Nonresponder") und zu einer damit einhergehenden verkürzten Langzeitprognose (Liersch et al. 2010; Gaedcke und Liersch et al. 2011).
Die Unterteilung in Responder, Intermediär-Responder und Nonresponder ist notwendig, um eine individualisierte, Rezidivrisiko-adaptierte Therapie für jeden Patienten zu ermöglichen.
Patienten, die nach der neoadjuvanten Standard-RCT eine komplette Remission erreichen, dürfen nicht mit den etablierten adjuvanten Systemtherapien übertherapiert werden und in ihrer Lebensqualität auf Grund der therapieassoziierten Toxizität unnötig eingeschränkt werden (Bujko et al. 2010). Intermediär-Responder und Nonresponder dagegen müssen alternativen Therapieregimen zugeführt werden. Beispielsweise durch die Intensivierung der neoadjuvanten Systemtherapie mit einer Kombination von 5-FU und Oxaliplatin wird, wie die ersten Resultate der CAO/ARO/AIO-04-Studie zeigten, eine höhere pCR-Rate erzielt (Rödel und Liersch et al. 2012).
Einleitung
10
Weiterhin ist die Identifikation von Responsprädiktoren entscheidend, um jeden Patienten mit seinem genetischen Tumorprofil gemäß seinem individuellen Risiko für Resistenz, Therapie-assoziierte Toxizität und Tumorrezidive effektiv zu behandeln. Genexpressions- und Mutationsanalysen an Mitgliedern verschiedener Signaltransduktionswege (MAPK- Signalweg, KRAS) sowie an Proteinen, die im 5-FU-Metabolismus (Thymidylatsynthetase) integriert sind, sind Gegenstand aktueller translationaler Forschung und werden derzeit in prospektiv randomisierten Studien validiert (Kuremsky et al. 2009; Ghadimi et al. 2005;
Gaedcke et al. 2010a; Conradi et al. 2011).
1.5 Prädiktive und prognostische Marker in der Therapie des Rektumkarzinoms
Prädiktive Biomarker dienen der Vorhersage des Ansprechens auf therapeutische Interventionen wie beispielsweise auf die neoadjuvante RCT in lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinomen. Demgegenüber werden mittels prognostischer Biomarker statistische Wahrscheinlichkeiten für das Gesamtüberleben (DFS (lokoregionäre Rezidivraten, Fernmetastasierung) bzw. CSS (Cancer Specific Survival) und OS) beschrieben.
Von prognostischer Relevanz ist die histopathologische, quantitative und qualitative Lymphknotenaufarbeitung und der daraus erhobene LK-Status. Ebenso ist der Residualstatus (Resektionsstatus, R0, R1, R2) ein prognostischer Marker. Ein positiver Nodalstatus oder eine R1- oder R2-Resektion ist mit einem erhöhten Lokalrezidivrisiko sowie reduziertem Gesamtüberleben assoziiert; folglich müssen bei diesen Situationen weitere Therapien (postoperative RCT) angeschlossen werden (Schmiegel et al. 2010; Liersch et al. 2005).
Ein Beispiel für einen prädiktiven Biomarker für eine Anti-EGFR-Therapie (EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor), der bereits standardmäßig in der klinischen Routine bei Patienten mit metastasierten KRK etabliert ist, ist der KRAS-Status: Die prätherapeutische Testung von Karzinomgewebe auf eine KRAS-Mutation stellt die Grundvoraussetzung für die Einleitung einer Anti-EGFR-Therapie in Kombination mit CTx in der Therapie metastasierter KRK dar.
11
KRAS ist Mitglied des MAP-Kinase-Signalweges, welcher in der Regulation der Zelldifferenzierung, des Zellwachstums und von Apoptose beteiligt ist (Fang und Richardson 2005). In 35% der KRK kann eine KRAS-Mutation nachgewiesen werden und stellt eine Kontraindikation für die Applikation des Biologicals Cetuximab dar (Gaedcke et al. 2010b).
Die KRAS-Mutation korreliert dabei weder mit dem Ansprechen auf eine neoadjuvante RCT noch mit dem Langzeitüberleben; folglich spielt es als Prognosemarker im KRK keine Rolle. In aktuellen Untersuchungen konnte in Zelllinien und in einem Xenopatients-Modell nachgewiesen werden, dass neben der KRAS-Mutation auch eine HER-2-Amplifikation in KRK mit einer Cetuximab-Resistenz assoziiert ist (Yonesaka et al. 2011; Bertotti et al. 2011). Somit ist die Analyse der HER-2-Expression und -Amplifikation im KRK ein interessanter Ansatz, um multimodale personalisierte Therapiestrategien zu entwickeln.
