Aus dem Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Molekulare Grundlagen des defekten Transports eines Glykoproteins bei der Pathogenese
der Congenitalen Saccharase-Isomaltase Defizienz
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Valentina Ritz
aus Lugano (Schweiz)
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Hassan Y. Naim
1. Gutachter : Univ.-Prof. Dr. Hassan Y. Naim 2. Gutachter : Univ.-Prof. Dr. Georg Herrler
Tag der mündlichen Prüfung: 4.6.2002
Meinen Eltern
1. EINLEITUNG 1
1.1 EINLEITUNG 1
1.2 DER SEKRETORISCHE WEG FÜHRT DIE MEISTEN PROTEINE DURCH DAS ER 1
1.3 MOLEKULARE CHAPERONE 5
1.4 KORREKTE FALTUNG ALS VORAUSSETZUNG FÜR INTRAZELLULÄREN
PROTEINTRANSPORT 8
1.5 TRANSPORT IN POLAREN EPITHELZELLEN 10
1.6 DIE ROLLE DER PROTEINPROZESSIERUNG IN DER PATHOPHYSIOLOGIE VON GENETISCH
BEDINGTEN ERKRANKUNGEN 11
1.7 SACCHARASE-ISOMALTASE (SI), EIN GLYKOPROTEIN DER APIKALEN
BÜRSTENSAUMMEMBRAN DES DARMS 14
1.8 BIOSYNTHESE, REIFUNG UND STRUKTUR DER HUMANEN SACCHARASE-ISOMALTASE 15 1.9 ENZYMDEFIZIENZEN UND PHÄNOTYPEN DER CONGENITALEN
SACCHARASE-ISOMALTASE DEFIZIENZ (CSID) 19
2. MATERIAL UND METHODEN 24
2.1. MATERIAL 24
2.1.1. BIOPSIEN AUS HUMANER DARMSCHLEIMHAUT 24
2.1.2. REAGENZIEN FÜR DIE CDNA-ISOLIERUNG 24
2.1.3. OLIGONUKLEOTIDE ZUR AMPLIFIZIERUNG DER PATIENTEN CDNA 25 2.1.4. REAGENZIEN FÜR DIE POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) UND FÜR DIE
KLONIERUNG IN EINEN VEKTOR 26
2.1.5. CHEMISCH KOMPETENTE BAKTERIEN 27
2.1.6. BAKTERIENNÄHRMEDIEN 28
2.1.7. LÖSUNGEN FÜR PLASMIDPRÄPARATIONEN 28
2.1.8. GRÖßENSTANDARD FÜR DNA/ MOLEKULARGEWICHTSSTANDARD FÜR PROTEINE 29 2.1.9. REAGENZIEN FÜR DIE OLIGONUKLEOTID-GERICHTETE MUTAGENESE 30
2.1.10. OLIGONUKLEOTIDE, DIE IN DER OLIGONUKLEOTID-GERICHTETEN MUTAGENESE
VERWENDET WURDEN 30
2.1.11. PLASMIDE 31
2.1.12. ZELLLINIEN 31
2.1.13. KULTURMEDIUM FÜR SÄUGERZELLEN 32
2.1.14. REAGENZIEN, DIE IN DER ZELLKULTUR EINGESETZT WURDEN 33
2.1.15. ANTIKÖRPER 33
2.1.16. PUFFER UND PROTEASE-INHIBITOREN, DIE BEI IMMUNPRÄZIPITATIONEN
VERWENDET WURDEN 34
2.1.17. ALLGEMEIN VERWENDETE PUFFER 35
2.1.18. REAGENZIEN FÜR DEGLYKOSYLIERUNGSREAKTIONEN UND
PROTEASESENSITIVITÄTSVERSUCHE 35
2.1.19. PUFFER UND REAGENZIEN FÜR ELEKTROPHORESEN 36 2.1.20. MATERIALIEN FÜR DIE AUTOMATISCHE SEQUENZIERUNG VON DNA 37 2.1.21. MATERIALIEN FÜR DIE IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE 38 2.1.22. MATERIALIEN FÜR DIE KONFOKALE FLUORESZENZMIKROSKOPIE 38
2.1.23. LÖSUNGEN FÜR DEN ENZYMAKTIVITÄTSTEST 38
2.2. METHODEN 39
2.2.1. HOMOGENISIERUNG DER DARMBIOPSIE 39
2.2.2. ZELLLYSE UND ISOLIERUNG DER GESAMT-RNA 39 2.2.3. REVERSE TRANSKRIPTION DER M-RNA UND CDNA-SYNTHESE 40
2.2.4. POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 41
2.2.5. BESTIMMUNG DER NUKLEINSÄURE-KONZENTRATION 42 2.2.6. AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS GELELEKTROPHORESE 42 2.2.7. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 42
2.2.8. DNA-LIGATION 43
2.2.9. TRANSFORMATION VON E.COLI 44
2.2.10. PLASMID-DNA-PRÄPARATION AUS E.COLI 44
2.2.11. ANZUCHT UND LAGERUNG VON BAKTERIENSTÄMMEN 45
2.2.12. DNA-RESTRIKTION 46
2.2.13. DNA-SEQUENZIERUNG 46
2.2.14. OLIGONUKLEOTID-GERICHTETE MUTAGENESE 47
2.2.15. PFLEGE DER ZELLKULTUR 48
2.2.16. TRANSIENTE TRANSFEKTION VON COS-1-ZELLEN NACH DER DEAE-DEXTRAN-
METHODE 49
2.2.17. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PROTEINEN 50
2.2.18. ZELLLYSE UND IMMUNPRÄZIPITATION 50
2.2.19. ENDOGLYKOSIDASE H- UND ENDOGLYKOSIDASE F- BEHANDLUNG 51
2.2.20. TRYPSIN-BEHANDLUNG 51
2.2.21. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 52
2.2.22. MESSUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITÄT 53
2.2.23. KONFOKALE FLUORESZENZMIKROSKOPIE 53
2.2.24. ORGANKULTUR UND BIOSYNTHETISCHE MARKIERUNG VON BIOPSIEN 54
2.2.25. ELEKTRONENMIKROSKOPIE 54
3. ERGEBNISSE 55
GRUNDLAGEN DER VERSUCHE 55
3.1.1. DIAGNOSE DER CSID 55
3.1.2. BIOCHEMISCHER NACHWEIS DER SI IN DER DARMBIOPSIE DES PATIENTEN
MITTELS IMMUNPRÄZIPITATION 59
3.1.3. ELEKTRONENMIKROSKOPISCHER NACHWEIS DER SI, VON LPH UND VON DPPIV
IN EINER DARMBIOPSIE 61
MOLEKULARBIOLOGISCHE UND PROTEINBIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
PATIENTEN-SI 65
3.1.4. NACHWEIS VON PUNKTMUTATIONEN IN DER CDNA DES PATIENTEN 65 3.1.5. GENERIERUNG VON VERSCHIEDENEN MUTANTEN DER SI 67 3.1.6. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER A231T MUTANTE IN VERSCHIEDENEN
ZELLLINIEN 71
3.1.7. ANALYSE VON MÖGLICHEN FALTUNGSDEFEKTEN MITTELS TRYPSIN-
BEHANDLUNG BEI DER A231T MUTANTE 74
3.1.8. UNTERSUCHUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITÄT DER MUTANTE A231T IM
VERGLEICH ZUR WILDTYP-SI 76
3.1.9. VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNG ZUR STABILITÄT ZWISCHEN A231T-MUTANTE
UND WILDTYP-SI NACH 10 STUNDEN CHASE 77
3.1.10. IN SILICO-UNTERSUCHUNG ZUR AUSWIRKUNG DER VERSCHIEDENEN
AMINOSÄUREAUSTAUSCHE AUF DIE POSTULIERTE SEKUNDÄRSTRUKTUR 79 3.1.11. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER L620P MUTANTE IN COS-1-ZELLEN 86 3.1.12. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER L702P MUTANTE IN COS-1-ZELLEN 88 3.1.13. CHARAKTERISIERUNG DER L702P MUTANTE MITTELS KONFOKALER
LASERMIKROSKOPIE 90
4. DISKUSSION 92
4.1.1. DIE PROZESSIERUNG DER SACCHARASE-ISOMALTASE DES PATIENTEN 92 4.1.2. ROLLE DER EINMALIG IDENTIFIZIERTEN PROLINMUTATIONEN 99
5. ZUSAMMENFASSUNG 104
6. SUMMARY 106
7. LITERATURVERZEICHNIS 108
8. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 123
9. TABELLENVERZEICHNIS 125
10. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 126
11. DANKSAGUNG 129
1. Einleitung 1.1 Einleitung
Bis zu 10000 verschiedene Proteinarten können in Säugerzellen vorkommen. Um ihre ordnungsgemäße Funktion zu ermöglichen, muß jedes dieser Proteine zur entsprechenden Membran oder in das entsprechende Kompartiment einer Zelle gelangen können. Ein korrekter Proteintransport ist daher Voraussetzung für die vielfältigen Aufgaben, die eukaryontische Zellen leisten müssen. Dieser Prozess, der jedes in einer Zelle gebildete Protein zu einem bestimmten Ort dirigiert, wird als „protein targeting“ oder „sorting“
bezeichnet. Die Erforschung der wesentlichen Schritte beim intrazellulären Proteintransport ist ein wichtiger Bereich der aktuellen Zellbiologie. Entlang des sekretorischen Weges passieren Proteine mehrere Zellkompartimente und somit mehrere Kontrollpunkte, an denen über deren Transportrichtung und –kompetenz entschieden werden kann. Die biochemischen Vorgänge an diesen Kontrollpunkten werden derzeit anhand verschiedener Modellproteine intensiv untersucht.
