4.1.1 Struktur und Eigenschaften ...9

Fusarientoxine am Beispiel der drei Hauptgruppen:

Trichothecene, Zearalenon, Fumonisine

Abschlussarbeit

Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz der Universität Leipzig

Birgit Kehl (Lebensmittelchemikerin) Simonswald, den 06. März 2005

1 Inhaltsverzeichnis

1 Inhaltsverzeichnis...2

2 Einleitung ...4

3 Vorkommen allgemein (Unterschied Feldpilze zu Lagerpilze)...6

4 Fusarientoxine allgemein...8

4.1 Trichothecene ...9

4.1.1 Struktur und Eigenschaften ...9

4.1.2 Bildner ... 12

4.1.3 Biosynthese...12

4.1.4 Vorkommen ... 14

4.1.5 Bildungsbedingungen...16

4.1.6 Gegenmaßnahmen...16

4.1.7 Toxizitäts-Daten... 17

4.1.8 Krankheitsbilder...25

4.1.9 Wirkungsmechanismen (Biotransformation) ... 27

4.1.10 Gesetzliche Grundlagen ...29

4.1.11 Analytische Nachweismethoden (Übersicht) ...30

4.2 Zearalenon... 31

4.2.1 Struktur und Eigenschaften ... 31

4.2.2 Bildner ... 33

4.2.3 Biosynthese...33

4.2.4 Vorkommen ... 34

4.2.5 Bildungsbedingungen...35

4.2.6 Gegenmaßnahmen...36

4.2.7 Toxizitäts-Daten... 37

4.2.8 Krankheitsbilder...41

4.2.9 Wirkungsmechanismen (Biotransformation) ... 43

4.2.10 Gesetzliche Grundlagen ...47

4.2.11 Analytische Nachweismethoden (Übersicht) ...48

4.3 Fumonisine ... 49

4.3.1 Struktur und Eigenschaften ... 49

4.3.2 Bildner ... 50

4.3.3 Biosynthese...50

4.3.4 Vorkommen ... 51

4.3.5 Bildungsbedingungen...53

4.3.6 Gegenmaßnahmen...53

4.3.7 Toxizitäts-Daten... 54

4.3.8 Krankheitsbilder...60

4.3.9 Wirkungsmechanismen (Biotransformation) ... 61

4.3.10 Gesetzliche Grundlagen ...65

4.3.11 Analytische Nachweismethoden (Übersicht) ...66

5 Zusammenfassung ...67

6 Ausblick...68

7 Literatur ...70

2 Einleitung

Im Zusammenhang mit immer höheren Ansprüchen der Verbraucher an die Lebensmittel steigen auch die Anforderungen an die Lebensmittelindustrie. Diese kann den steigenden Qualitätsansprüchen dadurch standhalten, dass laufend technologische Neuerungen die Qualität der Lebensmittel verbessern. Die Qualität von Lebensmitteln ist von vielen Faktoren abhängig, z.B. von

• der Qualität der benötigten Rohstoffe,

• den Prozessbedingungen bei der Herstellung,

• den hygienischen Bedingungen im Betrieb,

• der Personalhygiene,

• der Art der Verpackung

• dem Weg des Lebensmittels vom Produzent zum Konsument.

Das Ziel der produzierenden Landwirtschaft und der Lebensmittelindustrie ist es, einwandfreie Lebensmittel zu produzieren. Hierunter fällt auch die Hygiene der Lebensmittel.

Hygienemängel rufen heute in der Öffentlichkeit wesentlich stärkere Reaktionen der Verbraucher hervor, als dies Qualitätsmängel tun. Trotzdem lassen sich Lebensmittelhygiene und Lebensmittelqualität nicht voneinander trennen.

Hieraus resultieren immer weiterreichendere Untersuchungen der Rohstoffe sowie der halbfertigen und der fertigen Ware. Dies gilt mit steigendem Maße auch für Futtermittel, die ebenfalls zunehmend durch Verordnungen und Gesetze geregelt werden, da auch sie letztendlich Auswirkungen auf Lebensmittel besitzen. Einen sehr wichtigen Aspekt vor allem in Bezug auf den Verbraucherschutz stellt die Gruppe der Mykotoxine dar.

Mykotoxine sind sekundäre Stoffwechselprodukte von Pilzen, die in sehr geringen Dosen für Mensch, Tier oder Pflanze, aber nicht für den sie bildenden Mikroorganismus selbst giftig sind. Neben den Mykotoxinen können Pilze noch weitere sekundäre Metaboliten produzieren. Dazu gehören organische Verbindungen, wie z.B. Antibiotika, organische Lösungsmittel und andere Fermentationsprodukte, welche für den Menschen nützlich sind.

Den stärksten Aufschwung nahm die Mykotoxinforschung erst im Jahr 1960 mit der Entdeckung der Aflatoxine. Seitdem wurden auf diesem Gebiet viele Entdeckungen gemacht. Heute sind mehr als 300 chemisch verschiedenartige Mykotoxine bekannt, die unterschiedliche Wirkungen auf Menschen und Säugetiere zeigen (MÜLLER und WEBER, 1996).

Um die Gesundheit der Menschen zu schützen, steht daher die Festsetzung von Grenzwerten für Mykotoxine im Vordergrund, die aus toxikologischer, analytischer und gesetzgeberischer Sicht für Lebensmittel und Tierfutter sinnvoll sind. Darüberhinaus ist in Lebens- und Futtermitteln ein möglichst niedriger Keimgehalt an Schimmelpilzen anzustreben, da in der Regel gemischte Infektionen durch toxinbildende Mikroorganismen auftreten, also mehrere Toxine nebeneinander vorkommen können, deren additive und synergistische Wirkung oft nicht bekannt ist. Jedoch sind nicht alle Isolate einer potentiell toxinogenen Schimmelpilzart zur Bildung des betreffenden giftigen Stoffwechselproduktes fähig. Auch ist das Toxin oft persistenter als der Schimmelpilz, so dass auch hygienisch einwandfreie Ware kontaminiert sein kann.

Die Kontamination von Lebensmitteln mit Mykotoxinen kann auf drei Wegen geschehen (MÜLLER und WEBER, 1996):

1. Die Lebensmittel werden direkt von mykotoxinbildenden Schimmelpilzen befallen, und die Mykotoxine werden direkt auf diesen gebildet. Meist ist dabei Pilzbefall sichtbar.

2. Mykotoxinhaltige Rohstoffe und Zwischenprodukte werden zu Lebensmitteln verarbeitet. An letzteren ist kein Pilzbefall erkennbar.

3. Durch Carry-over gelangen Mykotoxine aus toxinhaltigen Futtermitteln zunächst in die Nutztiere, wo sie teilweise in der Leber, den Nieren, etc. abgelagert werden; oder sie werden mit der Milch, Fleisch, Eiern übertragen.

Abbildung 1

aus SMITH und MOSS (1985): Faktoren, welche das Auftreten von Mykotoxinen in Lebens- und Futtermitteln beeinflussen.

3 Vorkommen allgemein (Unterschied Feldpilze zu Lagerpilze)

Je nach Art des Pilzes befällt dieser in Form von Pilzsporen das Getreide entweder erst bei der Lagerung oder aber bereits auf dem Feld. Zu den sogenannten Feldpilzen gehören die Gattungen Alternaria, Cladosporium, Fusarium, Epicoccum, Helminthosporium und Pulluaria. Diese Organismen benötigen zu ihrem Wachstum einen hohen Wassergehalt (24-25%) des Substrates. Da die Getreidekörner nach der Ernte bei verminderter Feuchtigkeit gelagert werden, sinkt ihr Feuchtigkeitsgehalt unter das Wachstumsminimum, so dass die Feldpilze in der Regel nach der Ernte in den Getreidekörnern nicht mehr wachsen können. Da die oben angeführten Pilze in erster Linie die Getreidekörner auf den Pflanzen im Feld befallen, können sie Getreide, dass erst einmal getrocknet war und anschließend wieder befeuchtet wurde, von neuem besiedeln. Die Sporen der Feldpilze

können über Jahre hinweg auf Getreide überleben, das bei geringer Feuchtigkeit gelagert wird (REISS, 1981c).

Im Gegensatz dazu stehen die Lagerpilze, welche die Getreidekörner erst nach der Ernte befallen und die Feldpilze dann verdrängen. Sie bevorzugen Substrate mit geringer Feuchtigkeit und können bereits bei einer Getreidefeuchte von 13,5% auftreten. Zu dieser Pilzgruppe gehören Aspergillus-Arten sowie seltener Penicillium-Arten. Daneben können Vertreter der Mucorales auftreten. Auch vor der Ernte sind Lagerpilze auf dem Getreide nachzuweisen, doch entweder als ungekeimte Sporen bzw. Konidien oder als ruhendes Mycel in äußeren Zellschichten. Die von den Lagerpilzen hervorgerufenen Schäden an Getreidekörnern sind: verminderte Keimfähigkeit, Verfärbungen oder andersartige Schädigungen des Embryos, Kontamination mit Toxinen, die bei Mensch und Tier Schäden hervorrufen können (REISS, 1981c).