1.6 Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2/neu)
HER-2 oder HER-2/neu, ebenso bekannt unter dem Namen c-erb-B2 (cellular avian erythroblastosis homologue B2), CD 340 (Cluster of differentiation 340) oder P185, gehört zu der Familie der epidermalen Wachstumsfaktoren (EGFR 1-4) und wird durch das c-erb-B2- Gen codiert. Das HER-2-Gen ist ein Proto-Onkogen und auf dem menschlichen Chromosom 17 (Chr 17; 17q21-q22) lokalisiert (Coussens et al. 1985).
1.6.1 Struktur und Funktion
HER-2 ist ein membranständiger Rezeptor, bestehend aus einer extrazellulären Liganden- bindenden Domäne, einem lipophilen Transmembransegment und einer intrazellulären Region. Die intrazelluläre Domäne besitzt Tyrosinkinase-Aktivität, die Phosphatgruppen an Tyrosinreste der intrazellulären Effektormoleküle koppelt. Die Aktivierung der EGFR- Rezeptoren 1-4 erfolgt durch extrazelluläre Liganden-induzierte Homo- oder Heterodimerisierung. Mit Ausnahme von HER-2 konnten verschiedene Liganden für die Mitglieder der EGFR-Familie identifiziert werden (Olayioye et al. 2000). HER-2 dimerisiert präferentiell mit dem HER-3-Rezeptor und ist stärker enzymatisch wirksam (Alimandi et al.
1995). Durch die Dimerisierung der Rezeptoren wird die intrinsische Tyrosinkinase-Aktivität stimuliert, sodass spezifische Substrate mit Tyrosinresten autophosphoryliert werden.
Einleitung
12
Die phosphorylierten Produkte binden an spezifische Signalmoleküle und setzen eine Signalkaskade in Gang. Weitere Signalmoleküle werden rekrutiert und in das Zellinnere geleitet (Signaltransduktion, s. Abbildung 3).
Schließlich wird durch die Aktivierung von HER-2 und die damit verbundene Signaltransduktion das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung stimuliert und der programmierte Zelltod (Apoptose) verhindert (Olayioye et al. 2000).
Abbildung 3: Signaltransduktionswege von EGFR (Banck und Grothey 2009, S. 7494)
Die Abbildung zeigt die Signalkaskade der epidermalen Wachstumsfaktoren-Rezeptoren (EGFR 1-4). EGFR (z.B.
HER-2) dimerisiert mit einem weiteren EGFR (präferentiell mit HER-3). Durch Liganden, die extrazellulär an die Rezeptoren binden, erfolgt die Aktivierung der EGFR. Die aktivierte intrinsische Tyrosinkinase phosphoryliert unterschiedliche Substrate (z.B. Phosphoinositolkinasen (PI3K) oder Ras) und setzt eine Signalkaskade in Gang.
Weitere Signalmoleküle (AKT, Raf, MEK, MAPK) werden rekrutiert und ins Zellinnere geleitet, sodass schließlich das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung stimuliert werden.
Anti-EGFR-Antikörper (wie z.B. Cetuximab, Panitumumab) können diese Signaltransduktion inhibieren, indem sie extrazellulär an EGFR binden.
13 1.6.2 Tumorbiologische Bedeutung von HER-2
Eine dauerhafte HER-2-Rezeptor-Aktivierung oder eine Überexpression von HER-2- Rezeptoren resultieren in einer Dysregulation der HER-2-induzierten intrazellulären Signalkaskade. Die HER-2-Genamplifikation (Vervielfältigung des HER-2-Gens in mehr als 2 Genkopien) ist der am häufigsten beobachtete Mechanismus, welcher zu einer erhöhten HER-2-Proteinexpression an der Zellmembran führt (Hynes und Stern 1994). In einer normalen Zelle liegt das HER-2-Gen in 2 Genkopien im Zellkern vor und codiert das HER-2- Protein, welches sich nach der Translation in der Zellmembran anlagert.
Die Überexpression des HER-2-Rezeptors (die Vervielfältigung des HER-2-Rezeptors um das 10- bis 100-fache der Norm) stört das kontrollierte Zellwachstum, verhindert die Apoptose und kann unter Umständen zu einer unkontrollierten Zellproliferation und Formation von aggressiven Tumorzellen führen (Hung et al. 1986).
HER-2-Genamplifikation und HER-2-Proteinüberexpression wurden zunächst beim Mammakarzinom nachgewiesen. In 20-30% der Mammakarzinome war ein positiver HER-2- Status nachweisbar, assoziiert mit einem aggressiven Tumorverhalten, erhöhten Rezidivraten, früherer Metastasenbildung und reduzierter Überlebenszeit im Vergleich zu Patienten ohne HER-2-Überexpression und –Amplifikation (Slamon et al. 1987, 1989; Ross und Fletcher 1998; McCann et al. 1991).