In dieser Arbeit ist ein Transportdefekt bei einem natürlich vorkommenden Phänotyp der Congenitalen Saccharase-Isomaltase Defizienz (CSID), mittels molekular- und zell- biologischer Methoden analysiert worden.
1.2 Der sekretorische Weg führt die meisten Proteine durch das ER
Proteine, die für die Plasmamembran oder für die Lysosomen bestimmt sind, sowie Proteine, die von der Zelle schließlich sezerniert werden, lassen sich zu einer gemeinsamen Gruppe zusammenfassen. Sie werden unmittelbar nach Beginn der Biosynthese an den freien Ribosomen im Zytosol in das rauhe Endoplasmatische Retikulum (ER) transloziert (RAPOPORT et al. 1996). Solche Eiweiße, die diesen als „secretory pathway“ bezeichneten Weg einschlagen, gelangen vom ER schließlich in den Golgi Apparat, von wo sie endgültig zu ihrem Bestimmungsort sortiert werden. Im Bereich des trans-Golgi-Netzwerkes (TGN) werden sie dazu in verschiedene Vesikel eingebaut (GRIFFITHS u. SIMONS 1986) .
Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Darmepithelzelle
Im Zellkern findet die Transkription der DNA statt. Die Biosynthese von Proteinen, die den „secretory pathway“ einschlagen, wird unmittelbar nach ihrem Beginn an den freien Ribosomen des Zytosols im rauhen Endoplasmatischen Retikulum zu Ende geführt. Anschließend gelangen diese über Vesikel in den Golgi Apparat, von wo sie endgültig zu ihrem Bestimmungsort sortiert werden. Abb. modifiziert nach KUCHEL und RALSTON (1988).
Um zum ER dirigiert zu werden, tragen naszierende Polypeptidketten ein spezifisches Signal, welches aus hydrophoben Aminosäuren besteht und meist aminoterminal gelegen ist (MARTOGLIO u. DOBBERSTEIN 1998). Damit werden die freien Ribosomen, an denen die Biosynthese begonnen hat, zum ER gelenkt. Ein „signal-recognition particle“ (SRP) bindet an die Signalsequenz des Peptids und der Komplex aus SRP, naszierendem Protein und Ribosom bindet anschließend an die a-Untereinheit des SRP-Rezeptors in der ER-Membran (BACHER et al. 1996). Sobald SRP und Rezeptor (RAPOPORT 1991) unter Hydrolyse von GTP von der Peptidkette dissoziiert sind, bindet die Signalsequenz an einen mit TRAM- Proteinen und Sec61 Komplex umgebenen Kanal, das Translocon (MATLACK et al. 1998).
Mitochondrium Peroxisom
Freie Ribosomen
Endosom Lysosom Golgi Apparat
Zytoplasma
Rauhes Endoplasmatisches Retikulum
Kern
Basolaterale Membran Apikale Membran
Das Tor, welches die Innenseite des Translocon verschließt, öffnet sich und ermöglicht somit der Signalsequenz und der naszierenden Peptidkette, mit einer Polypeptidschlaufe in das Lumen des ER einzudringen, so daß nach und nach das gesamte Protein im ungefalteten Zustand in das Lumen des ER gleiten kann (CORSI u. SCHEKMAN 1996). Sowohl SRP als auch der Rezeptor werden freigesetzt und können erneut an ein naszierendes Polypeptid binden. Während der Elongation der Polypeptidkette trennt eine im Lumen des ER lokalisierte Signalpeptidase die Signalsequenz ab (DALBEY u. VON HEIJNE 1992). Vom vollständig translatierten Protein dissoziieren die Ribosomen ab (POWERS u. WALTER 1996), der C-terminale Teil gelangt schließlich in das ER-Lumen und das Tor vom Translocon schließt sich.
Der größte Anteil der Proteinsynthese findet an den gebundenen Ribosomen des rauhen Endoplasmatischen Retikulums (rER) statt, seine Konformation erlangt ein Protein durch die Faltungsprozesse im Lumen des ER (GETHING u. SAMBROOK 1992; HIGH et al. 2000), wobei die Erlangung einer korrekten Konformation eine wichtige Voraussetzung für die Erlangung seiner Transportkompetenz ist (RANDALL u. HARDY 1986).
Intramolekulare und intermolekulare Disulfidbrücken entstehen durch oxidative Verknüpfung von Sulfhydrylgruppen, ein Reaktionstyp, der aufgrund des oxidativen Milieus im ER möglich ist. Diese kovalente Bindung ist oft für die Stabilität und Funktion, weiterhin auch für die Reifung und den intrazellulären Transport nötig. Dabei ist bei Proteinen, die mehr als eine Disulfid-Brücke aufweisen, eine korrekte Paarung der Sulfhydrylreste notwendig, da die Ausbildung der Brücken in vielen Fällen, z.B. während der Synthese der leichten Ketten der Immunglobuline (Ig) (BERGMAN u. KUEHL 1979), von Serumalbumin (PETERS u.
DAVIDSON 1982) oder von Influenza-Hämagglutinin (BRAAKMAN et al. 1992a;
BRAAKMAN et al. 1992b) kotranslational erfolgt. Ein Umlagern von unphysiologisch ausgebildeten Brücken ist durch die ER-ständige Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) (FREEDMAN et al. 1989) möglich. Eine weitere Enzymfamilie, die ebenfalls an der Faltung der Proteine in ihre native Konformation beteiligt ist, stellen die Peptidyl-Prolyl-Isomerasen dar, die eine Rotation der Peptidyl-Prolyl-Bindungen beschleunigen können. Diese im ER residenten Proteine (BOSE u. FREEDMAN 1994), die andere Proteine bei ihrer Faltung unterstützen, haben in den meisten Fällen eine geringe Substratspezifität. Es gibt jedoch unter den Peptidyl-Prolyl-Isomerasen spezifische Enzyme, die nur die Umsetzung einzelner
Substrate katalysieren, wie z.B. die ER-Peptidyl-Prolyl-Isomerase NINAA, die die Faltung von Opsin, einem lichtabsorbierenden visuellen Triggerprotein von Drosophila, katalysiert (COLLEY et al. 1991).
Eine weitere wichtige Veränderung, die Proteine im ER erfahren, ist die Aneinanderlagerung mehrerer Polypeptidketten zu multimeren Proteinen. Die räumliche Anordnung mehrerer gleicher oder auch unterschiedlicher Polypeptidketten eines Proteins bezeichnet man als Quartärstruktur, deren Ausbildung als Assemblierung. Neben einer korrekten Faltung ist auch dieser Vorgang essentiell, damit Proteine das rER verlassen können, um weiter zum Golgi- Apparat und anschließend zur Zelloberfläche oder zu einem anderen Bestimmungsort gelangen zu können (GETHING et al. 1986b). Ungefaltete, fehlerhaft oder teilweise gefaltete und assemblierte Proteine werden selektiv im ER zurückbehalten oder gelangen bis zum cis- Golgi. Von dort werden sie dann zum ER zurücktransportiert, gelangen durch das Translocon zurück ins Zytosol und werden anschließend durch das Proteasom abgebaut (JENTSCH u.
SCHLENKER 1995).
Neben der Ausbildung der Disulfidbrücken, der korrekten Faltung und der Assemblierung von Polypeptiduntereinheiten zu multimeren Proteinen, finden im ER noch weitere Vorgänge statt, wie spezifische proteolytische Spaltungen oder Anheftung und Prozessierung von Kohlehydratketten. Dieser Vorgang der Glykosylierung stellt die am häufigsten vorkommende Art der chemischen Modifizierung eines Proteins dar. Dabei finden einige der Glykosylierungsreaktionen im Lumen des ER, andere im Lumen der Cisternen des cis-, medialen- oder trans-Golgi statt. Daher kann das Vorkommen von bestimmten glykosylierten Seitenketten als Marker für den Transport von Glykoproteinen durch das ER bzw. den Golgi- Apparat herangezogen werden. N- und O-Glykosylierung haben eine stark unterschiedliche Struktur: O-gebundene Glykane bestehen aus meist kurzen Seitenketten (1 bis 4 Zuckerreste), die über N-Acetylgalactosamin (GalNac) an die Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin gebunden sind, während bei allen N-glykosydisch gebundenen Oligosacchariden N- Acetylglucosamin (GlcNac) an den Aminostickstoff von Asparagin gebunden ist. Bei dieser Glykosylierungsform kommt immer neben N-Acetylglucosamin auch Mannose vor, die Seitenketten sind stark verzweigt und enden jeweils mit einem negativ geladenen Neuraminsäurerest (LODISH et al. 2001) .
Die N-Glykosylierung beginnt immer im ER mit der Addition eines 14 Zucker umfassenden, präformierten mannosereichen Oligosaccharids, der von einem als Carrier fungierenden Dolicholmolekül auf ein Asparagin übertragen wird. Dabei muß das Asparagin immer in einer Tripeptidsequenz Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser stehen, damit die Oligosaccharid- Proteintransferase, die diese Reaktion katalysiert, das entsprechende Asparagin als Substrat erkennt (KORNFELD u. KORNFELD 1985). Nach weiteren Veränderungen der Oligosaccharidverzweigungen im ER, wird beim weiteren Transport des Glykoproteins durch den Golgi-Apparat die im ER begonnene Glykosylierung beendet. Die komplexe Glykosylierung ist dabei für verschiedene Proteine, Zelltypen und Organismen stark unterschiedlich.
Die O-Glykosylierung beginnt je nach enzymatischer Ausstattung der Organellen im ER oder im cis-Golgi und setzt sich im trans-Golgi oder im trans-Golgi-Netzwerk fort.