Jedoch sind nicht in allen Anbauregionen die gleichen Mykotoxine aktuell. Aspergillus flavus kommt hauptsächlich in wärmeren Klimazonen vor, während Fusarien in den gemäßigten Klimazonen in den Vordergrund treten. In Deutschland wird Getreide in der Regel erst mit der Totreife geerntet, d.h. die Körner besitzen einen Feuchtigkeitsgehalt unter 10%. Unter diesen Bedingungen kommt die typische Feldpilzflora nur auf dem Feld, insbesondere auf der abreifenden Pflanze, vor. Fusarien benötigen einen hohen Wassergehalt im Substrat. Daher schwächt sich das Wachstum nach der Ernte entsprechend dem Wasserverlust der Körner ab. Es treten dann vermehrt typische Lagerpilze wie Penicillium- und Aspergillusarten hervor.

Bleibt das Getreide bis zur Totreife auf dem Feld, dann sind die Körner bei feuchter Witterung besonders anfällig gegen Verpilzung. Getreide aus feuchten Jahren ist deutlich höher mit Fusarientoxinen belastet, als Getreide aus trockeneren Jahren. In Skandinavien wird Getreide mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 20-30% geerntet und muß daher anschließend getrocknet werden. Hier wachsen Feldpilze auch auf dem Lager. In südlichen Regionen dagegen können typische Lagerpilze die Körner schon auf dem Feld befallen (LEW, 1995). Eine klare Trennung von Feld- und Lagerpilzen ist somit nicht möglich, die Übergänge sind fließend.

Seit den 70er Jahren hat der Befall von Weizen mit Fusarienarten zugenommen.

Diese Ausbreitung wurde durch eine Intensivierung und Rationalisierung der Landwirtschaft und eine Einschränkung der Fruchtfolge, z.B. eine Ausdehnung des Maisanbaus gefördert, da es sich bei dem Erreger der Wurzel- und Stengelfäule des Maises zum Teil um die

Weitere Ursachen für ein verstärktes Auftreten von Getreidefusariosen in der letzten Zeit sind das Verbleiben von Ernterückständen auf dem Boden, eine stickstoffreiche Düngung, der verstärkte Einsatz von Wachstumsregulatoren und der Einsatz von Fungiziden, welche die Konkurrenzflora der Fusarien beseitigen und somit deren Wachstum fördern (DIEHL, 1989; LEW, 1995).

Futterpflanzen werden gegenüber einer Pilzkontamination insbesondere dann empfindlicher, wenn bereits Schädigungen durch Insekten, Wettereinflüsse, z.B. Hagelschlag, und mechanische Einflüsse während der Ernte und des Transportes stattgefunden haben (PIER et al., 1980; SCHUH, 1981).

Ein Fusarienbefall unterbricht beim Getreide die Nährstoffzufuhr zum Korn, da das Fusarienmycel die Ährenspindel durchwächst und dadurch den Assimilattransport unterbindet. Eine normale Kornausbildung wird auf diese Weise verhindert und es kommt zu Schmachtkörnern. Auch die Körner selbst können befallen werden, indem das Mycel entweder von den Spindeln ausgehend in das heranwachsende Korn vordringt, oder dadurch, dass mit der Verbreitung der Sporen eine Infektion der Körner von außen erfolgt (MEYER et al., 1986).

Toxinbildende Fusarienstämme kommen in unseren Breiten oft vor. Sie befallen das Getreide schon vor der Ernte. Kühles, feuchtes Herbstwetter und frühe Fröste mit anschließenden Schönwetterperioden sind günstige klimatische Voraussetzungen für den Feldbefall mit Fusarien. Die Verbreitung der Fusarium-Toxikose beim Schwein steigt beinahe parallel zum verstärkten Anbau der spät reifenden Hybridmaisarten an. Die Hybridmaisarten werden wegen ihres hohen Ertrages bevorzugt, besitzen aber eine viel längere Vegetationszeit, d.h. sie reifen auch später. Die Toxinproduktionen werden daher von Frösten und Schwankungen der Tages- und Nachttemperaturen im Frühherbst begünstigt (PALYUSIK, 1981; BARNIKOL, 1987). Die Bildung von Fusarientoxinen wird oft erst durch einen Kälteschock ausgelöst (ORTH, 1981).

4 Fusarientoxine allgemein

Mehr als 60 Fusarium Species mit weit über 100 toxischen Sekundärmetaboliten wurden inzwischen identifiziert (NIJS et al., 1996; FAO, 2001). Am bedeutendsten vom Standpunkt der menschlichen Exposition aus gesehen sind Deoxynivalenol (Vomitoxin), Zearalenon und die Fumonisine (WOOD et al., 2003). Interessant ist, dass die meisten der

toxinproduzierenden Fusarium-Spezies fähig sind, zwei oder mehrere verschieden Toxine zu bilden (ERIKSEN und ALEXANDER, 1998).

Die höchsten Fusarienkonzentrationen findet man auf den Randschichten des Getreides. Die Carry-over-Rate auf die verschiedenen Getreideprodukte wie Mehle und Teigwaren ist somit verschieden (KRÄMER, 1987; WAGNER, 1994).

Nach mehrjährigen Untersuchungen von Ernteproben aus Südwestdeutschland war Deoxynivalenol (DON) bei Weizen, Gerste und Hafer das mit Abstand am häufigsten auftretende Fusarientoxin, das auch die höchsten Gehalte im Getreide aufwies. Zearalenon trat in besonders feuchten Jahren (1987 und 1993) häufig auf. In Weizen und Weizenmehlen war das Zearalenon das zweithäufigste Toxin (DFG, 2001).

Da wie beschrieben Trichothecene (z.B. Deoxynivalenol), Zearalenon und die Fumonisine die wichtigsten Fusarientoxine vom Gesichtspunkt der menschlichen Exposition und der Gesetzgebung aus gesehen sind (WOOD et al., 2003), sollen diese in den folgenden Kapiteln vorgestellt werden.

4.1 Trichothecene

4.1.1 Struktur und Eigenschaften

Bis heute sind laut IPCS (1990) über 148 Trichothecene charakterisiert. Die auf der ganzen Welt am häufigsten angetroffenen Trichothecene in Futter- und Lebensmitteln sind das DON (Deoxynivalenol) und in geringerem Maße das Nivalenol als Kokontaminant (IPCS, 1990) sowie das T-2-Toxin. Letzteres und die makrocyclischen Mykotoxine sind wesentlich toxischer als DON und Nivalenol, jedoch werden sie auch weitaus seltener in Lebensmitteln aufgefunden (SCUDAMORE, 1998). Im folgenden Abschnitt wird hauptsächlich auf das DON eingegangen, da es das am häufigsten natürlich auftretende Trichothecen ist. Um einen Überblick über die Gruppe der Trichothecene zu erhalten, werden die Strukturen der wichtigsten Trichothecene kurz beschrieben.

1972 wurde DON erstmals in Japan von Morooka et al. aus mit Fusarium roseum infiziertem Getreide isoliert. DON wurde damals auch als Rd-Toxin (WEIDENBÖRNER, 2001) bezeichnet. 1973 wurde es als Vomitoxin in den USA beschrieben (WOLFF, 1995).

Trichothecene lassen sich aufgrund ihrer funktionellen Gruppen in vier Gruppen (A bis D) aufteilen (UENO et al., 1973; UENO, 1987b):

• Typ-A-Trichothecene: Sie stellen die größte Gruppe dar. Sie werden durch eine von einer Carbonylfunktion abweichende zumeist sauerstoffenthaltende Gruppe am C-8 charakterisiert (UENO, 1977). Beispiele: T-2-Toxin, HT-2-Toxin, Diacetoxyscirpenol, Neosolaniol und weitere. Die Toxizität der Typ-A-Trichothecene nimmt in der Reihenfolge Isovalerylgruppe > H-Atom > Hydroxylgruppe in der C-8-Position ab.

Generell sind die Typ-A-Trichothecene stärker toxisch als die Typ-B-Trichothecene, welche eine Carbonylgruppe an der C-8-Position aufweisen (BETINA, 1989;

FEINBERG & McLAUGHLIN, 1989).

Abbildung 2: Typ-A Trichothecen-Grundgerüst

Name R¹ R² R³ R⁴ R⁵

T-2 Toxin OH OAc OAc H OCOCH

CH(CH

)

HT-2 Toxin OH OH OAc H OCOCH

CH(CH

)

Diacetoxyscirpenol OH OAc OAc H H

Neosolaniol OH OAc OAc H OH

• Typ-B-Trichothecene: Sie sind durch die Gegenwart einer Carbonylfunktion in der C- 8-Position charakterisiert. Zu ihnen gehören Nivalenol, DON, 3- und 15-Acetyl-DON (beide sind Vorstufen von DON) und Fusarenon-X (Vorstufe von Nivalenol) (DFG, 2001). DON besitzt eine 12,13-Epoxidgruppe, 3 OH-Gruppen und eine α,β- ungesättigte Ketogruppe. Die genaue Bezeichnung von DON lautet 3α,7α,15- Trihydroxy-12,13-Epoxytrichothec-9-en-8-on (WEIDENBÖRNER, 2001). Die Toxizität der Typ-B-Trichothecene wird durch die Substituenten in der C-4-Position beeinflusst.

In Lymphozyten nimmt die Toxizität der Typ-B-Trichothecene in der Reihenfolge Acetylgruppe > Hydroxylgruppe > H-Atom in der C-4-Position ab (BETINA, 1989;

FEINBERG & McLAUGHLIN, 1989; FORSELL und PESTKA, 1985).