Zudem wurden auch bei Ovarial-, Lungen-, Endometrium-, Cervix Uteri-, Blasen-, Kolon- sowie Magenkarzinomen HER-2-Überexpressionen und -Amplifikationen unterschiedlicher Ausprägung nachgewiesen (Berchuck et al. 1990; Schneider et al. 1989; Weiner et al. 1990;
Cirisano und Karlan 1996; Eltze et al. 2005;Schuell et al. 2006; Yano et al. 2006). Der HER-2- Status beim Magenkarzinom und beim Adenokarzinom des gastroösophagealen Übergangs (AEG II/III) korreliert mit dem Gesamtüberleben der Patienten ähnlich den Ergebnissen beim Mammakarzinom. Die HER-2-Positivitätsrate liegt bei Magenkarzinomen bei 15-25%
(Hofmann et al. 2008; Park et al. 2006; Zhang et al. 2009). Ältere Studien zum Magenkarzinom zeigen auf, dass eine HER-2-Expression und -Genamplifikation mit schlechterer Prognose, aggressiverem Krankheitsverlauf und geringerem Gesamtüberleben einhergehen (Nakajima et al. 1999; Allgayer et al. 2000; Garcia et al. 2003; Tanner M et al.
2005, Park et al. 2006).
Einleitung
14
Subgruppenanalysen der multizentrischen ToGA-Studie ("Trastuzumab for HER2-positive metastatic Gastric cancer“, s. Kapitel 1.6.3), in der nicht mit Trastuzumab-behandelten Kohorte, zeigten für HER-2-positive Patienten ein verbessertes medianes Gesamtüberleben (11.8 Monate versus 8.7 Monate in der HER-2-negativen Subgruppe; n=577; Bang et al.
2010).
1.6.3 Klinisch-therapeutische Relevanz des HER-2-Status bei HER-2-positiven Karzinomen
HER-2 ist als prognostischer Biomarker vor allem beim Mamma- und Magenkarzinom bekannt und stellt einen potentiellen Angriffspunkt einer spezifischen Tumortherapie dar (targeted therapy; Slamon et al. 1989; Gravalos und Jimeno 2008). Zudem scheint HER-2 sich beim Mammakarzinom auch als prädiktiver Biomarker zu eignen, indem er eine erhöhte Sensitivität für bestimmte Therapeutika wie beispielsweise für Anthrazyklin-haltige CTx aufweist (Pritchard et al. 2006; Villman et al. 2006).
Klinisch-therapeutische Relevanz in der Therapie bei HER-2-positiven Karzinomen weist der monoklonale Antikörper Trastuzumab (Herceptin®, Roche Pharma AG, Basel, Schweiz) auf.
Trastuzumab wurde 1998 von A. Ullrich und M. Shepard (Genentech, San Francisco, USA) entwickelt und 2000 für das metastasierte Mammakarzinom und 2006 für Brustkrebs im Frühstadium von der Food and Drug Administration (FDA, Rockville, USA) zugelassen. Der humanisierte Antikörper bindet selektiv an die extrazelluläre Domäne des HER-2-Rezeptors, induziert dadurch einen Zellzyklus-Arrest der Tumorzellen und hemmt die Signaltransduktion durch eine Downregulation des HER-2-Gens. Zudem rekrutiert Trastuzumab Immunzellen und hemmt die Angiogenese der Tumorzellen, sodass nachfolgend eine Regression des Tumors erreicht werden kann.
Eine multizentrische Phase-II-Studie zeigte, dass bei Patienten mit metastasiertem Mammakarzinom die additive Gabe von Trastuzumab zu einer Standard-CTx (Docetaxel) im Vergleich zur alleinigen CTx-Behandlung das OS signifikant um 8.5 Monate verbessert (Marty et al. 2005). Seit 2010 wurde die Zulassung von Trastuzumab auch für die Behandlung des HER-2-positiven metastasierten Adenokarzinoms des Magens und des gastroösophagealen Übergangs (AEG II/III) erweitert.
15
In der groß angelegten, kontrollierten und randomisierten ToGA-Studie wurden 584 Patienten mit metastasiertem Magenkarzinom entweder mit Trastuzumab und CTx oder mit alleiniger CTx (Capecitabin + Cisplatin oder 5-FU + Cisplatin) behandelt (Bang et al. 2010). Die Korrelation der Behandlung mit dem Gesamtüberleben ergab, dass Trastuzumab die mediane Überlebenszeit um 2.7 Monate (p=0.0046) verbesserte. Es profitierten insbesondere jene Patienten von der Therapie mit Trastuzumab, die hohe HER-2-Level aufwiesen (medianes Überleben der Subgruppe CTx + Trastuzumab von 16.0 Monaten versus 11.8 Monaten bei Behandlung mit CTx; Van Cutsem et al. 2009; Bang et al. 2010).