An Glykoproteinen angehängte Oligosaccharidmodifikationen können Proteine vor Proteolyse bewahren, sind in manchen Fällen an der Zelladhäsion beteiligt, stellen Erkennungsmerkmale für andere Proteine an der Zelloberfläche dar (PAULSON 1989) und können an der Erlangung einer korrekten Proteinfaltung beteiligt sein (siehe Kapitel 1.4).
1.3 Molekulare Chaperone
Für einige Proteine konnte gezeigt werden, daß die Ausbildung eines nativen Proteins aus der ungefalteten Vorstufe ein spontaner Prozeß ist, der von der freien Energie im System abhängt (ANFINSEN 1973). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Faltung kleiner globulärer Proteine in ihre nativen Form von ihrer Aminosäuresequenz bestimmt wird. Allerdings sind die Bedingungen, die im Experiment gewählt werden müssen, um andere, größere Proteine in vitro zu falten, häufig unphysiologisch (sehr geringe Proteinkonzentration, sehr lange Inkubationszeiten und geringe Temperatur), so daß man annehmen mußte, daß bei der Proteinfaltung in vivo zusätzliche Faktoren eine Rolle spielen müssen (ELLIS et al. 1989;
ELLIS u. VAN DER VIES 1991).
Die Faltung der meisten neusynthetisierten Proteine in der Zelle benötigt die Interaktion von Protein-Kofaktoren, die als molekulare Chaperone bekannt sind. Diese Moleküle erkennen und binden entstehende Polypeptidketten und teilweise gefaltete Proteinintermediate. Sie wirken unterstützend bei deren Faltung mit, werden wieder abgelöst und bewahren somit Proteine vor Aggregation und der Erlangung einer fehlerhaften Konformation (ELLIS et al.
1989; FINK 1999). Dabei erkennen molekulare Chaperone selektiv nicht native Proteine und bilden mit ihnen relativ stabile Komplexe aus (ELLIS et al. 1989), die durch die Bindung und Hydrolyse von ATP dissoziieren. Wichtige Chaperon-Familien sind die 40 kDa Hitzeschockproteine (Hsp 40; DnaJ ist ein wichtiger Vertreter), die 60 kDa Hitzeschockproteine (Hsp 60; GroEL und und TCP-1 gehören zu dieser Familie) und die 70 kDa sowie die 90 kDa Hitzeschockproteine. Das im ER lokalisierte und zu der Hsp 70 Familie gehörende ER-Chaperon BiP wurde bei Untersuchungen über die Assemblierung von Immunglobulinen entdeckt (BOLE et al. 1986). Die schweren Ketten der Immunglobuline bleiben mit BiP so lange assoziiert, bis die leichten Ketten angehängt werden. Erfolgt keine Anlagerung der leichten Ketten, verbleiben die schweren Ketten an BiP gebunden im Lumen des ER. Bei Untersuchungen über die Bindung von BiP an N-glykosidisch modifizierten Proteinen konnte eine Korrelation zwischen Glykosylierungsmuster des Proteins, Assoziation mit BiP und der Sekretion von Faktor VIII (F VIII), des von Willebrand-Faktors und vom tissue plasminogen activator (tPA) festgestellt werden (DORNER et al. 1987).
Zudem konnte gezeigt werden, daß BiP mit mutierten oder falsch glykosylierten Proteinen assoziiert (GETHING et al. 1986). In Affenzellen konnte anhand des exprimierten Influenza- Virus-Hämagglutinins gezeigt werden, daß allein das falsch gefaltete Protein, welches aufgrund einer Mutation im ER verbleibt, nicht aber das Wildtyp-Hämagglutinin in der Lage ist, die Synthese von Grp 78 (BiP) zu induzieren (KOZUTSUMI et al. 1988). Um seine Aufgaben erfüllen zu können, muß ein solches Chaperon zwischen unvollständig gefaltetem und korrekt gefaltetem Protein unterscheiden können. Über die Untersuchung von Bindungsaffinitäten verschiedener synthetischer Peptide an BiP ist die Hypothese entstanden, daß bestimmte Abschnitte an der Oberfläche des Proteins zur Bindung von BiP führen und den nachfolgenden Faltungsprozeß anregen (FLYNN et al. 1989). Anhand eines modifizierten sekretorischen Proteins, welches während seiner Translokation in das ER in der Membran verbleibt, konnte gezeigt werden, daß BiP in Hefezellen direkt an der Translokation des
Polypeptids in das ER beteiligt ist (SANDERS et al. 1992). Bei Studien über die Biosynthese des Thyreoglobulins, welches sich aufgrund seiner ungewöhnlichen Größe gut für Untersuchungen zur Erlangung der Tertiärstruktur und der Wirkung von Chaperonen eignet, konnte festgestellt werden, daß das Protein sofort nach seiner Translokation in das ER mit BiP interagiert (KIM et al. 1992).
Mitglieder der Hsp 90-Familie sind in allen Organismen vom Bakterium bis zum Menschen anzutreffen. In Eukaryonten kommt neben der zytosolischen Hsp 90-Form mit Grp 94 eine ER-Form vor. Eine Mutante von Hsp 90 in Hefezellen, die bei hohen Temperaturen schnell und vollständig ihre Aktivität verliert, wurde verwendet, um die Funktion von Hsp 90 in vivo zu untersuchen. Dabei fand man heraus, daß Hsp 90 bei der Erlangung der korrekten Konformation keinen direkten Einfluß ausübt, vielmehr aber von bestimmten Proteinen benötigt wird, die Schwierigkeiten bei der Faltung in ihre native Konformation aufweisen (NATHAN et al. 1997).
Unter den vielen weiteren ER-Faltungsfaktoren gibt es drei, die spezifisch die Faltung von N- glykosidisch modifizierten Proteinen unterstützen. Diese sind Calnexin, Calretikulin und ERp57 (HIGH et al. 2000). Im Gegensatz zu den klassischen Chaperonen scheint die Polypeptidkette wenig Einfluß auf die Bindung mit Calnexin/Calretikulin zu haben, hingegen wurde gezeigt, daß die Struktur der Zuckerkette eine wesentliche Rolle bei der Bindung der Chaperone spielt. Daher können diese beiden Moleküle als ER-Lektine beschrieben werden, die spezifisch N-glykosidisch gebundene Zuckerketten an Proteinen erkennen (RODAN et al.
1996; HIGH et al. 2000). Calnexin und Calretikulin sind calciumabhängig an der Faltung und Assemblierung naszierender Proteine im ER beteiligt und spielen eine wichtige Rolle bei der Reifung der Glykoproteine und deren Qualitätskontrolle. Calnexin ist ein glykosyliertes Transmembranprotein, das sequenzhomolog zu seinem löslichen Partner, Calretikulin, ist.
ERp57 ist homolog zu der Proteindisulfidisomerase und kann mit den selben monoglykosylierten Glykoproteinen vernetzt werden, die auch an Calnexin oder Calreticulin binden.
1.4 Korrekte Faltung als Voraussetzung für intrazellulären Proteintransport
Eukaryontische Zellen besitzen eine Proteinmaschinerie, die Polypeptidketten bei ihrer Faltung unterstützt, falsch gefaltete Proteine wieder entfaltet und bei Bedarf degradiert. Dieser Mechanismus benötigt ein Qualitätskontrollsystem, das zwischen korrekt und falsch gefalteten Proteinen unterscheiden und diese entsprechend weiterleiten kann. Das Qualitätskontrollsystem des ER enthält eine Saccharidtransferase, die als Faltungssensor fungiert (ELLGAARD et al. 1999). Ziel dieses Systems ist, alle Proteine, die nicht ihre native Konformation erlangt haben, im ER zurückzubehalten und sie nochmals mit Faltungsfaktoren in Verbindung zu bringen. Ein beträchtlicher Teil der im ER synthetisierten Proteine werden während ihrer Translokation durch das ER glykosyliert. Das angehängte Glykan ist verzweigt, wobei ein Ast mit drei Glucoseresten endet. Im Lumen des ER wird das Glykan durch zwei Glucosidasen getrimmt. Das verbleibende monoglykosylierte Protein bindet an die Faltungsfaktoren Calretikulin, Calnexin und ERp57.
Calretikulin und Calnexin verhindern wie klassische Chaperone die Proteinaggregation und wirken bei der Proteinfaltung unterstützend mit. Allerdings scheinen sie nicht direkt an die Polypeptidkette ihres Substrats zu binden, setzen auch kein ATP um, sondern verhalten sich eher wie Lektine (RODAN et al. 1996), binden also den Zuckeranteil der Proteine. ERp57 hingegen ist ein Enzym, nämlich eine Disulfid-Isomerase (ZAPUN et al. 1998).
Die Bindung des Glykans an die Lektine hängt von dem Vorhandensein eines einzelnen Glucoserestes am Ende des Glykans ab. Das Substrat wird erst dann von den Lektinen entlassen, sobald dieser Glucoserest von einer Glucosidase abgespalten worden ist.
Falls das Protein un- oder falsch gefaltet ist, wird es von einer Saccharidtransferase, die als Faltungssensor fungiert, erkannt. In solchen Fällen werden wieder drei Glucosereste an das Glykan angehängt, so daß das Glykoprotein wieder mit den Lektinen reassoziieren und einen neuen Faltungszyklus durchlaufen kann. Die meisten Proteine durchlaufen einen oder mehrere solcher Faltungszyklen.
Falls das Protein nach mehreren Zyklen nicht die native Konformation erlangen kann, wird es in einigen Fällen in das Zytosol zurücktransportiert, wo es deglykosyliert, dann ubiquitiniert und schließlich durch das Proteasom abgebaut wird (PLEMPER u. WOLF 1999).
Diese Saccharidtransferase, die in der Lage ist, zwischen korrekt und falsch gefalteten Proteinen zu unterscheiden, ist die UDP-Gluc:Glucosyltransferase (GANAN et al. 1991;
ZAPUN et al. 1997). Nur dieses Enzym reagiert sensibel auf die Proteinkonformation, wohingegen weder die Glucosidasen, noch die Lektine zwischen unterschiedlichen Proteinkonformationen unterscheiden können.