Abbildung 3: Typ-B Trichothecen-Grundgerüst

Name R¹ R² R³ R⁴

Deoxynivalenol OH H OH OH

Nivalenol OH OH OH OH

Fusarenon-X OH OAc OH OH

• Typ-C-Trichothecene: Diese Trichothecene enthalten ein zweites Epoxid am C7,8 oder C9,10. Beispiel: Crotocin, Baccharin (IPCS, 1990)

• Typ-D-Trichothecene: Hier handelt es sich um makrocyclische Trichothecene mit einem Ring zwischen dem C-4 und C-15 mit 2 Esterbindungen. Beispiel: Roridin A, Satratoxin H, Verrucarin A (IPCS, 1990).

Später fügte UENO (1987b) zwei weitere Gruppen zu dieser Klassifizierung hinzu:

• Typ-E-Trichothecene: Sie werden durch makrocyclische Trichothecene repräsentiert, bei denen der Ring geöffnet ist.

• Typ-F-Trichothecene: Hier wich die 12,13-Epoxidfunktion einer Vinylbindung. Es wird angenommen, dass diese Verbindungen Zwischenprodukte bei der Biosynthese der makrocyclischen Trichothecene darstellen. Beispiel: Verrucarin K.

Der 12,13-Epoxidring ist verantwortlich für die Toxizität der Trichothecene. Er ist essentiell für ihre biologische Aktivität. Die Deepoxidierung von DON zum Beispiel durch Mikroorganismen des Pansens resultiert in einem Verlust an Toxizität (KING et al., 1984).

Die meisten der Trichothecene besitzen auch eine Doppelbindung am C9,10, welche für die Toxizität ebenfalls von Bedeutung ist (EHRLICH und DAIGLE, 1987).

Zu den Eigenschaften von DON:

Der Schmelzpunkt von DON liegt bei 151-153 °C, das relative Molekulargewicht beträgt 296,32 bei einer Summenformel von C H O (YOSHIZAWA und MOROOKA, 1973; SCF,

1999). Die α,β-ungesättigte Ketogruppe absorbiert im ultravioletten Bereich Strahlung (218 nm), jedoch ist das UV-Spektrum von DON nicht charakteristisch. DON fluoresziert nicht.

Als Typ B -Trichothecen ist DON löslich in Wasser und in polaren Lösungsmitteln wie wässrigem Methanol, wässrigem Acetonitril und Ethylacetat. DON ist stabil in organischen Lösungsmitteln, jedoch eignen sich vor allem Ethylacetat und Acetonitril für eine längere Aufbewahrungszeit.

Freie Hydroxylgruppen werden schnell acyliert. Die 12,13-Epoxidgruppe ist bezüglich eines nucleophilen Angriffs sehr stabil (IPCS, 1990). DON ist stabil bei 120°C und wird unter milden sauren Bedingungen nicht zersetzt. Erst langes Kochen in Wasser oder unter stark sauren Bedingungen verändert das Aussehen der Skelettstruktur aufgrund einer Öffnung des Epoxidringes. Es kommt zu einer intramolekularen Umwandlung des Trichothecenskeletts zum Apo-Trichothecen-Ringsystem (UENO, 1987b).

4.1.2 Bildner

Zahlreiche Familien der imperfekten saprophytischen und pflanzenpathogenen Pilze, wie z. B. Fusarium, Trichothecium, Myrothecium, Cephalosporium, Stachybotrys, Trichoderma, Cylindrocarpon, Verticimonosporium spp. und höhere Pflanzen wie Baccharis produzieren Trichothecene (UENO, 1983; 1987b).

In unseren Breiten ist vor allem Fusarium roseum für die Bildung von DON verantwortlich (SPICHER, 1981), gefolgt von Fusarium graminearum und Fusarium culmorum (WOOD et al., 2003; IPCS, 1990). Weiterhin bildet auch Fusarium moniliforme DON (SPICHER, 1981). Welche Spezies dominiert, hängt von der Temperatur ab.

Interessant ist, dass Stämme von Fusarium graminearum und Fusarium culmorum aus Nord- und Südamerika das 15-Acetyl-DON als Vorstufe von DON und die meisten Stämme aus Asien und Europa das toxischere 3-Acetyl-DON produzieren (MILLER et al., 1991; MIROCHA et al., 1989; PINEIRO und SILVA, 1997). Unter den Lagerbedingungen des Getreides werden die Acetylester der Trichothecene zu ihren Ausgangssubstanzen hydrolysiert, weshalb nur DON im Getreide verbleibt (UENO, 1987b).

4.1.3 Biosynthese

Trichothecene werden über den Terpenoid-Weg synthetisiert:

Drei Moleküle Acetyl-CoA aus dem primären Stoffwechsel werden zunächst in mehreren Schritten zu Mevalonsäure umgewandelt. Diese durchläuft danach eine Phosphorylierung, Decarboxylierung und eine Dehydratation mit nachfolgender Bildung des aktiven Isopentenyl-Pyrophosphats, einem Vorläufer von Schlüsselkomponenten wie z.B. Sterolen, Steroiden und Carotinoiden. Das nachfolgende Farnesylpyrophosphat als weitere Zwischenstufe ist dann der Startpunkt der Biosynthese des Sesquiterpenkernes der Trichothecene. (REISS, 1981a; SMITH und MOSS, 1985; UENO, 1987b).

Abbildung 4

aus KARLSON et al. (1994): Biosynthese von Farnesyl-Pyrophosphat

Der erste Schritt der Synthese ist die enzymatische Cyclisierung des Intermediates Farnesylpyrophosphat zum Trichodien. Der Bildung des Trichodiens folgen speziesabhängige Sequenzen von Oxygenierungen, Isomerisierungen, Cyclisierungen und Esterbildungen zu den verschiedenen Trichothecen-Toxinen (DESJARDINS et al., 1993).

Abbildung 5

aus SMITH und MOSS (1985): Biosynthese des Trichothecen-Grundgerüstes

4.1.4 Vorkommen

DON gilt als der Hauptverunreiniger von Mais und Weizen in Kanada, den USA, England und Südafrika (UENO, 1987a). Nach FAO (2001) enthielten die folgenden Getreidearten DON: Weizen (11444 Proben, 57% positiv), Mais (5349 Proben, 41% positiv), Hafer (834 Proben, 68% positiv), Gerste (1662 Proben, 59% positiv), Roggen (295 Proben, 49% positiv) und Reis (154 Proben, 27% positiv). Weiterhin wurde es in Hirse (SPICHER, 1981) sowie in schon verarbeiteten Lebensmitteln nachgewiesen wie z.B.: Weizenmehl, Brot, Frühstückscerealien, Nudeln, Bier, etc. (FAO, 2001).

In einer holländischen Studie wurden die Gehalte an DON in Weizen von September 1998 bis Januar 2000 untersucht. Der durchschnittliche Gehalt an DON in Weizen betrug 446 µg/kg (Probenzahl: 219) (PIETERS et al., 2002). BAUER et al. (1980) berichteten von 18 untersuchten Weizenproben aus Westdeutschland, von denen 15 DON vom Spurenbereich bis zu 4,7 mg/kg enthielten. THIELERT et al. (2005a) untersuchten insgesamt 244 Proben deutsches Brot. Davon galten 181 Proben als nicht oder nur gering belastet (Gehalte bis maximal 100 µg/kg). 5 der Brotproben lagen über 350 µg/kg, wobei der höchste Gehalt bei 577 µg/kg lag. THIELERT et al. (2005b) untersuchten weiterhin insgesamt 259 Hartweizengrieße und Teigwaren. Davon galten 34 Hartweizen- und 75 Teigwarenproben als nicht oder nur gering belastet (Gehalte bis maximal 100 µg/kg). Über 500 µg/kg lagen 4

Proben Hartweizengrieß und 6 Proben Teigwaren. KOMBAL et al. (2005) untersuchten 80 Proben (Maisprodukte) auf DON. Mehr als 500 µgDON/kg enthielten 4 Proben Maismehl (Maximum: 876 µg/kg), 3 Proben Maisgrieß (Maximum 2160 µg/kg) und 1 Probe Cornflakes (Maximum: 688 µg/kg). THIEL et al. (1982) berichteten von 72 untersuchten Maisproben aus der Transkei, wovon 20 Gehalte an DON ebenfalls vom Spurenbereich bis hin zu 15,8 mg/kg enthielten. Nach IPCS (1990) werden DON-Gehalte von über 1 mg/kg in Lebensmitteln selten gefunden.

DON ist in der Regel auf der Seite des Korns zu finden, welches vom Pilz befallen ist.

Fusarien greifen vor allem absterbendes Pflanzenmaterial an, z.B. nachfolgend auf Insektenbefall einer Pflanze. Der Pilz dringt durch eine Verletzung zwischen Perikarp und Aleuronschicht ein, von dort aus wächst er nach innen. Die höchste Toxinkonzentration ist daher in den äußeren Randschichten des Korns zu finden (LEW, 1995). Es kommt nur zu geringen Verschiebungen der Toxingehalte zur anderen Seite des Korns hin.

Geringer Pilzbefall und geringe Mykotoxinkonzentrationen (5–1000 µg/kg) resultieren normalerweise in einer DON-Anreicherung im Bereich der äußeren Oberfläche des Korns.

Bei höheren Konzentrationen (>4000 µgDON/kg) kann es zu einer größeren Verteilung des Toxins durch das Korn kommen, da hier auch der Pilzbefall tiefer in das Korn eindringt (WEIDENBÖRNER, 2001; CHARMLEY und PRELUSKY, 1994).