Zusammenfassend ist die Bestimmung des HER-2-Status somit von größter Bedeutung für die optimale Gabe von Anti-HER-2-Therapien wie Trastuzumab und hat sich bei der Behandlung des Mammakarzinoms neben der operativen Versorgung, Strahlentherapie, CTx und Hormontherapie in der klinischen Routine etabliert.
Die Detektion des HER-2-Status beim metastasierten Magenkarzinom ist im Vergleich zum Mammakarzinom noch am Anfang und wird erst seit kurzem in größeren kontrollierten Studien geprüft (Bang et al. 2010).
1.6.4 Detektionsmethoden des HER-2-Status
Der HER-2-Status wird durch die Expression des HER-2-Proteins in der Zellmembran und durch die Amplifikationsrate des HER-2-Gens im Zellkern bestimmt. Während die Detektion der Expression des HER-2-Rezeptors mittels immunhistochemischer (IHC) Analysen erfolgt, wird die HER-2-Genamplifikation mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) bestimmt.
Bei den IHC-Analysen werden die zu untersuchenden Tumorproben nach ihren Färbeintensitäten in die Grade 0 (keine Färbung), 1+ (kaum sichtbare Färbung), 2+
(mittelgradig schwache Färbung) und 3+ (starke Färbung) unterteilt. Bei der ISH werden das HER-2-Gen und das Chr 17, auf welchem das HER-2-Gen lokalisiert ist, unter dem Mikroskop als Signalpunkte dargestellt. Mit Hilfe des Verhältnisses der ausgewerteten Anzahl der Chr- 17-Signale und der Anzahl der HER-2-Gen-Signale wird eine Ratio ermittelt und der HER-2- Status als 'amplifiziert' (Ratio ≥ 2.0) oder 'nicht amplifiziert' (Ratio < 2.0) diagnostiziert (Rüschoff et al. 2010).
Einleitung
16
1.7 Zielsetzung und Fragestellung
Die vorliegende Arbeit untersucht erstmals an einem großen Patientenkollektiv von Rektumkarzinom-Patienten die Expression des Transmembranrezeptors HER-2 und die Amplifikation des HER-2-Gens. Dabei wurde der HER-2-Status bei Patienten im cUICC-II/-III- Rektumkarzinom unter multimodaler Therapie (s. Abbildung 2 und Kapitel 1.3) erfasst.
Erstmalig kam in der Methodik der HER-2-Scoring-Algorithmus zur Anwendung, der in der ToGA-Studie beim Magenkarzinom verwendet wurde und sich mittlerweile in der klinischen Routine etabliert hat. Weiterhin wurden sämtliche klinischen Daten (unter anderem prätherapeutische, operative und histopathologische Parameter) und Angaben der Follow- Up-Untersuchungen (mit einem medianen Follow-Up von 46.5 Monaten) von allen Patienten (N=264) erfasst.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist zum einen die Bestimmung der Expressionshäufigkeit und Amplifikation von HER-2 und zum anderen die Korrelation des detektierten HER-2-Status mit kliniko-pathologischen Parametern und dem Gesamtüberleben. Sollte sich eine HER-2- Überexpression in einem relevanten Anteil der untersuchten prätherapeutischen Biopsien und Rektumkarzinomresektate zeigen, könnte HER-2 möglicherweise ein interessanter Ansatzpunkt für eine targeted therapy in der Behandlung des Rektumkarzinoms sein.
Folgende Fragen sollten beantwortet werden:
1. Wie hoch ist die HER-2-Expression und -Genamplifikation in Biopsien?
2. Wie hoch ist die HER-2-Expression und -Genamplifikation in Rektumkarzinomresektaten?
3. Ändert sich der HER-2-Status durch die präoperative RCT?
4. Kann HER-2 ein relevanter prädiktiver Biomarker für eine Multimodaltherapie im lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinom sein?
5. Hat HER-2 prognostisches Potenzial bezüglich der Korrelation des HER-2-Status mit dem krankheitsfreien oder krankheitsspezifischen Gesamtüberleben?
6. Können die vorliegenden Ergebnisse klinische Auswirkungen auf die Implementierung neuer multimodaler Therapieregime für Patienten mit einem Rektumkarzinom haben?