Damit die UDP-Gluc:Glucosyltransferase ein Protein als ihr Substrat erkennt, müssen zwei Bedingungen gegeben sein: das Substrat muß einerseits glykosyliert sein und andererseits in einer nicht nativen Form vorliegen. Um den Erkennungsmechanismus der Saccharidtransferase auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurden von RITTER u.
HELENIUS (2000) verschiedene Proteinchimäre aus zwei Domänen der bovinen pankreatischen RNAse A und B generiert. Proteolytisch wurden dabei vom N-Terminus beider Formen 20 Aminosäuren entfernt und das Protein in Anwesenheit des jeweils anderen, nicht zum Teil deletierten Proteins renaturiert, so daß ein Heterodimer mit einer korrekt gefalteten und einer falsch gefalteten Domäne vorlag. Da sich RNAse A und B nicht in ihrer Aminosäuresequenz, sondern dadurch unterscheiden, daß RNAse B monoglykosyliert vorkommt, konnte in den entstandenen Chimären nicht nachvollzogen werden, welche der beiden Domänen falsch gefaltet vorlag. Das monoglykosylierte Glykan lag daher entweder bei der falsch oder bei der korrekt gefalteten Domäne. Wie bisher vermutet, wurden nur diejenigen Domänen von der Glykosyltransferase glykosyliert, die bereits das Monoglykan trugen, überraschenderweise jedoch wurden Glykane, die an einer glykosylierten, aber korrekt gefalteten Domäne gebunden waren und in Nachbarschaft einer falsch gefalteten Domäne lagen, nicht erkannt und glykosyliert.
Dies zeigt, daß die UDP-Gluc:Glykoprotein Glucosyltransferase (GT) Faltungsdefekte auf der Ebene von individuellen Domänen erkennt und ausschließlich Glykane, die an diese Domänen gebunden sind, reglykosyliert (RITTER u. HELENIUS 2000).
1.5 Transport in polaren Epithelzellen
Die Plasmamembran der Enterozyten spiegelt die hohe Polarisation dieser Zellart wieder. Sie besteht aus einer apikalen und einer basolateralen Domäne (Abb.1) mit unterschiedlicher Protein- und Lipidzusammensetzung (CAPLAN et al. 1987; MASSEY-HARROCHE 2000).
Strukturen, die diese unterschiedlichen Membrandomänen bedingen und erhalten, sind z.B.
„tight junctions“ zwischen den beiden Domänen und das korticale Zytoskelett, welches selektiv bestimmte Transmembranproteine binden kann (LE GALL et al. 1995).
Von Markerproteinen beider Domänen sind viele Studien über deren Biosynthese und deren intrazellulären Weg durchgeführt worden (MASSEY-HARROCHE 2000). Für die Inkorporation von Plasmamembranproteinen sind mehrere Vorgänge beschrieben worden, wie die aus dem trans-Golgi-Netzwerk (TGN) abgeschnürten Vesikel sowohl direkt als auch indirekt in die richtige Membrandomäne eingelagert werden (BURDICK et al. 1996). Für basolateral sortierte Proteine wurde dabei ein direkter Weg beschrieben, wohingegen für apikal sortierte Proteine abhängig vom Protein zwei Wege, ein direkter und ein indirekter über die basolaterale Domäne, beschrieben worden sind (MASSEY-HARROCHE 2000).
Dabei sind bestimmte im Protein selbst enthaltene Signale in der Lage, die Membranproteine auf unterschiedliche Vesikel aufzuteilen (BURDICK et al. 1996). Die Vesikel selbst enthalten unterschiedliche Oberflächenproteine. Apikale Sortiersignale scheinen in der luminalen Domäne von Transmembranproteinen lokalisiert zu sein. Bei Proteinen, die über einen Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol-Anker (GPI-Anker) in der apikalen Plasmamembran verankert sind, scheint die Sortierinformation über diesen Lipid-Anker kodiert zu sein (LISANTI u. RODRIGUEZ-BOULAN 1990; LISANTI et al. 1988; LISANTI et al. 1989) Im Gegensatz dazu, sind basolaterale Signale in der zytoplasmatischen Domäne von Transmembranproteinen identifiziert worden. Außerdem haben Ähnlichkeiten zwischen den basolateralen Signalen und den Signalen, die für endozytotische Vorgänge benötigt werden, zu der Annahme geführt, daß diese beiden Sortierprozesse miteinander verbunden sein könnten (LE GALL et al. 1995).
Der Vorgang der Sortierung von Proteinen und Lipiden setzt nicht nur das Vorhandensein von Sortiersignalen und unterschiedlichen Transportvesikeln voraus, es müssen auch zelluläre
Sortierungsmaschinerien vorhanden sein, die anhand von Sortiersignalen Proteine bzw.
Lipide an bestimmten Stellen umleiten (IKONEN u. SIMONS 1998).
In epithelialen Zellen findet die Sortierung von apikalen bzw. basolateralen Proteinen durch die Sortierung im TGN und den Transport in getrennten Vesikeln statt. Wichtig erscheint ein in Triton-X-100 unlöslicher, GPI-und Glykolipid-reicher Membranrest. Von FIEDLER et al.
(1993) wurde dieser charakterisiert und seine Beteiligung am Transport zur apikalen Zellmembran beschrieben. Die Schaffung und Aufrechterhaltung einer asymmetrischen Zelloberfläche ist für den geordneten Ablauf vieler Zellfunktionen, wie z.B. Absorption, Sekretion, Signalübertragung, Entwicklung und Morphogenese von essentieller Bedeutung.
Durch die Verwendung von mehreren farbigen Varianten des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP), konnten in lebenden Zellen mehrfarbige Bilder von apikal bzw. basolateral lokalisierten Proteinen aufgenommen und somit ihr Transportverhalten studiert werden.
Dadurch konnte fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden, daß sich apikale und basolaterale Proteine nach und nach in großen Domänen im Golgi-Apparat und im trans-Golgi-Netzwerk anreichern, Golgi-Proteine aussortiert und apikale und basolaterale Proteine in verschiedenen Transportvesikeln getrennt und anschließend aus dem TGN entlassen werden (KELLER et al.
2001). Einige Proteine assoziieren vor dem Transport zur apikalen Membran mit Membranabschnitten, die reich an Glykosylphosphatidylinositol und Cholesterol sind und sich nicht in dem Detergens Triton X-100 lösen lassen (DIGs). Andere apikal sortierte Proteine assoziieren nicht mit diesen DIGs. In post-Golgi Transportvesikeln konnten zudem unterschiedliche Subdomänen für DIG-assoziierte und nicht assoziierte apikale Proteine in lebenden Säugerzellen nachgewiesen werden (JACOB u. NAIM 2001a).
1.6 Die Rolle der Proteinprozessierung in der Pathophysiologie von genetisch bedingten Erkrankungen
Bei etwa der Hälfte aller genetisch bedingten Erkrankungen, denen eine Punktmutation in einem kodierenden Bereich eines Gens zugrunde liegt, ist eine fehlerhafte m-RNA oder eine zu geringe Konzentration dieser Nukleinsäure dafür verantwortlich, daß kein oder zu wenig des entsprechenden Proteins gebildet wird. Bei der anderen Hälfte führen Punktmutationen
oder kleine Insertionen und Deletionen innerhalb des Leserahmens nicht zu einer herabgesetzten Synthesemenge des Polypeptids, vielmehr kommt es hier zur Bildung eines veränderten, oft labileren und schlecht gefalteten Proteins (GREGERSEN et al. 2000).
Krankheiten, deren Pathomechanismus darauf beruht, daß ein falsch gefaltetes Protein gebildet wird, werden auch als konformationsbedingte Krankheiten bezeichnet (CARRELL u.
LOMAS 1997; THOMAS et al. 1995). Dabei können unterschiedliche Auswirkungen einer veränderten Konformation beobachtet werden:
Beispielsweise sind an der Entstehung der Alzheimer Erkrankung und der Creutzfeld-Jakob- Erkrankung unerwünschte Proteinaggregationen beteiligt (GOLDFARB et al. 1993;
HILBICH et al. 1991; MASTERS et al. 1985). Bei einer besonderen Form der hypertrophen Kardiomyopathie, der humanen Desmin-Kardiomyopathie, führt das Vorliegen der dominant negativen D7-Mutation zur Expression eines leicht aggregierenden Desmin-Proteins (WANG et al. 2001; BONNE et al. 1995; BONNE et al. 1998). Am häufigsten finden sich Erkrankungen, deren Pathomechanismus auf einem vermehrten Abbau von instabilem Protein beruht oder bei denen das betroffene Protein aufgrund seiner veränderten Konformation keine Transportkompetenz erlangt und in verschiedenen Kompartimenten entlang des sekretorischen Weges akkumuliert (BROSS et al. 1999; GREGERSEN et al. 2000;
GREGERSEN et al. 2001).
Fehlerhafte Proteinprozessierungen, die dadurch charakterisiert sind, daß ein mutiertes Protein mit der normalen Prozessierungsmaschinerie interagiert, betreffen lysosomale Proteine und Zelloberflächenproteine, genauso wie Proteine der extrazellulären Matrix und sekretorische Proteine.
Da von der Zelle aufgenommenes organisches Material und zelluläre Bestandteile in den Lysosomen abgebaut werden, führen genetische Erkrankungen, die diese lysosomalen Enzyme in ihrer Funktion beeinträchtigen, zu intrazellulären Anhäufungen von teilweise abgebautem Substrat. Diese Ablagerungen führen zu den Symptomen von lysosomalen Speicherkrankheiten, deren schwerwiegende klinische Bilder u.a. mit Hepatosplenomegalien, Ankylosen, Skelettmalformationen, geistiger Retardierung und Frühsterblichkeit einhergehen.