Carry-over von Futtermitteln auf tierische Produkte kommt praktisch nicht vor, da die Tiere das Futter verweigern, sofern es in hohen Mengen im Futter vorhanden ist. Außerdem unterliegt DON einer schnellen Metabolisierung und Ausscheidung im Körper der Tiere (FAO, 2001).

Studien zeigten, dass die Milch nur eine der nebensächlichen Exkretionsrouten der milchgebenden Kuh darstellt. So ist die Möglichkeit, dass Milch und Milchprodukte DON enthalten, nur sehr gering (PRELUSKY et al., 1984). PRELUSKY et al. (1984) zeigten, daß frisches und konjugiertes DON in der Milch von Kühen präsent waren, nachdem diesen eine einzige Dosis von 920 mg DON oral verabreicht wurde. Jedoch wurden in der Milch nur sehr geringe Gehalte (<4 µg/l) nachgewiesen.

Nach einer einzelnen oralen Gabe von ¹⁴C-DON an Hühner wurde die maximale Radioaktivität in den ersten Eiern direkt nach der Verabreichung des Toxins erreicht und fiel dann schnell bei den späteren Eiern ab (EL-BANNA et al., 1983; PRELUSKY et al.,1987).

4.1.5 Bildungsbedingungen

Fusarium graminearum wächst optimal bei Temperaturen um 25°C und einer Wasseraktivität über 0,88 und ist vor allem in wärmeren Klimaregionen der Erde, z.B.

Nordamerika, China, Japan verbreitet. Fusarium culmorum wächst dagegen optimal bei 21°C und einer Wasseraktivität über 0,87 und wird für gewöhnlich in nördlicheren Gegenden wie Skandinavien und Nordeuropa gefunden (PITT und HOCKING, 1997; ERIKSEN, 2003). Die minimale Wachstumstemperatur liegt bei einigen Fusarien-Arten sogar nahe –7°C (SPICHER, 1981).

Die Bildung der Trichothecen-Mykotoxine findet nicht im Temperaturbereich des optimalen Pilzwachstums statt, sondern vorwiegend bei niedrigeren Temperaturen (ORTH, 1981).

Zwischen dem Ausmaß des gebildeten Pilzmycels und der Toxinbildung besteht offensichtlich keine Beziehung. Es sind jedoch Hinweise bekannt auf einen Zusammenhang zwischen der Toxinproduktion und den bestehenden Lichtverhältnissen. Während das Pilzwachstum durch Helligkeit gefördert wird, wird die Toxinproduktion eindeutig bei Dunkelheit begünstigt (SPICHER, 1981).

4.1.6 Gegenmaßnahmen

In erster Linie ist natürlich die Bekämpfung des Schimmelwachstums überhaupt zu nennen. Hierunter fällt sowohl die Anwendung von Fungiziden, die zur richtigen Zeit erfolgen muß, als auch ein schnelles Trocknen des Getreides nach der Ernte und eine richtige Lagerung. Die Fruchtfolge der Pflanzen auf den Feldern spielt ebenso eine entscheidende Rolle. Es sind solche zu bevorzugen, welche keinen Wirt für die entsprechenden Schimmelpilze darstellen. Zum Beispiel ist eine Tendenz zu höheren DON-Gehalten erkennbar, wenn Weizen in der Fruchtfolge nach Mais gesetzt wird (TEICH und HAMILTON, 1985).

Nach der Verarbeitung des Getreides verbleiben die höchsten Konzentrationen an DON in der Kleie und nicht im Mehl. Eine physikalische Abtrennung der äußeren stärker kontaminierten Schichten des Kornes von den inneren Schichten verringert somit den Toxingehalt (WOOD et al., 2003). Jedoch hängt dies davon ab, inwieweit der Pilz das Endosperm durchdrungen hat. Eine Reinigung der Getreidekörner in Wasser mit anschließender Abtrennung der befallenen Körner aufgrund ihrer geringeren Dichte zu den normal entwickelten Körnern kann den Gehalt an DON verringern. Nach ABBAS et al. (1985) reduzierte die normale Reinigung des Weizens den durchschnittlichen DON-Gehalt um 6-

19%. Dreimaliges Waschen des Getreides (z.B. Gerste und Mais) mit Wasser reduzierte die Gehalte an DON um ca. 65-69% (FAO, 2001).

Trichothecene sind stabil bei 120°C, einigermaßen stabil bei 180°C, zersetzen sich jedoch nach 30–40 Minuten bei Temperaturen um 210°C (KAMIMURA, 1989). Nach NEIRA et al. (1997) zeigte sich eine Reduzierung des DON um ca. 44% in fertig gebackenen Produkten. Dies bestätigten auch ABBAS et al. (1985). Sie wiesen nach, daß das Verarbeiten von Mehl zu gebackenen oder gekochten Produkten in unterschiedlichen DON- Verlusten resultiert: Zum Beispiel betrug die Verringerung des DON-Gehaltes vom ungereinigtem Weizen bis hin zum Brot 24-71%. KAMIMURA et al. (1979) zeigten, daß Brot und Nudeln, die unter normalen Produktionsbedingungen hergestellt wurden, nur noch ca.

50% des zum Mehl zugegebenen DON enthalten. Eine dramatische Zunahme an DON (180%) wurde nach WEIDENBÖRNER (2001) jedoch bei der Doughnutherstellung beobachtet. Dies ist evtl. auf die enzymatische Umwandlung von DON-Vorläufern, welche schon im Weichweizen vorhanden waren, zurückzuführen.

Trichothecene sind im pH-Bereich der meisten Lebensmittel durch Kochen nicht zerstörbar.

Längeres Kochen in einer wässrigen oder sauren Lösung bei pH 3 führt jedoch zur Öffnung des Epoxidringes und damit zu einer Entgiftung (MÜLLER, 1981).

4.1.7 Toxizitäts-Daten

Durch DON ausgelöste akute Toxizität wird hauptsächlich durch Erbrechen und Darmbeschwerden gekennzeichnet, und dies vor allem beim Schwein. Weiterhin stellen sich bei den Tieren Lustlosigkeit, Inaktivität, Hautreizungen, Nervenstörungen, Diarrhoe und rectale Hämorrhagien ein. Weiterhin können in den Mundpartien nekrotische Läsionen entstehen, die Mucosa des Magens und des Dünndarms wird zerstört, begleitet von Hämorrhagien, welche bis zu einer starken Gastritis und zum Tod führen können (PIER et al., 1980; SCUDAMORE, 1998; WOOD et al., 2003).

Die minimale Dosis an DON bei 9-10 kg schweren Schweinen, welche Erbrechen auslöst beträgt bei intraperitonealer Verabreichung 0,05 mg/kg KG (Körpergewicht) und 0,1–0,2 mg/kg KG bei oraler Gabe. Eine verminderte Futteraufnahme bei Schweinen wurde bei Konzentrationen von 0,6 mg DON/kg natürlich kontaminiertem Futter beobachtet, während die reduzierte Futteraufnahme bei Gehalten von 3-6 mg DON/kg Futter auftritt, wenn reines DON zum Futter zugemischt wurde (ERIKSON, 2003). Wird das Toxin in das Futter gegeben, so verringert sich der Futterverbrauch von 20–45 kg schweren Schweinen bei

einer Dosis von 3,6 mg/kg um 20% bzw. um 90% bei einer Dosis von 40 mg/kg (FORSYTH et al., 1977; SCHWEIGHARDT und SCHUH, 1981).

Die Werte für akute Toxizität (DON und Acetyl-DON) nach einer einzigen Dosisgabe ist bei allen Verabreichungsrouten ähnlich. Es gab keine bemerkenswerten Unterschiede bei der akuten Toxizität bei männlichen und weiblichen Tieren (IPCS, 1990). Die akute Toxizität in Bezug auf DON wurde von FORSELL et al. (1987) mit einer LD₅₀ (letale Dosis, bei der 50%

der Tiere sterben) oral an B6C3F₁-Mäusen von 78 mg/kg KG angegeben. In SCF (1999) ist außerdem die LD50 oral von DDY-Mäusen mit 46 mg/kg KG angegeben. Schweine sind zweimal empfindlicher bezüglich DON als Ratten (VESONDER et al., 1979).

Eines der Hauptmerkmale einer akuten und subakuten Toxikose durch Trichothecene ist die Erschöpfung des Lymphgewebes, was zeigt, dass Trichothecene die Immunantworten verändern (UENO, 1987b). Dies spiegelte sich auch in zahlreichen Studien wieder:

• Männliche, 4-6 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden bis zu 2 Wochen mit Futter gefüttert, welches mit DON versetzt war. Ab Konzentrationen von 1,5 mg/kg KG pro Tag und höher wurden reduzierte Immunantworten auf rote Blutkörperchen von Schafen diagnostiziert sowie ein verringertes Thymusgewicht mit extremer Atrophie (ROBBANA-BARNAT et al., 1988).

• Ähnliches zeigte sich bei einer weiteren Studie mit BALB/c-Mäusen, denen DON über das Futter in Dosen von 0,35 bis 6,5 mg/kg KG über 7 Tage verabreicht wurde. Die Futteraufnahme war bei allen Dosen verringert. Bei einer Dosis von 1,3 mg/kg KG wurde eine verringerte Gewichtszunahme, ein verringertes Thymusgewicht und eine verringerte kardiale Proteinsynthese festgestellt (ROBBANA-BARNAT et al., 1987).