17
2 Patientenkollektiv, Materialien und Methoden
2.1 Untersuchtes Patientenkollektiv
Diese monozentrische Untersuchung umfasst die Analyse von prospektiv ausgewertetem Biomaterial und klinischen Daten von insgesamt 264 Patienten (mittleres Patientenalter: 63 Jahre ± 10 Jahre; 192 Männer (73%) und 72 Frauen (27%)) mit einem primär lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinom. Alle Patienten wurden standardisiert oder analog nach randomisierten Phase-II/-III-Studien der 'German Rectal Cancer Study Group' (GRCSG;
CAO/ARO/AIO-94-Studie, XelOX-Studie, CAO/ARO/AIO-04-Studie) behandelt. Die vorliegende Studie wurde im Rahmen des Teilprojektes 5 der Klinischen Forschergruppe 179 (KFO 179-2; www.kfo179.de) durchgeführt und die Analysen entsprechend dem Antragsvotum im Juni 2006 von der Ethikkommission der Universitätsmedizin Göttingen genehmigt. Sämtliche Patienten (N=264) wurden im Zeitraum von Juli 1994 bis Dezember 2009 in der Abteilung für Allgemein- und Viszeralchirurgie in der Universitätsmedizin Göttingen therapiert.
Von allen Patienten lag eine schriftliche Einverständniserklärung mit Durchführung der multimodalen Therapie, Biomarkeranalyse und zur Erhebung von Patienten-bezogenen Follow-Up-Daten vor. Daneben beinhalteten Einschlusskriterien für diese Studie neben der informierten Einwilligung das klinisch erfasste (prätherapeutisches Tumorstaging, s. Kapitel 2.2) oder histologisch gesicherte Adenokarzinom des Rektums. Per definitionem lag ein Rektumkarzinom vor, wenn der makroskopisch erkennbare aborale Tumorrand (gemessen mittels starrer Rektoskopie) 16cm oder weniger von der Anokutanlinie entfernt war (Fielding et al. 1991). Die Patienten- und Operationsdaten sowie die Nachsorge- und Untersuchungsbefunde wurden prospektiv in einer Datenbank erfasst und dienten als Grundlage für die Auswertung.
Patientenkollektiv, Materialien und Methoden
18
2.2 Prätherapeutisches Tumorstaging
Eine umfassende präoperative interdisziplinäre Diagnostik wurde bei allen Patienten durchgeführt und bestimmte die patientenorientierte Entscheidung zwischen einer primär operativen Versorgung, der Einleitung einer neoadjuvanten RCT mit Standard 5-FU oder einer neoadjuvanten, intensivierten RCT mit 5-FU in Kombination mit Oxaliplatin.
Die Stagingprozeduren umfassten eine vollständige Anamnese, die digital-rektale Untersuchung, die starre Rektoskopie, die rektale Endosonographie sowie bei endosonographisch forgeschrittenen Rektumkarzinomen (uT2) die Kontrastmittel-gestützte Computertomographie (CT) des Abdomens/ Beckens (Gaedcke und Liersch et al. 2011). Bei Verdacht auf einen möglichen Tumorkontakt zur mesorektalen Hüllfaszie wurde eine Magnetresonanztomographie (MRT) des Pelvis hinzugezogen (Liersch et al. 2005). Die prätherapeutische histopathologische Diagnostik aus den bei der Rektoskopie entnommenen Biopsaten ließ eine sichere Karzinomdiagnose, die Bestimmung der Tumortypklassifikation (Adenokarzinom, Siegelringkarzinom, Plattenepithelkarzinom) und die Bestimmung des Differenzierungsgrads (Grading) der Karzinomzellen zu. Für die vollständige Klassifikation nach UICC und TNM erfolgte die weitere Umfelddiagnostik, welche eine Abdomensonographie, Röntgen-Thorax, Labordiagnostik und CEA- Tumormarkerbestimmung (Carcino-Embryonales-Antigen) umfasste.
2.3 Studiendesign
Prätherapeutische, kliniko-pathologische Daten sowie der klinische Langzeitverlauf wurden von sämtlichen Patienten (N=264) erfasst und standen für die Auswertung zur Verfügung (s.
Tabelle 4). Nach den Staging-Untersuchungen erhielten 145 Patienten (55%) eine neoadjuvante Radiotherapie (RT) mit 5-FU als Standardtherapie und 72 Patienten (27%) eine intensivierte neoadjuvante RCT mit 5-FU und Oxaliplatin (s. Tabelle 3 und Abbildung 4).
Weitere 47 Patienten (18%) wurden primär operiert und erhielten eine adjuvante RCT mit 5-FU (CAO/ARO/AIO-94-Studie; n=22) oder - im Falle der Tumorlokalisation im oberen Drittel (12-16 cm) - eine adjuvante CTx mit 5-FU und Oxaliplatin (GAST-05-Studie; n=25). Diese primär operierten Patienten dienten als Kontrollkollektiv für die HER-2-Expressionsanalysen.