Zu diesen lysosomalen Speicherkrankheiten zählt die autosomal-rezessiv vererbte Sphingolipidose, die als Morbus Gaucher bekannt ist. Diese Erkrankung beruht auf Mutationen im Gen der Glucocerebrosidase. Bei der Untersuchung von Personen, die an
Morbus Gaucher erkrankt sind, wurde bei unterschiedlichen Genotypen eine geringe Enzymaktivität der Glucocerebrosidase gefunden (SINCLAIR et al. 2001; TORRALBA et al.
2001). Zudem wurde bei dem G202R-Genotyp ein beeinträchtigter Transport der sauren Glukosidase festgestellt (ZIMMER et al. 1999). Bei der D409H-Mutation hingegen kommt es zur Bildung einer labilen m-RNA, die auch zur Bildung eines labilen korrespondierenden Proteins führt (PASMANIK-CHOR et al. 1996). Das Vorkommen dieser Erkrankung ist auch bei einem Hund beschrieben worden (VAN DE WATER et al. 1979).
Neben den Lipidosen sind auch Mukopolysaccharidosen bekannt, deren Pathophysiologie auf einer Speicherung von Mukopolysacchariden in den Lysosomen zurückzuführen ist.
Bei der Mukopolysaccharidose Typ IV beträgt die Aktivität des Enzyms N- Acetylgalaktosamin-4-Sulfatase in den Fibroblasten bei erkrankten Individuen weniger als 5% im Vergleich zu der Enzymaktivität von Kontrollpersonen (BROOKS 1993). Die bei Untersuchungen betroffener Individuen festgestellten Proteinmengen in Verbindung mit den gemessenen Enzymaktivitäten führen zu der Schlußfolgerung, daß die Pathophysiologie dieser Erkrankung in der geringen Enzymkonzentration begründet liegt (BROOKS et al.
1991). Weiterführende Untersuchungen führten zur Beschreibung mehrerer pathophysiologischer Vorgänge als Ursache der Mucopolysaccharidose Typ IV. Unter anderem führte eine Mutation im Stopp-Codon *534Q im Enzym Arylsulfatase zu deutlichen Konformationsänderungen und niedrigen intrazellulären Proteinkonzentrationen. Studien zur Prozessierung dieser Mutante zeigten, daß das Protein zwar normal synthetisiert, aber nicht zum TGN transportiert, sondern im ER zurückbehalten und anschließend degradiert wurde (ARLT et al. 1994).
Die häufigste autosomal-rezessive Erkrankung der kaukasischen Bevölkerung mit einer Inzidenz von 1:2500 unter den Neugeborenen ist die Mukoviszidose (Zystische Fibrose). Sie wird durch Mutationen im CFTR-Gen verursacht. Das CFTR-Gen kodiert für einen an der Plasmamembran lokalisierten Chlorid-Kanal, der aktiv Chlorid-Ionen aus der Zelle transportiert. Durch vermehrte Produktion und erhöhte Viskosität des Sekrets der mukösen Drüsen, kommt es bei homozygoten Trägern zu schweren Erkrankungen des Atmungs- und Verdauungstraktes. Bei der häufigsten Mutation, einer Deletion des Phenylalanins an Position 508 des Polypeptids (? F508), wird das CFTR normal synthetisiert, jedoch ist das Protein nicht in der Lage, das ER zu verlassen (CHENG et al. 1990). Das retenierte Protein ist dabei
funktionell aktiv (PASYK u. FOSKETT 1995). Die ? F508-Mutante wird anschließend über das Proteasom degradiert (WARD et al. 1995; BROOKS 1997; CHENG et al. 1990;
GREGERSEN et al. 2000). Weiterhin konnte beobachtet werden, daß der Transport der Mutante ? F508 temperatursensitiv ist (LUKACS et al. 1993) und, daß diese Mutante mit dem ER-Chaperon Calnexin länger als das Wildtyp-Protein assoziiert bleibt (PIND et al. 1994).
Diese Beobachtungen sprechen dafür, daß auch bei dieser Erkrankung die Proteinkonformation an der Pathologie beteiligt zu sein scheint (THOMAS et al. 1992).
Durch die Beschreibung verschiedener subzellulärer Strukturen und Mechanismen, die über die Qualität des Proteins und somit über ihre Transportkompetenz entscheiden, konnte bei diesen proteinkonformationsbedingten Krankheiten der Pathomechanismus weiter aufgeklärt werden, so daß sich in Zukunft daraus innovative therapeutische Ansätze ergeben könnten.
1.7 Saccharase-Isomaltase (SI), ein Glykoprotein der apikalen Bürstensaummembran des Darms
Dünndarmepithelzellen stellen aufgrund ihrer Polarität ein geeignetes Modell dar, um funktionell wichtige Proteindomänen zu untersuchen. Ihre apikalen und basolateralen Membranen exprimieren eine Vielzahl von Proteinen, die beispielhaft studiert werden können, um Mechanismen und Interaktionen von normalem und fehlerhaftem Transport von Eiweißen auf molekularer Ebene aufzuklären.
Die SI kommt ausschließlich im Darm vor und ist das am meisten vorkommende Glykoprotein der Bürstensaummembran des Duodenums (SEMENZA et al. 1983). Dieses Enzym gehört wie auch die Laktase-Phlorizin-Hydrolase, die Maltase-Glukoamylase und die Trehalase zu den Disaccharidasen der intestinalen Mikrovillimembran.
Die beiden Untereinheiten Saccharase und Isomaltase verdauen ?-glykosidisch verbundene Kohlehydrate, welche die vornehmlich vorkommende Klasse an Kohlehydraten der Säugerernährung darstellt. Aufgrung dieser Eigenschaft zählt dieses Enzym zur Klasse der a- Glukosidasen, zu der auch u.a. die Glukoamylase zählt. Beispielsweise wird Stärke, neben
Glykogen ein wichtiges Nahrungskohlehydrat, durch verschiedene Verdauungsenzyme des Pankreas stufenweise zu Oligosacchariden abgebaut. Die eigentliche Absorption von Kohlehydraten geschieht in Form von Monosacchariden, da kein effizienter Mechanismus existiert, um Disaccharide in Darmzellen aufzunehmen. Daher erfolgt der endgültige Abbau von Stärke und Saccharose durch die Saccharase. Die freigesetzten Monosaccharide Glucose und Fruktose können dann in das Zellinnere aufgenommen werden. Glukose wird sekundär- aktiv über den Ko-Transport mit Na+ an der apikalen Membran eingeschleust und anschließend über „carrier“ ins Pfortaderblut abgegeben. Unverdaute Saccharose kann nicht absorbiert werden und wird im Dickdarm vergärt. Im Dünndarm entfaltet nicht verdaute Saccharose eine osmotische Wirkung, die gemeinsam mit den Gärprodukten aus dem Dickdarm zu Bauchkrämpfen und Diarrhoe führt. Diese Symptome werden auch bei der erblichen Saccharase-Isomaltase-Defizienz beobachtet.
Während Saccharase a–1,2-und a–1,4-glykosidisch verbundene Kohlehydrate spaltet, hydrolysiert die Isomaltase vor allen Dingen a–1,6-glykosidisch gebundenen Zucker. Sie besitzt außerdem eine Maltase-Aktivität.
Die beiden homologen Domänen Saccharase und Isomaltase entstehen aus einer Polypeptidkette, dem Vorläuferprotein pro-SI, welches erst im Darmlumen durch Trypsin gespalten wird (HAURI et al. 1985). Beide Untereinheiten der SI bleiben an der apikalen Bürstensaummembran über ionische Wechselwirkung miteinander verbunden (NAIM et al.
1988b).
1.8 Biosynthese, Reifung und Struktur der humanen Saccharase-Isomaltase
Das Gen, welches für die Saccharase-Isomaltase kodiert, ist auf dem Chromosom 3 lokalisiert (WEST et al. 1988). Seine 5’-flankierende Region enthält mehrere potentielle Bindungsstellen für Intestinum-spezifische Transkriptionsfaktoren (TRABER u. SILBERG 1996). Die SI- cDNA besteht aus 5484 Nukleotiden, die für 1827 Aminosäuren codieren (GREEN et al.
1987), wobei die genaue Exon-Intron-Struktur nicht bekannt ist. Biochemische Analysen haben gezeigt, daß in der translatierten Polypeptidkette 4 Domänen beschrieben werden können.
ZS SS/MA
Isomaltase Saccharase
N C
Spaltungsstelle für Trypsin (Arg1007/Ile1008)
Pro SIh 1827 AS
Abbildung 2: Struktur der SI
Die erste nachweisbare Form der SI ist die pro-SIh im ER. Dieses Vorläufermolekül besitzt eine nicht abspaltbare Signalsequenz (SS), die zusätzlich als Membrananker (MA) dient. Der zytoplasmatische Teil (ZS) besteht aus 12 AS. Daran schließt sich der Membrananker aus 20 AS an, dem eine Serin/Threonin- reiche Stabregion aus 28 AS folgt. Diese wird bereits zur Isomaltase-Untereinheit gezählt, die am Arginin (Arg) 1007 endet. Zwischen der Isomaltase-Untereinheit und der Saccharase-Untereinheit, die mit Isoleucin (Ile) 1008 beginnt, befindet sich eine Spaltungsstelle für Trypsin, an der das reife SI-Molekül im Darmlumen gespalten wird, wobei beide Untereinheiten anschließend durch ionische Wechselwirkungen miteinander verbunden bleiben.