• Weibliche B6C3F₁-Mäuse wurden 6 Wochen lang mit Futter gefüttert, welches DON enthielt. Bei Konzentrationen ab 1 mg/kg KG pro Tag und höher wurden erniedrigte Leukocytenzahlen festgestellt (FORSELL et al., 1986).

• Männlichen entwöhnten Swiss-Webster-Mäusen wurde DON in Konzentrationen von 0 bis 7,5 mg/kg KG per Schlundsonde über 35 Tage verabreicht. Die meisten der Tiere, denen die beiden höchsten Dosierungen (2,5 mg/kg KG und 7,5 mg/kg KG) verabreicht wurden starben. In der Gruppe mit 2,5 mg/kg KG pro Tag zeigten sich Läsionen in Thymus, Milz, Lymphknoten und Gastrointestinaltrakt. Bei allen DON- haltigen Dosierungen wurden abnehmende Futteraufnahme, verringertes Körpergewicht, verringerte Gewichte von Thymus und Herz sowie ein erhöhtes Magengewicht festgestellt (ARNOLD et al., 1986).

Nach subchronischer oraler Exposition an verschiedenen Species (Maus, Ratte, Schwein) zeigten sich zahlreiche Effekte, wie z.B. verringerte Futteraufnahme, verringerte Gewichtszunahme und veränderte Gehalte bei einigen Blutparametern einschließlich der Immunoglobuline (ERIKSEN und ALEXANDER, 1998; BAARS et al., 1999).

In einer 90-Tage-Studie mit männlichen Sprague-Dawley-Ratten wurden Futterrationen mit DON verabreicht (1 mg/kg KG pro Tag), welche zu einer 10%igen Gewichtsabnahme führten, obwohl das Futter nicht verweigert wurde (MORRISSEY et al., 1985).

Zu bleibenden signifikanten Erhöhung des Serum-IgA kam es bei weiblichen und männlichen B6C3F₁-Mäusen (8-10 Wochen alt), welche bis zu 12 Wochen mit DON in 10 mg/kg Dosen gefüttert wurden. Bei 2 mg/kg zeigte sich dieser Effekt nicht. Daraus folgte ein NOEL (no observed effect level) für DON von 0,4 mg/kg KG pro Tag (GREENE et al., 1994a).

Bei einer Studie über 94-96 Tage am Schwein mit dem kritischen Effekt des reduzierten Wachstums und Effekten auf die Leber sowie das Serumalbumin kamen BERGSJO et al.

(1993) zu einem NOAEL (no observed adverse effect level) von 0,06 mg/kg KG/Tag, mit natürlich kontaminiertem Futter.

B6C3F1-Mäuse besitzen nach IVERSON et al. (1995) eine ähnliche Empfindlichkeit wie Schweine bezogen auf lebenslange Fütterungsstudien. In einer chronischen Fütterungsstudie über 2 Jahre wurde B6C3F1-Mäusen Nahrung, welche mit reinem DON versetzt war, gegeben. Die Dosen waren im Bereich von 0 bis 1,1 mg/kg KG pro Tag bei den männlichen Tieren und 0 bis 1,5 mg/kg KG pro Tag bei den weiblichen Tieren. Das Überleben war nicht signifikant verändert. Die durchschnittliche tägliche Futtermenge war bei den weiblichen Tieren unverändert, bei den männlichen Tieren jedoch ab einer Dosis von 0,5 mg/kg KG pro Tag um ca. 8 % reduziert. Bei den Männchen fiel die signifikant reduzierte Gewichtszunahme bei 0,5 mg/kg KG und bei den Weibchen bei 1,5 mg/kg KG auf. Der unterdrückende Effekt des DON auf die Gewichtszunahme wird in dieser Studie nicht mit der verminderten Futteraufnahme assoziiert. Es wurde gezeigt, dass die Effekte auf das Körpergewicht in den ersten 20% der gesamten Lebensspanne verursacht werden. DON verursachte keine biologisch relevanten Effekte auf hämatologische und klinisch-chemische Parameter. Die Weibchen zeigten eine 56%ige Zunahme beim Serum-IgA und eine Zunahme unter 10% des IgG bei Dosen von 0,7 und 1,5 mg/kg KG pro Tag. Das relative Gewicht der Leber nahm bei den männlichen Tieren bei Konzentrationen ab 0,5 mg/kg KG pro Tag ab. Bei der Dosis von 1,1 mg/kg KG pro Tag war das relative Gewicht der Milz verringert sowie das relative Gewicht der Testes erhöht. Ein erhöhtes Auftreten von präneoplastischen oder neoplastischen Veränderungen wurde nicht beobachtet. Tatsächlich

zeigte sich eine signifikante dosisabhängige Abnahme bezüglich des Auftretens von präneoplastischen und neoplastischen Läsionen in der Leber. Dieser Trend beruht vielleicht auf der bekannten Korrelation zwischen Körpergewicht und dem Auftreten von spontanen Leber-Neoplasmen in dem verwendeten Mäusestamm. Die kritischen Effekten dieser Studie sind die Verringerung des Gewichtes bei beiden Geschlechtern und die Abnahme des relativen Gewichtes der Leber bei den männlichen Tieren. Der NOEL betrug 0,1 mg/kg KG pro Tag (IVERSON et al., 1995).

Eine vom IARC 1993 einberufene Arbeitsgruppe stufte DON in Gruppe 3, d.h. als „nicht klassifizierbar als menschliches Kanzerogen“ (not classifable as to its carcinogenicity to humans), ein (JECFA, 2001), jedoch war zu dieser Zeit die oben beschriebene negative chronische Studie an Mäusen noch nicht verfügbar.

In destilliertem Wasser gelöstes DON erwies sich als embryotoxisch und teratogen nach der Gabe über eine Schlundsonde an 4 aufeinanderfolgenden Tagen (Tag 8-11 der Gestation) an 15-19 Swiss-Webster-Mäuse (KHERA et al., 1982). Die Inzidenz der Resorption war 100% bei Dosen von 10 oder 15 mg/kg KG und 80% bei 5 mg/kg KG. Die Dosis von 5 mg/kg KG reduzierte die Anzahl der lebenden Feten und auch das durchschnittliche Gewicht der Feten, verglichen mit den Kontrollen. Der NOAEL in Bezug auf die Teratogenität der Maus mit dem kritischen Effekt von Skelettabnormitäten liegt nach KHERA et al. (1982) bei 0,5 mg/kg KG/Tag.

In einer Mehrgenerationenstudie zur Reproduktionstoxizität mit weiblichen und männlichen F₀-Mäusen (Swiss Webster) erhielten diese Futter, welches DON in Dosierungen von 2,0 mg/kg KG (15 männliche und 15 weibliche Tiere) bzw. 0,38; 0,75 oder 1,5 mg/kg KG (7 männliche und 59 weibliche Tiere) enthielt. Es gab 30 Kontrolltiere in der ersten Studie und 26 in der zweiten. Nach 30 Tagen Fütterung konnten sich die Mäuse innerhalb ihrer Dosisgruppe verpaaren, und die schwangeren Weibchen brachten ihre Nachkommen normal zur Welt. Die F_1a-Nachkommenschaft wurde bis zum Alter von 21 Tagen untersucht und dann getötet. Die F0-Mäuse wurden wieder verpaart. Die Weibchen, welche verpaart wurden, um F_1b-Nachkommen zu schaffen, wurden am Tag 19 der Gestation getötet, und die Feten wurden vor allem auf viszerale und Skelettfehlbildungen hin untersucht. Reduzierte Futteraufnahmen sowie verringerte Gewichte wurden bei den weiblichen und männlichen F0- Mäusen beobachtet. Weiterhin wurden Verringerungen bei der Anzahl der lebenden Nachkommen und dem postnatalen Körpergewicht der F_1a -Nachkommenschaft, der Zahl der lebenden Feten und des fetalen Körpergewichtes der F1b-Generation festgestellt. Adverse Effekte auf die Fertilität der F₀-Mäuse konnten nicht festgestellt werden. Wichtige Fehlbildungen bei den F1b-Feten wurden ebenfalls nicht gefunden. Ergebnisse des

Austauschens von Nachkommen zwischen den Kontrollmuttertieren und den 1,5 mg/kg KG Muttertieren zeigten, dass sowohl die postnatale Überlebensrate als auch das Körpergewicht advers durch die pränatale Exposition ebenso wie durch eine kombinierte prä- und postnatale Exposition beeinflusst werden (KHERA et al., 1984). Der NOAEL mit dem kritischen Effekt der postnatalen Sterblichkeit liegt nach KHERA et al. (1984) bei der Maus bei 0,38 mg/kg KG/Tag.

Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht 165 g) wurden mit Futter, welches mit DON versetzt wurde (2 mg/kg KG) über 60 bzw. 15 Tage hinweg vor der Verpaarung gefüttert. Ratten, welche dieses Futter während der Schwangerschaft und der Stillperiode aufnahmen, zeigten keine klinischen Symptome einer Toxizität, jedoch wiesen sie geringere Gewichte als die Vergleichstiere auf. Bei nur 50% der Verpaarungen bei den mit DON gefütterten Tieren kam es zur Schwangerschaft im Vergleich zu 80% bei den Kontrolltieren. Die Gewichtszunahmen der Nachkommen waren bei beiden Gruppen bis zum Tag 14 vergleichbar, ab dann hatten die Kontrolltiere wesentlich größere Gewichtszunahmen. Histologische Veränderungen der Testes oder der Ovarien wurden bei den Nachkommen der behandelten Tiere nicht gefunden (MORRISSEY und VESONDER, 1985).