19 Tabelle 3: Unterteilung der Patientenkollektive
Patientenkollektiv A B C
Anzahl n=47 n=145 n=72
präoperative Therapie
primäre Operation neoadj. RT und CTx mit 5-FU
(intensivierte) neoadj. RT und CTx mit 5-FU und Ox adjuvante Therapie
RT und CTx mit 5-FU (n=22)
CTx mit 5-FU und Ox (n=25)
CTx mit 5-FU CTx mit 5-FU und Ox
Studie CAO/ARO/AIO-94
(Arm A)
GAST-05 CAO/ARO/AIO-94 (Prüfarm)
CAO/ARO/AIO-04 (Prüfarm)
Abkürzungen:
neoadj: neoadjuvante; RT: Radiotherapie; CTx: Chemotherapie; 5-FU: 5-Fluorouracil; Ox: Oxaliplatin
Jede Rektumresektion umfasste die Entfernung des tumortragenden Darmabschnittes, zusammen mit den diesen Darmabschnitt drainierenden LK und mit Ausnahme der randomisierten Patienten der Gast-05-Studie (Arm B) eine standardisierte TME. Die multimodale Behandlung konnte nach 4-6 Wochen mit Applikation adjuvanter CTx (5-FU oder 5-FU und Oxaliplatin) komplettiert werden (Becker und Liersch 2006).
Patientenkollektiv, Materialien und Methoden
20
Staging: Anamnese, starre Rektoskopie mit Biopsie, rUS, Rö-Thorax, CT/MRT, CEA cUICC-II/-III-Stadium
n = 47 n = 145 n = 72
n = 217
Adjuvante CTx (5-FU)
Adjuvante CTx (5-FU + Ox )
Adjuvante CTx (5-FU)
Neoadjuvante RCT (5-FU)
Neoadjuvante RCT (5-FU + Ox)
HER-2 IHC - Färbung Biopsie
Area Cut-off > 5 Tumorzellen
Resektat Area Cut-off ≥ 10%
Tumorzellen
Korrelation mit Langzeitprognose:
Follow-Up-
Untersuchungen DFS/OS
OP– standardisierte TME
Adjuvante RCT (5-FU) Adjuvante
CTx (5-FU+Ox)
n = 25 n = 22
Abbildung 4: Studiendesign
Nach dem prätherapeutischen Staging wurden die Patienten entweder primär operiert oder neoadjuvant vorbehandelt (RCT mit 5-FU oder intensivierte RCT mit 5-FU und Ox). Nach standardisierter OP folgte die adjuvante Systemtherapie. Zum Zeitpunkt des Stagings wurden prätherapeutische Tumorbiopsien asserviert und aufgearbeitet; im Rahmen der TME erfolgte die chirurgische Qualitätskontrolle mit Aufbereitung des Resektates sowie die Auswertung. Die Resultate aus den IHC-Auswertungen wurden abschließend mit dem Gesamtüberleben (DFS, CSS) korreliert.
Abkürzungen:
rUS: rektale Endosonographie; CT: Computertomographie; MRT: Magnetresonanztomographie; CEA: Carcino- Embryonales-Antigen; RCT: Radiochemotherapie; 5-FU: 5-Fluorouracil; Ox: Oxaliplatin; TME: Totale mesorektale Exzision; CTx: Chemotherapie; IHC: Immunhistochemie; DFS: Disease Free Survival; OS: Overall Survival
21
2.4 Prätherapeutische Parameter
Die in Abbildung 4 dargestellten Subkollektive wurden nach Alter, Geschlecht, Tumorlokalisation, cT-Status, cN-Status und cUICC-Stadium miteinander verglichen. Dabei ließ sich kein signifikanter Unterschied der Kollektive hinsichtlich des Geschlechts (p=0.21) sowie des cT-Status (p=0.67) nachweisen.
Alle Patientenkollektive wiesen eine ähnliche Altersverteilung (35 – 85 Jahre) auf. Das durchschnittliche Alter (mittleres Patientenalter bei Erstdiagnose: 63 Jahre ± 10 Jahre) entspricht der normalen Altersverteilungskurve für Patienten mit primärem Rektumkarzinom (Robert Koch Institut 2012).
Das primär operierte Patientenkollektiv (n=47) war im Mittel um 5.5 Jahre älter als die nicht mit RCT behandelten Patienten (68 Jahre versus 62.4 Jahre und 62.6 Jahre bei den Kollektiven B und C). Entsprechend der Epidemiologie des Rektumkarzinoms waren in dieser Untersuchung weit häufiger (durchschnittlich 73%) männliche Patienten in dieser Studie zu finden (Robert Koch Institut 2012).
Weiterhin wurden Patienten mit lokal fortgeschrittenem Rektumkarzinom in den cUICC- Stadien II (n=82; 31%) und UICC III (n=177; 67%) erfasst. Die starre Rektoskopie ergab, dass 97 Tumore (37%) im unteren Rektumdrittel (0-6 cm), 118 (45%) im mittleren (6-12 cm) und 49 Tumore (19%) im oberen Rektumdrittel (12-16 cm) lokalisiert waren.