Die Membranankerdomäne durchspannt die Lipiddoppelschicht nur einmal, wobei der N- Terminus des Proteins zum Zytoplasma gerichtet ist (Abb.3). Neben der Verankerung der SI in der Membran, ist in dieser Domäne auch die Signalsequenz für die Translokation des naszierenden Proteins in das ER enthalten (HUNZIKER et al. 1986). Aufgrund dieser Eigenschaften wird die SI zu den Typ-II Membranproteinen gezählt (BLOBEL 1980).
Abbildung 3: Der Aminoterminus (N) befindet sich am zytoplasmatischen Teil des Proteins, das carboxyterminale Ende des Peptids (C) ist zum Lumen des Darmkanals gerichtet (Typ-II-Membranprotein)
Zwischen der Isomaltase-Untereinheit und der Saccharase-Untereinheit, die mit Ile 1008 beginnt, befindet sich eine Spaltungsstelle für Trypsin, an der das reife SI-Molekül im Darmlumen gespalten wird, wobei beide Untereinheiten anschließend durch ionische Wechselwirkungen miteinander verbunden bleiben.
Der zytoplasmatische Teil besteht aus 12 Aminosäuren (AS) und verfügt über einen konservierten Serin-Rest (Ser6) .
An die Membranankerdomäne schließt sich C-terminal eine Serin/Threonin-reiche Region (Stabregion) an (HUNZIKER et al. 1986), die stark O-glykosyliert ist und zur Isomaltase- Untereinheit gerechnet wird (HAURI et al. 1985). Vergleicht man die aus der m-RNA abgeleitete Aminosäuresequenz der Saccharase mit derjenigen der Isomaltase-Einheit, ist eine starke Homologie erkennbar, die auf eine partielle Genduplikation hinweisen könnte
Stabdomäne
C I S
Trypsinspaltungsstelle Arg1007/Ile1008
N
extrazellulärer Raum/ Lumen des Darmkanals
Intrazellulärer Raum
(HUNZIKER et al. 1986; NAIM et al. 1991b). Das Vorläuferpeptid (pro-SI) wird im Darmlumen in die beiden Untereinheiten Saccharase und Isomaltase gespalten. Die Spaltung der humanen SI erfolgt zwischen Arginin 1007 und Leucin 1008 nach Einwirkung von Trypsin (HAURI et al. 1985), jedoch bleiben beide Untereinheiten durch ionische Wechselwirkungen miteinander verbunden (NAIM et al. 1988b). Mittels monoklonaler Antikörper gegen SI (HAURI et al. 1985) konnte in Organkulturen aus menschlichem Darm die Biosynthese der Saccharase-Isomaltase studiert werden (NAIM et al. 1988a). Dabei wurde als erste Form der SI der mannosereiche Vorläufer (pro-SIh) im ER mit einem Molekulargewicht von ca. 210 kDa beschrieben. Diese Form wird relativ langsam (T1/2 ca.75 min) vom ER zum Golgi Apparat transportiert (HAURI et al. 1985; NAIM et al. 1988b), ohne vorher Dimere zu bilden, wie dies bei vielen Proteinen üblich ist. Aufgrund der beschriebenen starken Homologie zwischen Saccharase und Isomaltase könnte allerdings die Pseudodimerisierung, also eine Aneinanderlagerung der Isomaltase- und der Saccharase- Untereinheit der SI denkbar sein. Im Golgi-Apparat erfolgt die Prozessierung des mannosereichen, N-glykosylierten Vorläufers zum komplexen N-glykosylierten Molekül.
Die O-Glykosylierung erfolgt im Bereich des cis-Golgi, setzt aber erst nach dem Trimmen der Oligosaccharidseitenkette durch die Mannosidase I ein. Da sowohl der korrekte Transport zur apikalen Membran (ALFALAH et al. 1999) als auch die Aktivität der Isomaltase- Untereinheit stark von der vollständigen und korrekten O-Glykosylierung abhängen, ist die erfolgreiche komplexe N-Glykosylierung für das „targeting“ und die Funktion des Proteins erforderlich. Sowohl bei der Saccharase- wie auch bei der Isomaltase-Untereinheit ist eine O- Glykosylierung nachweisbar. Dabei sind vier verschiedene O-Glykosylierungsmuster der Saccharase gefunden worden, das Muster der Isomaltase-Untereinheit ist hingegen gleichmäßig stark ausgeprägt. Hauptsächlich jedoch findet die O-Glykosylierung an der Ser/Thr-reichen sogenannten Stabregion der Isomaltase-Untereinheit statt. Die Rolle von O- Glykanen als Sortiersignal wurde im heterologen Zellsystem für Neutrophin-Rezeptoren nachgewiesen (YEAMAN et al. 1997). Erstmals konnte anhand der SI in Caco-2-Zellen an einem endogen exprimierten Protein die Rolle der O-Glykane als Sortiersignal in Assoziation mit Lipidmikrodomänen (sog. „rafts“) (ALFALAH et al. 1999) für die Sortierung des Proteins an die apikale Zellmembran nachgewiesen werden (ALFALAH et al. 1999). Dazu wurde ein Konstrukt der SI mit deletierter Stabregion hergestellt und der Transport in polaren
Zellen studiert. In einem anderen Versuchsansatz wurde mit dem Inhibitor Fumonisin die Assoziation der Mikrodomänen verhindert und der Transport der endogenen SI studiert. Beide Experimente führten zu einer zufälligen Verteilung, so daß die Existenz eines koppelnden Rezeptors zwischen Mikrodomänen und O-Glykanen der Stabregion angenommen werden kann (NAIM 2001).
1.9 Enzymdefizienzen und Phänotypen der Congenitalen Saccharase- Isomaltase-Defizienz (CSID)
Im Gegensatz zur Laktase, deren Aktivität bei den Säugern um die Geburt herum und während der Säugung am höchsten ist und anschließend bis zu 90% abfällt, ist bei der Saccharase eine Zunahme ihrer Aktivität ab der Entwöhnung bis zum Erwachsenenalter zu beobachten (KRETCHMER 1989). Obwohl die Regulation der Saccharase-Isomaltase- Aktivität ein transkriptionales Ereignis ist, das mehrere SI- und Intestinum-spezifische nukleäre Faktoren erfordert (TRABER u. SILBERG 1996; WU et al. 1994), beruhen die seltenen bisher beobachteten Formen von Enzymdefizienzen auf einer beeinträchtigten oder fehlerhaften Prozessierung des Proteins und nicht auf einer Beeinträchtigung seiner Expression (NAIM et al. 1988a). So auch bei der autosomal-rezessiv vererbten Saccharase- Isomaltase-Defizienz, die bei den betroffenen Patienten nach Aufnahme von Di- und Polysacchariden eine osmotisch-fermentative Diarrhoe verursacht (TREEM 1995).
Während bei dieser Erkrankung die Aktivität der Saccharase ganz eingeschränkt ist, waren bei einigen Patienten die Werte der Isomaltase-Aktivität im Normbereich. Aufgrund der beobachteten unterschiedlichen Pathogenese, z.B. Block der SI im Bereich des Golgi- Apparates oder korrekt lokalisiertes, aber inaktives Protein, sind mehrere Phänotypen dieser Erkrankung beschrieben worden.
Mitochondrium
Peroxisom
Freie Ribosomen
Endosom Lysosom Golgi Apparat
Zytoplasma
Rauhes Endoplasmatisches Retikulum
Kern
Basolaterale Membran Apikale Membran
1 2 3
4
5 6
Abbildung 4: Phänotypen der Congenitalen Saccharase-Isomaltase-Defizienz (CSID)
1 ER-Block; 2 Golgi-Block; 3 Inaktives Enzym; 4 Fehlsortierung zur basolateralen Membran;
5 Abnorme intrazelluläre Spaltung; 6 lösliches Protein. Abb. modifiziert nach KUCHEL u.
RALSTON (1988)
Mittels Untersuchungen der SI auf subzellulärer und molekularer Ebene von Patienten, die an dieser Erkrankung leiden, konnten sechs verschiedene Phänotypen der CSID (FRANSEN et al. 1991; JACOB et al. 2000; NAIM et al. 1988a) identifiziert werden, die biochemisch charakterisiert worden sind (Abb. 3):
Beim Phänotyp I erlangt der mannosereich glykosylierte Vorläufer keine Transportkompetenz, akkumuliert im ER und wird schließlich abgebaut.
Phänotyp II ist charkterisiert durch eine Retention der pro-SI im ER/cis-Golgi intermediären Kompartiment (ERGIC), im cis- und im trans-Golgi Netzwerk.
Auch Phänotyp III ist enzymatisch inaktiv, obwohl in diesem Fall das Protein an die apikale Zelloberfläche gelangt, es also normal transportiert und sortiert wird.
Eine zufällige Sortierung des teilweise falsch gefalteten Proteins wird beim Phänotypen IV beobachtet, so daß das Enzym nicht ausschließlich zur apikalen, sondern auch zur basolateralen Membran sortiert wird (SPODSBERG et al. 2001).
Beim Phänotypen V führt eine abnorme intrazelluläre Spaltung des Enzymkomplexes in seine beiden Untereinheiten zur Degradation der Saccharase, wohingegen die Isomaltase korrekt nach apikal sortiert wird.
Kürzlich wurde ein weiterer Fall der CSID beschrieben, bei der durch Spaltung eine sekretorische Form der ansonsten membrangebundenen Form des Proteins entsteht (JACOB et al. 2000).
Da translatierte Produkte entstanden sind, wurden als Ursachen dieser Phänotypen Punktmutationen oder kleinere Deletionen oder Insertionen innerhalb des Leserahmens angenommen.
Die Ergründung der molekularen Hintergründe dieser Erkrankung sind nicht nur aus klinischer Sicht interessant, vielmehr liefern diese natürlichen Modelle wichtige Aussagen hinsichtlich bisher noch unzureichend charakterisierter funktioneller Domänen der SI und ermöglichen daher eine weitere Aufklärung des zellulären Transports.