In einer weiteren Studie bezüglich der Teratogenität von DON wurden männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (3 Gruppen à 15 weibliche und 15 männliche Tiere) mit DON-haltigem Futter gefüttert, welches Gehalte von 0,25; 0,5 oder 1,0 mg/kg KG enthielt.

Die Kontrolltiere bestanden aus 2 Gruppen von männlichen und weiblichen Tieren. Nach 6 Wochen der Futtergabe wurden die Tiere verpaart. Die Weibchen bekamen weiterhin das Futter und wurden am letzten Tag der Schwangerschaft getötet. Die Feten wurden bezüglich ihrer pränatalen Entwicklung beurteilt. Adverse Effekte konnten mit Ausnahme der Erweiterung des Nierenbeckens und der Harnblase nicht beobachtet werden (KHERA et al., 1984).

Es wird von 2 Studien an Schweinen berichtet, bei denen DON über das Futter während der Gestation verabreicht wurde. Die Tiere, denen 0,1-4,8 mg DON/kg Futter verabreicht wurde, zeigten offensichtlich keine mütterliche Toxizität oder verringerte Futteraufnahme. Jedoch verursachten 1-2 mg/kg Futter (entspricht 0,03-0,07 mg DON/kg KG/Tag) verringerte Gewichtszunahmen. Effekte bezüglich der Anzahl an Nachkommen, der Überlebens- oder der Missbildungsrate wurden nicht beobachtet. Dosierungen unterhalb von jenen, welche zu verringerten Gewichtszunahmen führen, zeigten keinen Effekt von DON bezüglich der Reproduktion (BERGSJO et al., 1992; 1993; ERIKSEN und ALEXANDER, 1998; BAARS et al., 1999).

Zusammenfassend ist zur Reproduktionstoxizität und Teratogenität von DON zu sagen:

• DON wirkte teratogen bei Mäusen nach Verabreichung mit der Schlundsonde.

• Jedoch erwies es sich bei Mäusen und Ratten als nicht teratogen, wenn es oral über das Futter verabreicht wurde.

• Eine Zunahme der postnatalen Mortalität wurde bei Mäusen bei einem NOAEL von 0,38 mg/kg KG beobachtet (KHERA et al., 1984).

• Bei Ratten wurde eine leichte Abnahme der Fertilität bei 2 mg/kg KG (einzige getestete Dosis dieser Studie) beobachtet, während bei einer anderen Rattenstudie Dosierungen bis zu 1 mg/kg KG keinerlei Effekte zeigten.

DON ist nicht mutagen bezüglich der Salmonella typhimurium Stämme TA98, TA100, TA1535, TA1537 und TA1538, jeweils mit oder ohne S-9-Fraktion aus der Rattenleber (KUCZUK et al., 1978; UENO et al., 1978; WEHNER et al., 1978a). Nicht-toxische und toxische Dosen an DON (0,1-1000 mg/l) erhöhen die außerplanmäßige DNA-Synthese in primären Kulturen an Rattenhepatocyten nicht signifikant (BRADLAW et al., 1985). DON (Gehalte von 2-3 µg/ml) induzierte auch keine Genmutationen im HPRT-Locus-Test an Hamster-V79-Zellen. DON steigert die Zelltransformation in Embryozellen der Maus in vitro und induzierte klastogene Effekte. Es hemmt die Proteinsynthese in chinesischen Hamster- Ovarzellen in vitro im selben Dosisbereich, bei dem auch klastogene Effekte auftreten (HSIA et al. 1998; LEATHERMAN und MIDDLEBROOK, 1993; ROGERS und HEROUX-METCALF, 1983).

Trichothecene beeinträchtigen das Immunsystem. DON-abhängige Apoptose wurde in Makrophagenzellen von Mäusen und Ratten in vitro beobachtet. Diese Ergebnisse sind bei allen Tieren relevant, da aus der Verabreichung von Trichothecenen an Nagetiere in vivo Apoptose in Thymus, Milz, Knochenmark und Leber resultieren (IHARA et al. 1997 und 1998; MIURA et al., 1998; SHINOZUKA et al., 1997 und 1998).

Trichothecene erhöhen die Produktion an IgA und reduzieren die Resistenz der Versuchstiere bezüglich bakteriellen Infektionen. Wie weiter vorne schon beschrieben führten IVERSON et al. (1995) eine 2-Jahresstudie mit B6C3F1-Mäusen durch. Diesen wurde Futter mit zugesetztem DON in Dosen von 0 bis 1,1 mg/kg KG pro Tag bei männlichen Tieren und 0-1,5 mg/kg KG pro Tag bei weiblichen Tieren verabreicht. Ausschließlich bei den Weibchen zeigte sich ein linearer dosisabhängiger Anstieg des Serum IgA und IgG.

In einem anderen Versuch mit B6C3F₁-Mäusen (8-10 Wochen alt; Dosen von 2-5 mg/kg KG pro Tag) zeigte sich, dass die Peyers Plaques Lymphocyten und mit etwas geringerem Ausmaß auch die Lymphocyten der Milz signifikant mehr IgA produzieren als diejenigen der Kontrolltiere (PESTKA et al., 1989 und 1990a, b; BONDY und PESTKA, 1991). Dieses IgA wird eine zeitlang in der Niere eingelagert (DONG und PESTKA, 1993).

DON rief bei in vitro-Versuchen an peripheren Blutlymphocyten der Ratte und des Menschen dosisabhängige Verringerungen der Proliferation der Lymphocyten hervor. Die Konzentration, bei der DON eine 50%ige Hemmung der Blastogenese produzierte sind 90 ng/ml bei der Ratte bzw. 220 ng/ml bei menschlichen Lymphocyten (ATKINSON und MILLER, 1984). Niedrige Dosen von DON können jedoch die mitogen aktivierte Proliferation der Lymphocyten auch stimulieren und die Resistenz in Bezug auf Infektionen erhöhen, was jedoch von der Anwendung des Toxins, der Dauer und der Dosis abhängt. Die verminderte Antwort des Immunsystems wird einfach durch die Hemmung der Proteinsynthese und die Apoptose, welche durch Trichothecene verursacht wird, begründet (PESTKA und BONDY, 1994; BONDY und PESTKA, 2000). Der stimulierende Effekt ist schwieriger zu erklären, jedoch wiesen Studien darauf hin, dass die Induktion von Cytokinen beteiligt ist.

Möglicherweise werden diese über die Induktion der MAP-Kinase hochgeregelt, was zu einer erhöhten mRNA-Expression führt (BONDY und PESTKA, 2000; ZHOU et al., 2003).

Das Ergebnis zweier Studien mit Mäusen zeigt, dass DON die Wiederstandsfähigkeit bezüglich Bakterieninfektionen (Listeria monocytogenes und Salmonella enteritidis) unterdrücken kann. Die immunsuppressiven Effekte der Trichothecene resultieren in einer erhöhten Rate und Schwere an Infektionen bei den Tieren. Betrachtet man diese erhöhte Infektionsempfindlichkeit, dann wird von einem NOAEL von 0,25 mg/kg KG/Tag bei Swiss- Webster-Mäusen (TRYPHONAS et al., 1986) und einem LOEL (lowest observed effect level) von 0,22 mg/kg KG/Tag bei männlichen BALB/c-Mäusen berichtet (BAARS et al., 1999;

DEIJNS et al., 1994). Nach PESTKA et al. (1987) wird die Resistenz bezüglich Listeria monocytogenes sogar in größerem Ausmaß reduziert, wenn DON und Zearalenon gleichzeitig verfüttert werden.

Obwohl DON weniger akut toxisch ist als die potenteren Trichothecene, werden die immuntoxischen Eigenschaften als von größerer Wichtigkeit eingestuft als die von z.B. T-2- Toxin verursachten spektakulären Hämorrhagien (GREENE et al., 1994b). Veränderungen im Immunsystem von Mäusen treten schon bei geringen Konzentrationen auf, ähnlich jenen, denen der Mensch auch ausgesetzt sein kann (HSIEH, 1987). Einer der am häufigsten beobachteten Effekte in Kurzzeit- und Langzeitstudien bei den meisten Spezies ist das reduzierte Wachstum. Bei Verabreichung von höheren Dosen werden Thymus, Milz, Herz

und Leber angegriffen. Als NOEL wird 0,1 mg/kg KG pro Tag aus der Studie von IVERSON et al. (1995) angenommen, da in der 2-Jahres-Studie Mäuse bei dieser Dosis nur eine leichte, jedoch nicht signifikante Erniedrigung des Körpergewichtes und keine weiteren Veränderungen aufwiesen. DON erwies sich in obiger Studie als nicht karzinogen bei Mäusen. Bei Gentoxizitätstests war DON negativ in in vitro Genmutationstests, jedoch wurden bei weiteren Tests klastogene Effekte induziert. DON besitzt daher nur eine fragliche oder keine Gentoxizität, ist jedoch definitiv ein Krebspromotor aufgrund seiner Cyto- und Immuntoxizität (HSIEH, 1987). Möglicherweise kann die Entwicklung von Krebs durch die Selektion von Zellen, welche resistenter bezüglich Cytotoxizität sind, beziehungsweise durch die Stimulation der Teilung von Zellen, welche genetisch verändert sind, induziert werden.