Eine signifikante Korrelation (p<0.001) zeigte sich bei dem Vergleich der Patientenkollektive mit der Tumorlokalisation. Bei 79% (n=37) der primär operierten Patienten befand sich der Tumor im oberen Rektumdrittel, zum Teil bedingt durch Patienten aus der GAST-05-Studie (s. Kapitel 2.3). Patienten mit Tumorlokalisation in den unteren beiden Rektumdritteln (94%
Kollektiv B; 96% Kollektiv C), die im Rahmen der CAO/AIO/ARO-94- und -04-Studien behandelt wurden, erhielten nach klinischer Vorgabe eine neoadjuvante RCT (s. Tabelle 3).
Hinsichtlich des LK-Status (cN-Status) ergab das präoperative Staging bei 51% der primär operierten Patienten einen Verdacht auf LK-Metastasen. Demnach lag in 49% ein cUICC-III- Stadium im prätherapeutischen Staging vor. In den mit neoadjuvanter RCT behandelten Kollektiven B und C lag der Anteil an cN+-Stadien (UICC-III-Stadium) bei 70% (p=0.01).
Patientenkollektiv, Materialien und Methoden
22
Tabelle 4: Patientenkohorten und prätherapeutische Charakteristika (N=264)
Therapieregime Keine
neoadjuvante RCT (Kollektiv A)
Neoadjuvante RCT mit Standard-5-FU
(Kollektiv B)
Neoadjuvante RCT mit 5-FU/Oxaliplatin
(Kollektiv C)
p-Wert*
Patientenanzahl n=47 % n=145 % n=72 %
Präoperative Parameter Alter (Jahre)
Mittelwert Min - Max
68.0 38 - 85
62.4 35-83
62.6 36-82
0.003
Geschlecht Männlich Weiblich
34 13
72 28
111 34
77 23
47 25
65 35
0.21
Tumorlokalisation ab ano (cm) 0-6 cm
>6-12 cm
>12-16 cm
3 7 37
6 15 79
64 72 9
44 50 6
30 39 3
42 54 4
<0.001
cT-Status 2 3 4
1 44
2
2 94
4
5 126
14
3 87 10
2 66
4
3 92
6
0.67
cN-Status Positiv Negativ
24 23
51 49
104 41
72 28
52 20
72 28
0.01
cUICC-Stadium II
III IV
23 23 1
49 49 2
41 102
2
28 70 1
18 52 2
25 72 3
0.05
* p-Wert Berechnung mit Chi-Quadrat-Test; für die Altersdifferenz wurde der Kruskal-Wallis-Rank-Test angewendet
23
2.5 Materialien
Insgesamt wurden 169 Gewebeproben aus prätherapeutischen Biopsien zum Zeitpunkt der Staging-Untersuchungen (s. Kapitel 2.2) und 225 Gewebeproben des resezierten Rektumkarzinoms immunhistochemisch analysiert (s. Abbildung 4). Von diesen in Paraffin eingebetteten und in Formalin fixierten Proben wurden 81 Gewebeschnitte der Biopsien und 175 Gewebeschnitte der Rektumkarzinomresektate mittels Dual-ISH gefärbt und ausgewertet.
Weiterhin konnten 130 der 169 immunhistochemisch gefärbten prätherapeutischen Biopsie- Präparate den korrespondierenden Resektat-Präparaten des jeweiligen Patienten zugeordnet werden. Dies ermöglichte einen direkten Vergleich des HER-2-Status aus der Biopsie mit dem HER-2-Status aus dem korrespondierenden Rektumkarzinomresektat.
Nach erfolgter präoperativer RCT wurde in 17 Rektumresektat-Präparaten eine komplette RCT-induzierte Tumorregression diagnostiziert. In weiteren 22 Fällen, welche exzellent auf die neoadjuvanten Therapie (TRG 3b) angesprochen hatten, waren in dem vorliegenden Resektat-Präparat zu wenige Karzinomzellen für weitere HER-2-Analysen vorhanden (s.
Abbildung 4).
2.6 Perioperative Qualitätssicherung, histopathologische Aufbereitung und Beurteilung des residuellen Tumorgewebes
Nach erfolgter Rektumresektion wurde das native Resektat gemäß etablierter Richtlinien beurteilt (Hermanek et al. 2003):
Dabei umfasste die Qualitätssicherung die Darstellung und Kanülierung der A. mesenterica inferior mit Injektion von ca. 20 ml Methylenblau zur Anfärbung des mesorektalen Weichgewebes und die Dokumentation des Farbaustritts mit Unterscheidung zwischen keinem Farbaustritt (komplette TME), punktförmigem (mikroskopisch unvollständige TME) und flächenhaftem Farbaustritt (makroskopisch unvollständige TME; Liersch et al. 2005).
Anschließend wurde das native Rektumresektat dem Pathologen übergeben, der zusätzlich die Qualität des Präparates entsprechend der Klassifikation des britischen Medical Research Council M.E.R.C.U.R.Y. (2002) beurteilte.