Ein Glutamin zu Prolin-Austausch an Aminosäureposition 1098 (Q1098P) in der Aminosäuresequenz der SI eines Patienten konnte als Ursache des Phänotypen II der CSID durch Untersuchung einer Darmbiopsie bestätigt werden, bei dem die mannosereich glykosylierte pro-SI im cis-Golgi und ER/Golgi-intermediären Kompartiment (ERGIC) akkumuliert (MOOLENAAR et al. 1997). Die elektronenmikroskopische und biochemische Beobachtung eines solchen Phänotypen, der eine Akkumulation eines Proteins in einem Kompartiment beschreibt, welches entlang des sekretorischen Weges hinter dem ER gelegen ist, läßt vermuten, daß neben dem Qualitätskontrollsystem des ER eine weitere Maschinerie zur Kontrolle von Proteinen nach dem ER und vor dem Golgi-Apparat vorhanden sein muß.
Die Tatsache, daß diese Q1098P Mutante nicht vom Qualitätskontrollsystem des ER erkannt wird, läßt die Frage aufkommen, ob dieses hypothetische System ein Protein genauer
untersucht als das bisher bekannte Kontrollsystem oder ob andere Erkennungsmerkmale oder anders arbeitende Faltungssensoren an der Signalisierung von Fehlfaltungen beteiligt sind.
Durch Expression dieser Mutante in COS-1 Zellen, die nicht-intestinaler Herkunft sind, konnte einerseits demonstriert werden, daß die Mutation an sich Ursache der Retention ist und andererseits, daß mögliche Faltungssensoren des hypothetischen Kontrollsystems nicht auf Zellen des Darmes beschränkt sind.
Ein weiterer Phänotyp, bei dem die strikte Sortierung der Saccharase-Isomaltase an die apikale Bürstensaummembran aufgehoben scheint und es vielmehr zu einer zufälligen Sortierung an die apikale und basolaterale Zelloberfläche kommt, konnte ebenfalls auf einen Aminosäureaustausch zurückgeführt werden (SPODSBERG et al. 2001). Dieser Austausch von Glutamin zu Arginin an Position 117 der Polypeptidkette zeigt, daß eine einzige, an einer bestimmten Stelle ausgetauschte Aminosäure eine korrekte Sortierung verhindern kann. Somit scheint diese Stelle in der Peptidkette Teil einer noch unbekannten Domäne zu sein, die wichtige Aufgaben im Bereich der Sortierung der SI übernimmt.
Dieser natürlich vorkommende Phänotyp (Phänotyp IV) bekräftigt die Hypothese, daß für die apikale Sortierung der SI, die von der Assoziation O-gebundener Glykane mit Lipidmikrodomänen abhängig ist, ein dazwischengeschaltetes Molekül existieren muß, welches diese Assoziation vermittelt. Kann diese Erkennung zwischen SI und Vermittler nicht stattfinden, kommt es nach diesem Modell wie im Falle des Phänotypen IV zu einem zufälligen Weitertransport des Proteins sowohl an die apikale wie auch an die basolaterale Zelloberfläche.
Auch ohne Untersuchung der genetischen Information der veränderten SI liefert uns die Beobachtung von Phänotyp V wichtige Informationen über das apikale Sortiersignal der SI.
Da bei diesem Phänotypen die Isomaltase-Untereinheit die apikale Membran im Alleingang erreicht, die Saccharase-Untereinheit aber degradiert wird, ist die Transportkompetenz der Isomaltase-Untereinheit für sich alleine nachgewiesen. Allerdings findet die Spaltung in die beiden Untereinheiten erst im Golgi-Apparat statt, so daß dieser Phänotyp nicht klärt, ob die Isomaltase in der Lage ist, alleine das Qualitätskontrollsystem des ER zu passieren oder ob bis zum Austritt aus dem ER die Saccharase für den Transport eine wichtige Rolle übernimmt.
Beim Phänotypen VI der CSID kommt es durch Spaltung der Saccharase-Isomaltase zur Bildung einer sekretorischen anstatt einer membrangebundenen Form des Proteins. Auch in diesem Fall war eine Punktmutation der Auslöser für eine Änderung einer Aminosäure in der Polypeptidkette (JACOB et al. 2000). Anhand dieses Phänotypen der CSID konnte zum ersten Mal eine Erkrankung beschrieben werden, bei der der Pathomechanismus darauf beruht, daß ein membrangebundenes Protein durch einen Aminosäureaustausch in ein lösliches Protein umgewandelt wird.
Zielsetzung dieser Arbeit war die Aufklärung der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen eines Phänotypen der CSID, bei dem durch biochemische Charakterisierung bereits vermutet wurde, daß der mannosereich glykosylierte Vorläufer der Saccharase- Isomaltase (SI) keine Transportkompetenz erlangt, im ER akkumuliert und schließlich abgebaut wird.
2. Material und Methoden
2.1. Material
Allgemein gebräuchliche Reagenzien waren mindestens von p.a.-Qualität und wurden von den Firmen Fluka, Merck, Riedel-de-Haen, Serva oder Sigma bezogen. Sämtliches für molekularbiologische Arbeiten verwendete Material wurde autoklaviert bzw. sterilfiltriert.
Glasgeräte und Glaspipetten, die in der Bakterien- oder Zellkultur eingesetzt wurden, waren vor dem Gebrauch sterilisiert worden.
2.1.1. Biopsien aus humaner Darmschleimhaut
CSID wurde bei einem Patienten mit fermentativer Diarrhoe nach Durchführung eines H2- Atemtests vermutet. Diesem Patienten wurden peroral Saugbiopsien für die RNA Präparation und für die elektronenmikroskopische Untersuchung aus dem Bereich des oberen Jejunums entnommen und sofort in flüssigem Stickstoff gelagert. Zwei weitere Biopsien wurden für die biochemische Untersuchung der SI und weiterer interner Markerproteine entnommen, sofort in Kulturmedium ohne L-Methionin unter Zusatz von Methionin-freiem Fetalen Kälberserum verbracht und 2 h bei 37°C unter Carbogen-Atmosphäre inkubiert. Die Biopsien für die biochemische Untersuchung der SI wurden unverzüglich bearbeitet, die übrigen Biopsien wurden bis zu ihrer Aufarbeitung bei -80°C gelagert.
2.1.2. Reagenzien für die cDNA-Isolierung
Zur Isolierung der cDNA aus Darmbiopsien, erfolgte die Aufreinigung der Gesamt-RNA nach der Guanidinisothiocyanat-Methode (modifiziert), wobei zum Homogenisieren der Biopsie und dem Lysieren der Zellen der Lysis/Binding-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.5;
500 mM LiCl; 10 mM EDTA, pH 8.0; 1% LiDS; 5 mM Dithiothreitol (DTT) ) aus dem Dynabeads Oligo (dT) Kit® (Dynal, Oslo, Norwegen) verwendet wurde.
Die cDNA Synthese erfolgte mit dem First Strand cDNA Synthesis Kit® von MBI Fermentas (Litauen). Folgende Reagenzien wurden verwendet:
M-MuLV Reverse Transcriptase, 20 u/µl in 50mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton® X-100 und 50% Glyzerin gelagert;
Ribonuklease Inhibitor, 20 u/µl in 20 mM HEPES-NaOH (pH 7.5), 50 mM NaCl, 8 mM DTT, 0.5 mM ELUGENT® Detergens und 50% Glyzerin gelagert;
5X Reaktions-Puffer: 250 mM Tris-HCl (pH 8.3 bei 25°C), 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT; 10 mM dNTP Mix (10 mM wässriger Lösung von dGTP, dATP, dTTP und dCTP);
Random Hexamer Primer:
0.2 µg/µl (6A260 units/ml) in wässriger Lösung sowie deionisiertes und nukleasefreies DEPC-Wasser.
2.1.3. Oligonukleotide zur Amplifizierung der Patienten cDNA
Zur Vervielfältigung der Patienten cDNA mittels PCR wurden sieben Oligonukleotid-Paare verwendet (OUWENDIJK et al. 1996).
DNA Fragment (bp) Primer (5´? 3´)
29-695 CCGGGTACCAGCCTTATCCAAGTCTG
TGAGATCTGTAAGTACTGGTCA
652-1366 GCATTGGTCCCTTAGTGTAC
ATCCACACATGTTGTGTGTT
1299-2066 ATAGGTCGACGTGCCAATGG
CTGCCTTGATGATTTAACCA
1952-3139 GATGCAACTTGGGGCATTT GGTACTTCATATCTCTTCTT
2967-4201 GCTCGCTATTCATCCATGGG
GATGGCTCATTCATATCAAT
4071-4923 TCCAGAGCTCATGTAGCTTTC
GTACTGGGGTAACCATAAATGCT
4876-5555 TATTCAAGCAGTTCTTATGG
TGTAAGTGCTGTGAAACTT
Tabelle 1: Oligonukleotide zur cDNA-Amplifikation
Oligonukleotid-Primer wurden in deionisiertem Wasser so aufgenommen, daß sie eine Konzentration von 100 pmol/µl hatten. Anschließend wurden Aliquots mit der Gebrauchskonzentration 20 pmol/µl hergestellt.
2.1.4. Reagenzien für die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und für die Klonierung in einen Vektor
Für die Durchführung der PCR wurde die Taq®-Polymerase von Eppendorf® (5 U/µl) benutzt. Sie wurde in einem Aufbewahrungspuffer geliefert, der aus 20 mM Tris-HCL pH 8,0 (bei 25°C); 100 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50% Glyzerin und 0,5% Tween 20 besteht. Die Reaktionen fanden im Reaktionspuffer statt, der als 10x Konzentrat geliefert wurde: 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl pH 8,0 (bei 25°C); 15 mM MgCl2
und 1% Triton- X-100.