Vielleicht ist DON auch ein Promotor der Karzinogenese durch die Schädigung des Immunsystems eines Lebewesens und so durch die Unterminierung des natürlichen Abwehrmechanismus gegen die Entwicklung von abnormalen Zellen (HSIEH, 1987). DON zeigte sich teratogen bei Mäusen nach der Verabreichung per Schlundsonde. Nach oraler Verabreichung an Ratten und Mäuse traten jedoch keine teratogenen Effekte auf. DON zeigte Reproduktionseffekte wie z.B. Embryotoxizität und erniedrigtes Gewicht der Feten in verschiedenen Spezies (Maus, Ratte, Schwein) (JECFA, 2001).

Der provisorische ADI (acceptable daily intake) kann daher aus den NOAELs von Toxizitätsstudien mit der Einbeziehung von Unsicherheitsfaktoren berechnet werden. Von der EU wurde ein derzeitiger ADI von 1 µg/kg KG pro Tag unter Einbeziehung eines Sicherheitsfaktors von 100 aufgrund der Studie von IVERSON et al. (1995) angenommen (PIETERS et al., 2002). Bei dieser täglichen Aufnahmemenge soll es nicht zu Effekten wie der Beeinflussung des Wachstums, des Immunsystems und der Fortpflanzung durch DON kommen (JECFA, 2001).

Unter Zugrundelegung der durchschnittlichen täglichen Aufnahmemengen an DON über Brot (Mittelwert von 107 Proben [Jahr 1999]: 154 µg/kg) und Nudeln (Mittelwert von 39 Proben [Jahr 1999]: 440 µg/kg) ergibt sich für einen Erwachsenen von 60 kg KG eine Ausschöpfung des ADI-Wertes (1 µg/kg KG pro Tag) von 63% für 1999 allein aus Brot und Nudeln mit jahrgangsabhängig signifikanten Schwankungen (DFG, 2001).

Kinder weisen nicht nur die höchste relative Aufnahmemenge an DON auf (aufgrund der relativ hohen Weizenaufnahme in dieser Personengruppe), sondern gehören auch der durch die Effekte von DON (geringeres Wachstum) am meisten verwundbaren Personengruppe an.

Kinder von einem Jahr weisen die höchste Aufnahmemenge an DON auf (PIETERS et al., 2002). Nach PIETERS et al. (2002) sind 80% der einjährigen Kinder Gehalten oberhalb des

derzeitigen ADI, und 20% der einjährigen Kinder sind Gehalten, welche mindestens doppelt so hoch sind wie der derzeitige ADI, ausgesetzt.

4.1.8 Krankheitsbilder

Die wohl bekannteste, auf Trichothecene zurückzuführende Krankheit ist die alimentäre toxische Aleukie (ATA). Sie trat vor allem während und nach dem 2. Weltkrieg in Russland auf, da Hirse und Weizen verzehrt wurden, die auf dem Feld unter dem Schnee überwintert hatten. Der Name ATA betont in seinem Wortlaut die progressive Leukopenie und die Eigenschaft, dass der Verzehr von Getreide (Nahrung = alimentary) und die Ausscheidung des Toxins durch Pilze für des Ausbruch der Krankheit notwendig sind (DESHPANDE, 2002). Nach REISS (1981b) wurden in einer russischen Probe 2,5%

Trichothecen T-2, daneben die Trichothecene Neosolaniol (0,14%), T-2-Tetraol (0,6%) sowie Zearalenon (0,43%) gefunden (REISS, 1981b).

Die klinischen Symptome von ATA werden für gewöhnlich in 4 Stadien unterteilt (FORGACS und CARLL, 1962):

• Das erste Stadium, von dem eine Genesung möglich ist, tritt kurze Zeit nach der Aufnahme des toxischen Getreides auf. Der Patient fühlt ein Brennen im Mund, Zunge, Hals, Gaumen, Ösophagus und Magen als Ergebnis der Entzündung muköser Membranen. Bei hohen Dosen treten Erbrechen, Diarrhoe und Magenschmerzen auf. Dieses Stadium wird begleitet von starkem Speichelfluß, Kopfschmerzen, Schwindelgefühlen, Müdigkeit, allgemeiner Schwäche und Tachykardie. Erhöhte Körpertemperatur wurde nicht zitiert, jedoch nimmt die Leukocytenzahl bis zu einem Gehalt von 2000 mm^-3 ab. Dieses erste Stadium dauert ca. 3 bis 9 Tage.

• Das 2. Stadium wird auch das latente oder leukopenische Stadium genannt, da sich die Patienten wohl fühlen, jedoch treten Störungen der Knochenmarksfunktionen auf.

Es zeigten sich eine fortschreitende Leukopenie, Granulopenie und Lymphocytose.

Die Abnahme der Anzahl an Blutplättchen und des Hämoglobins werden ebenso zitiert. Die gewöhnliche Dauer dieses Stadiums beträgt 3 bis 4 Wochen.

• Das 3. Stadium beginnt mit dem Erscheinen von punktförmigen Hämorrhagien auf der Haut des Rumpfes und in der Leistengegend sowie bei schweren Fällen im Gesicht und auf dem Kopf. Hämorrhagien werden auch auf den mukösen Membranen des Mundes und der Zunge gefunden.

• Diese Symptome werden gefolgt von nekrotischen Veränderungen des Mundes, Halses, Ösophagus und des Magens. Bakterielle Effekte verursachen einen unangenehmen Geruch. Die lokalen Lymphknoten sind vergrößert. Die Leukopenie steigt bis zu einer Zahl von 100 mm^-3 oder sogar noch weniger Leukozyten, auch die Zahl der Erythrocyten und Thrombozyten nimmt merklich ab. In einigen Fällen leiden die Patienten an akuter parenchymatischer Hepatitis, begleitet von einer Gelbsucht.

JOFFE (1986) berichtet zusätzlich von Ekzemen auf der Haut.

DON und Nivalenol wurden zusammen mit Acetyl-DON und T-2-Toxin mit einem Krankheitsausbruch in Kashmir (Indien) 1987 in Verbindung gebracht (BHAT et al., 1989).

Ca. 50000 Menschen erkrankten nach dem Verzehr von Brot, welches aus Weizen hergestellt worden war, der durch Regen schwer beschädigt war und zahlreiche Trichothecene enthielt. Von den 224 untersuchten Menschen hatten 97 Symptome einschließlich Bauchschmerzen (100%), Halsreizungen (63%), Diarrhoe (39%), Blut im Stuhl (5%) und Erbrechen (7%). Die Symptome entwickelten sich 15 Minuten bis zu 1 Stunde nach dem Verzehr des Brotes. 12 der 24 Proben Weizenmehl, welche zum Backen des Brotes verwendet wurden, enthielten Mykotoxine: DON 0,35-8,38 mg/kg; Acetyl-DON 0,64-2,49 mg/kg, Nivalenol 0,03-0,1 mg/kg; T-2-Toxin 0,55-0,8 mg/kg (BHAT et al., 1987, 1989).

LUO (1988) berichtet von einem Fall mit nahezu 600 Personen, die verschimmeltes Getreide konsumiert hatten. 463 Menschen zeigten Vergiftungserscheinungen (=77%). Die Latenzzeit bis zu den ersten Symptomen betrug 5-30 Minuten. Die ersten Symptome beinhalten Übelkeit, Erbrechen, Bauchschmerzen, Diarrhoe, Schwäche und Kopfschmerzen.

Todesfälle traten nicht auf. Schweine und Hühner, die dasselbe schimmelige Getreide bekamen, zeigten auch Vergiftungserscheinungen. Fünf Proben des schimmeligen Mais wurden untersucht: DON wurde mit Gehalten von 0,34-92,8 mg/kg und Zearalenon mit 0,004-0,587 mg/kg nachgewiesen, während T-2-Toxin und Nivalenol nicht gefunden wurden.

Beim Menschen führt eine Lebensmittelvergiftung mit DON, wie zum Teil schon oben beschrieben, zu Bauchschmerzen, einem Völlegefühl des Abdomens, Kopfschmerzen, Schwindel, Reizungen im Hals und der Haut, Übelkeit, Erbrechen, Diarrhoe und Blut im Stuhl (ROTTER et al., 1996; ERIKSEN und ALEXANDER, 1998; WOOD et al., 2003). Diese Vergiftungssymptome sind relativ unspezifisch und können leicht mit z.B. mikrobiellen Vergiftungserscheinungen verwechselt werden. Auch Wirkungen auf das Immunsystem des Menschen werden diskutiert (DFG, 2001). Bei Tieren äußert sich eine Vergiftung mit DON in erster Linie durch Futterverweigerung und Erbrechen.

4.1.9 Wirkungsmechanismen (Biotransformation)

DON wird im Verdauungstrakt schnell absorbiert. Als einziger Metabolit des DON wurde mit der GC-MS (GC=Gaschromatographie; MS = Massenspektrometrie) ein Deepoxy- Derivat identifiziert, welches im Gastrointestinaltrakt entsteht. Die größte Deepoxidierungsaktivität wurde im Colon festgestellt: nur 1 % der eingesetzten Dosis wurde hier als DON nachgewiesen (KOLLARCZIK et al., 1994).