Patientenkollektiv, Materialien und Methoden
24
Die Aufarbeitung des Rektumresektates umfasste folgende Aspekte (Liersch et al. 2005):
1. Makroskopische Beurteilung und Befunderhebung:
- Ausmessen der Länge des Resektates und des maximalen longitudinalen sowie transversalen Durchmessers des Tumors
- Dokumentation der Wuchsform (polypoid-gestielt, -tailliert, -sessil, plattenartig, ulzerös, szirrhös)
- Dokumentation der Lage des Tumors zur peritonealen Umschlagsfalte, etwaigen Tumorperforationen und Läsionen (vor allem Polypen)
- Vermessung des Abstandes des Tumorrandes von der aboralen Resektionslinie (ohne Zug und ohne Ausspannen)
2. Eröffnen des Resektates oberhalb und unterhalb des Tumors ohne Durchschneidung des Karzinoms
3. Aufspannen des Resektates auf eine Korkplatte (ohne Zug) und anschließende Formalinfixierung des Präparates
4. Makroskopische und mikroskopische Untersuchung des CRM (Abstand des Tumorrandes zum Resektionsrand), sowie Bestimmung des oralen und aboralen Resektionrandes an Hand relevanter Präparatschnitte (lamellierende Querschnitte durch den Tumor und das umgebende mesorektale Gewebe)
5. Untersuchung und Präparation der Arterien und von mind. 12 regionären mesorektalen LK Folgende histopathologische Parameter waren für eine Prognoseabschätzung sowie für eine adäquate Therapieempfehlung (z.B. nachstehende adjuvante Systemtherapie) von Relevanz.
Sie wurden nach den TNM-/ UICC-Richtlinien sowie nach der S3-Leitlinie erhoben (Schmiegel et al. 2010):
- Lokalisation des Karzinoms
- Tumortyp nach WHO-Klassifikation und Tumorinvasionstiefe (pT-Status) - Anzahl und Status der untersuchten regionären mesorektalen LK (pN-Status) - Differenzierungsgrad des Tumors (Grading 0-4)
- Zirkumferenzieller, oraler und aboraler Resektionsrand
- Residualstatus (R-Klassifikation; wird in der vorliegenden Arbeit dem Resektionsstatus begrifflich gleichgesetzt)
25
2.7 Histopathologische Beurteilung nach neoadjuvanter Radiochemotherapie
Die neoadjuvante RCT ist auf Grund der exzellenten Studienergebnisse der CAO/ARO/AIO- 94-Studie (signifikante Senkung der Lokalrezidivrate; Sauer et al. 2004) zur prätherapeutischen Standardbehandlung beim lokal fortgeschrittenen Rekumkarzinom (UICC-Stadium-II und -III) geworden. Der histopathologisch am frühesten zu bestimmende Parameter für ein Ansprechen des Malignoms auf die RCT ist der Tumorregressionsgrad (TRG; sogenannter „early surrogat marker“; Dworak et al. 1997; Gavioli et al. 2000). Die Klassifikation der Tumorregression erfolgt in 5 Stufen (s. Tabelle 5; TRG 0-4).
Tabelle 5: Tumorregressionsgrad (Dworak et al. 1997, modifiziert nach Becker und Liersch 2006, S. 619)
TRG 0 Keine Regression
TRG 1 Minimale Regression; <25% der Tumormasse mit Zeichen radiogener Fibrose und Vaskulopathie
TRG 2 Moderate Regression bei 25-50% der Tumormasse; radiogene fibrotische Veränderung dominieren, leicht zu findende Tumorzellnester
TRG 3 Gute Regression bei >50% der Tumormasse; nur vereinzelte, mikroskopisch schwer zu entdeckende Tumorzellen in dominierend fibrotischem Gewebe und Schleimseen TRG 4 Komplette Regression; keine Tumorzellen, nur fibrotisches Gewebe
Für die weitere Beurteilung des Tumoransprechens nach neoadjuvanter RCT wird neben der Befundung des TRG auch das T-Level-Downsizing (Verringerung des T-Status um ≥ 1 Level) und das UICC-Downstaging (Verkleinerung des UICC-Stadiums um ≥ 1 Level) erfasst. Dazu wurde jeweils der im Staging ermittelte cT-Status und das cUICC-Stadium mit den postoperativen, histopathologischen Befunden (y)pT-Status und (y)pUICC-Stadium verglichen.
2.8 Immunhistochemische Analysen
Die immunhistochemische Gewebefärbung dient zur Identifizierung und Klassifizierung von Zellen, die bestimmte Antigene exprimieren. Bei diesem Verfahren bedient man sich der Eigenschaft, dass spezielle Antikörper spezifisch an Antigensequenzen (Epitope) binden.