In den Reaktionsansätzen wurden weiterhin eingesetzt: 10mM dNTP-Mix (10 mM wässriger Lösung von dGTP, dATP, dTTP und dCTP); Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation beider DNA-Stränge (20 pmol/µl); 25 mM MgCl2; deionisiertes Wasser und cDNA (20- 50 ng/µl).
Die Klonierung der PCR-Fragmente erfolgte in den TA-pCR 2.1® Vektor von Invitrogen (Groningen, Niederlande). Aus dem Kit wurden für die Klonierungen folgende Reagenzien verwendet:
linearisierter pCR2.1-Vektor (25 ng/µl in Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 7,5);
10x Ligationspuffer (60 mM Tris-HCl, pH 7,5; 60 mM MgCl2; 50 mM NaCl2; 1mg/ml Rinderserum; 70 mM ß-Mercaptoethanol; 1 mM ATP; 20 mM Dithiothreitol;
10 mM Spermidin)
T4-Ligase (4,0 Weiss Units/µl) und steriles Wasser.
2.1.5. Chemisch kompetente Bakterien
Chemisch kompetente E.coli-Bakterien (TOP 10 und TOP 10 F´) wurden von Invitrogen (Groningen, Niederlande) bezogen.
E.coli TOP 10:
F-mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) ? 80lacZ?M15 ?lacX74recA1 deoR araD139 ?(ara- leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
E.coli TOP 10F´:
F- ?lacIqTn10 (TetR)? mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) ? 80lacZ?M15 ?lacX74recA1 deoR araD139 ?(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
2.1.6. Bakteriennährmedien
LB (Luria-Bertani) Medium: 1% Bacto-Trypton (DIFCO), 0,5% Bacto-Hefe-Extrakt (DIFCO), 1% NaCl. Zur Selektion wurde dem Medium ein entsprechendes Selektionsantibiotikum (50µg/ml Ampicillin bzw. 50µg/ml Kanamycin) zugefügt. Für die Herstellung fester Nährböden wurde 1,5% Agar zugesetzt.
2.1.7. Lösungen für Plasmidpräparationen
Folgende Lösungen wurden für Plasmidpräparationen nach der Methode der alkalischen Lyse hergestellt und verwendet:
Lösung 1
25 mM Tris-HCl (pH 8.0) ; 10 mM EDTA (pH 8.0)
Lösung 2
0,2 N NaOH; 1% SDS
Lösung 2 wurde zum Zeitpunkt des Gebrauches jeweils frisch hergestellt und bei Raumtemperatur belassen.
Lösung 3
5 M Kaliumacetat 60 ml; Eisessig 11,5 ml; H2O 28,5 ml
Die so hergestellte Lösung ist 3 M bezüglich des Kaliums und 5 M bezüglich des Acetat.
Die Lagerung von Lösung 1 und Lösung 3 erfolgte bei 4°C.
2.1.8. Größenstandard für DNA/Molekulargewichtsstandard für Proteine
DNA-Standard:
?- DNA: EcoRI/HindIII verdaut
Fragmentgrößen in Basenpaaren:
21226, 5148, 4973, 4268, 3530, 2027, 1904, 1584, 1375, 947, 831, 564, 125
(MBI Fermentas, Litauen)
Protein-Standard:
Protein Molekulargewicht (kDa)
Myosin, Kaninchenmuskel 205 kDa
?-Galactosidase, E. coli 116 kDa Phosphorylase b, Kaninchenmuskel 97,4 kDa
Albumin, Rind 66 kDa
Albumin, Ei 45 kDa
Carboanhydratase, Rindererythrozyten 29 kDa
Tabelle 2: Protein-Standard
Der Proteinstandard wurde von der Firma Sigma bezogen.
2.1.9. Reagenzien für die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese
Die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wurde nach Protokoll unter Verwendung von Pfu- Polymerase (2,5 U/µl) von Stratagene durchgeführt (SAMBROOK 2001). Im Reaktionsansatz wurden weiterhin verwendet:
10x Reaktionspuffer (100 mM KCl; 100 mM (NH4)2SO4; 200 mM Tris-HCl (pH 8,75);
20 mM MgSO4; 1% Triton-X-100 und 1000 mg/ml BSA),
10 mM dNTP-Mix (10 mM wässriger Lösung von dGTP, dATP, dTTP und dCTP);
Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation beider DNA-Stränge (25 pmol/µl); cDNA (100 ng/µl) und destilliertes Wasser (dH2O).
2.1.10. Oligonukleotide, die in der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese verwendet wurden
DNA Fragment (bp) Primer (5´? 3´)
677-708 TACTTACAGATATCAACCCGTCTTCCA
AGTG
708-677 CACTTGGAAGACGGGTTGATATCTGTA
AGTA
1848-1877 TAACTGGAATGCCGGAATTCAGTTTGT
TTG
1877-1848 CAAACAAACTGAATTCCGGCATTCCAG
TTA
2093-2129 TTCCTCTACACTCCGTTTTATAAAGCC
CACGTGTTTG
2129-2093 CAAACACGTGGGCTTTATAAAACGGA
GTGTAGAGGAA
Tabelle 3: Oligonukleotide für die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese
Das hervorgehobene Nukleotid führt zum Aminosäureaustausch. Nummerierung der Basen nach (GREEN et al. 1987a; GREEN et al. 1987b; LE BIVIC et al. 1991)
Oligonukleotid-Primer wurden in deionisiertem Wasser so aufgenommen, daß sie eine Konzentration von 100 pmol/µl hatten. Anschließend wurden Aliquots mit der Gebrauchskonzentration 20 pmol/µl hergestellt.
2.1.11. Plasmide
Für die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wurden folgende Plasmide eingesetzt:
-phSI (MOOLENAAR et al. 1997)
komplette humane Saccharase-Isomaltase im Plasmidvektor pSG8
-SI-YFP (JACOB u. NAIM 2001a)
komplette humane Saccharase-Isomaltase im Plasmidvektor YFP-C1
Das Gelb Fluoreszierende Protein (YFP) ist eine Variante des GFP und dient als Reporterprotein.
2.1.12. Zelllinien
COS-1-Zellen
Fibroblastenähnliche, unpolare Nieren-Zelllinie, die durch Transformation von CV-1-Zellen der Affenart Cercopithecus aethiops mit einer origin-defekten SV 40-Virus Mutante, die das Wildtyp T-Antigen exprimiert, hergestellt worden ist (GLUTZMAN 1981).
(American Type Culture Collection; Rockeville, USA)
CHO-Zellen
Ausgang dieser epithelialen Zelllinie war eine Biopsie eines Ovars vom Chinesischen Hamster (Cricetulus griseus) von PUCK et al. (1958).
(American Type Culture Collection; Rockeville, USA)
2.1.13. Kulturmedium für Säugerzellen
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) low glucose, flüssig
1 g/l Glucose, 10% fetales Kälberserum (FKS), 292 mg/l L-Glutamin, 110 mg/l Natriumpyruvat, 50.000 U/l Penicillin und 10 mg/l Streptomycin
DMEM wurde zur Kultivierung von COS-1-Zellen verwendet.
Minimum Essential Medium (MEM) ohne Methionin, flüssig
1 g/l Glucose, 2% fetales Kälberserum (FKS), 292 mg/l L-Glutamin, 50.000 U/l Penicillin und 10 mg/l Streptomycin)
MEM wurde zur Inkubation von Zellen vor der biosynthetischen Markierung mit S35- Methionin benutzt.
Alle Produkte von Gibco, Berlin
2.1.14. Reagenzien, die in der Zellkultur eingesetzt wurden Trypsin/EDTA
Die Gebrauchslösung enthielt 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS).
DEAE-Dextran:
Die Gebrauchslösung hatte eine Konzentration von 50 mg DEAE-Dextran/ml dH20 . Chloroquin:
Die Gebrauchslösung hatte eine Konzentration von 50 mg Chloroquin/ml dH2O.
2.1.15. Antikörper
Vier monoklonale epitopspezifische Antikörper (AK) gegen Saccharase, Isomaltase oder pro- SI wurden zur Immunpräzipitation verwendet (HAURI et al. 1985). Diese präzipitieren die mannosereich glykosylierte (pro-SIh) und die komplex glykosylierte Form (pro-SIc) der pro- SI. Die Produkte der Hybridomazellen HBB 1/691, HBB 2/614 und HBB 2/219 sowie HBB 3/705 wurden uns freundlicherweise von Prof. Dr. H.P. Hauri (Biozentrum Basel, Schweiz) und von Prof. Dr. E.E. Sterchi (Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Universität Bern, Schweiz) zur Verfügung gestellt.
Folgender AK-Mix wurde verwendet, von dem pro Immunpräzipitation (IP) 2µl eingesetzt wurden:
Antikörper Menge in µl
Glu 2 5
691 5
705 5
Glu 3 5
PBS 80
Gesamt 100
Tabelle 4: SI-Antikörper-Mix
2.1.16. Puffer und Protease-Inhibitoren, die bei Immunpräzipitationen verwendet wurden
Standard-Lysis-Puffer 25 mM Tris-HCl pH 8,0 50 mM NaCl
0,5% DOC
0,5% Triton-X-100
Protease-Inhibitoren 1 mM PMSF
1 µg/ml Pepstatin 1 µg/ml Aprotinin 5 µg/ml Antipain 5 µg/ml Leupeptin
100 µg/ml Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor
Waschpuffer I 0,5% Triton-X-100
0,005% Na-Desoxycholat in PBS
Waschpuffer II 500 mM NaCl 0,5% Triton-X-100 10 mM EDTA
125 mM Tris/HCl pH 8,0