Die Verteilung erfolgt ohne eine bemerkenswerte Anreicherung in spezifischen Organen oder Geweben. Trichothecene werden metabolisch in weniger toxische Metaboliten durch Reaktionen, wie Hydrolyse, Hydroxylierung, Deepoxidierung und Glucuronidierung, umgewandelt (IPCS, 1990), wobei bei oraler Verabreichung die Deepoxidierung den Hauptmetabolisierungsweg darstellt (SCF, 1999).

96 Stunden nach der oralen Verabreichung einer einzigen Dosis radioaktivmarkierten DONs (10 mg/kg KG) an männliche Ratten wurden 64% der Radioaktivität in der Fäces wiedergefunden und 25% im Urin (LAKE et al., 1987). 25% des 0-24 Stunden-Urins bei Ratten (oral, 10 mg/kg KG) bestand aus unverändertem DON und 10% aus dem Deepoxy- Metaboliten (LAKE et al., 1987).

Obwohl DON nach oraler Gabe an Schafe (einmalige Dosis von 5 mg/kg KG) innerhalb von 30 Minuten im Blut erscheint, wurde die systemische Bioverfügbarkeit nur zu 7,5 % bestimmt. Die Clearance-Zeiten für konjugiertes DON (> 6 Stunden) sind länger als die des freien DON (< 125 min) nach oraler Verabreichung an Schafe. Im Blut waren die nachgewiesenen Hauptbestandteile der Deepoxy-Metabolit und Glucuronid-Konjugate von DON. In der Galle konnte als einziger Metabolit ein Glucuronid-Konjugat der Deepoxy-Form nachgewiesen werden (PRELUSKY et al., 1985).

Schweine weisen im Vergleich zum Schaf wenig Metabolismus oder Konjugation auf, jedoch ist ihre systemische Bioverfügbarkeit wesentlich größer als beim Schaf (PRELUSKY et al., 1988). Nach einer einzigen Gabe von radioaktiv markiertem DON an Schweine wurde die Halbwertszeit von DON mit 4 Stunden veranschlagt. Nach 24 Stunden waren nur noch Spuren nachweisbar (SCF, 1999).

Rinder reagieren auf Trichothecene weniger empfindlich als die meisten Monogastrier (BEASLEY, 1989). Trichothecene werden zu einem großen Ausmaß im Pansen der Rinder deepoxidiert, bevor sie ins Blut aufgenommen werden (COTE et al., 1986; SWANSON und CORLEY, 1989). Die De-Epoxide sind weniger stark cytotoxisch als die korrespondierenden Toxine, welche einen intakten Epoxidring besitzen (ERIKSON, 2003).

Bei der Inkubation menschlicher Fäces mit Trichothecenen konnte keine Aktivität bezüglich der Deepoxidierung festgestellt werden (ERIKSON, 2003).

Die Gehalte von DON in Hühnern nach einmaliger oraler Gabe (1,3 – 1,7 mg/kg KG) waren nach 3 Stunden am größten in der Galle, gefolgt von Nieren und Blut. Nach 72 Stunden erfolgte eine Verteilung von DON mit den höchsten Gehalten in der Galle, Nieren und Leber und nicht messbaren Konzentrationen von DON im Blut (PRELUSKY et al., 1986).

Bei Mutterschafen, welche mit 4 mg/kg KG DON intravenös behandelt wurden, wurde weniger als 0,25% der eingesetzten Dosis in der Milch über 48 Stunden gefunden, wovon der meiste Teil der Deepoxy-Metabolit war (PRELUSKY et al., 1984).

Als Hauptwirkorte von DON sind Leber und Darm beschrieben. Im Tierversuch hat sich gezeigt, dass es durch DON auch zu einer Überproduktion an Immunglobulinen kommen kann, die sich in den Nieren ablagern und dort zu Schäden führen.

Das Schwein ist gegenüber DON das empfindlichste Nutztier (DFG, 2001). Ein besonderes Merkmal der Toxizität von DON ist die charakteristische Induktion von Erbrechen, Verringerung des Wachstums sowie Futterverweigerung bei Schweinen oder verspätete Magenentleerung und Futterverweigerung bei Ratten und Mäusen. Das Erbrechen wird durch die Erhöhung der serotonergen Aktivität im zentralen Nervensystem oder über periphäre Wirkungen auf Serotoninrezeptoren vermittelt (ROTTER et al., 1996; ERIKSEN und ALEXANDER, 1998; FIORAMONTI et al., 1993; FITZPATRICK et al., 1988).

PRELUSKY und TRENHOLM (1993) zeigten, dass bestimmte spezifische Antagonisten des Serotonin-3-Rezeptors das durch die Einnahme von DON induzierte Erbrechen verhindern können. In einem weiteren Experiment, bei dem das Toxin durch eine kontinuierlich zuführende osmotische Pumpe (intraperitoneal) dosiert wurde, zeigte sich ebenfalls, dass die Futterverweigerung bei Schweinen aufgrund neurotoxischer Effekte von DON und nicht auf Geschmack oder erlernten Antworten basiert (PRELUSKY, 1997).

Eine einzelne Dosis von 0,25 mg/kg (intravenös) veränderte beim Schwein die Neurotransmitterkonzentration im Hypothalamus, dem frontalen Cortex und dem Cerebellum bis zu 8 Tage nach der Verabreichung (PRELUSKY et al., 1992). Dies zeigt, dass Serotonin eine sehr wichtige Rolle beim chemisch induzierten Erbrechen spielt.

Die meisten Trichothecene führen im Organismus zu einer Hemmung der Proteinsynthese (EHRLICH und DAIGLE, 1987; BETINA, 1989). Sie binden an die 60S- Untereinheit der Ribosomen und hemmen die Peptidyltransferaseaktivität (WEI et al., 1974;

WEI & McLAUGHLIN, 1974). Effekte sind die Induktion von Apoptose vor allem in lymphatischen und hämatopoetischen Geweben, da diese Gewebe von einer hohen Proteinsyntheserate abhängig sind. Lymphozyten und Epithelzellen, vor allem des Gastrointestinaltraktes, reagieren daher am empfindlichsten in Bezug auf Trichothecene.

(ERIKSEN und ALEXANDER, 1998; SCF, 1999, 2000b, 2001).

MARESCA et al. (2002) zeigten in einer Studie, dass weniger als 10µmol/ml DON (< 0,296 µg/ml) einige intestinale Transportproteine in menschlichen Epithelzellen des Dünndarms selektiv hemmt, wenn die Zellen für 24 und 48 Stunden mit dem Toxin inkubiert werden. Der Transport von Palmitat durch die Membran war erhöht. Die Effekte werden sowohl durch Cycloheximid, einem Inhibitor der Proteinsynthese, und Deoxycholat, einem Auslöser der Apoptose, nachgeahmt. Dies zeigt, dass die Hemmung der Proteinsynthese und die Apoptose die Hauptmechanismen der Toxizität des DONs in den Zellen darstellen.

4.1.10 Gesetzliche Grundlagen

Höchstmengen für DON wurden in mehreren Staaten etabliert. Sie reichen von 0 - 2 mg/kg für Getreide für den menschlichen Verzehr bzw. bis zu 10 mg/kg für Futtermittel (FAO, 1997). DFG (2001) berichtete von einem in den Niederlanden vorgeschlagenen Richtwert für DON. Dieser basiert auf den Verzehrdaten von Kindern und liegt bei 60µg/kg für Brot und bei 120 µg/kg für Getreideprodukte mit einem Getreideanteil von mehr als 33%.

Für Lebensmittel gelten in Deutschland für DON die in der Mykotoxin- Höchstmengenverordnung festgelegten Höchstmengen der Europäischen Union. Diese liegen bei Getreideerzeugnissen (Getreidekörner zum direkten Verzehr und verarbeitete Getreideerzeugnisse) bei 500 µg/kg. Ausgenommen hiervon sind Hartweizenerzeugnisse, Brot, Kleingebäck und Feine Backwaren. Für Brot, Kleingebäck und Feine Backwaren gilt die Höchstmenge von 350 µg/kg (MHmV, 1999). Für Lebensmittel, welche zur Herstellung von diätetischen Lebensmitteln für Säuglinge und Kleinkinder dienen, gelten die speziellen Vorschriften der Diätverordnung: Getreideerzeugnisse, d.h. Getreidekörner für den direkten Verzehr und verarbeitete Erzeugnisse, dürfen einen Wert von 100 µg/kg DON nicht überschreiten (DiätVO, 1988).

In der Europäischen Union sind jedoch neue Grenzwerte für DON im Gespräch (SANCO/0006/2004 Rev. 5):

Lebensmittel DON in µg/kg

unverarbeitetes Getreide außer Durumweizen, Hafer und Mais

1000 oder 1250

unverarbeiteter Hartweizen und Hafer 1750

Getreidemehl, einschließlich Maismehl, Grießmehl, Maisschrot und Maisgrießmehl

750

Brot, Feine Backwaren, Kekse, Getreidesnacks und Frühstücksflocken

500

getrocknete Pasta 750

verarbeitete Lebensmittel für Kinder auf Getreidebasis sowie für Babykost

150

In den USA gilt der Richtwert von 1 mg/kg für DON für alle fertigen Weizenprodukte wie Mehl, Kleie, Keime für den menschlichen Gebrauch. Für Getreide und Getreidebeiprodukte, welche als Futtermittel verwendet werden, gibt es in den USA noch weiterreichende Vorschriften (WOOD et al., 2003).

In Kanada gilt ein Richtwert von 2000 µg/kg für ungereinigten Weizen und Weichweizen für die Kleiefabrikation, während der Wert von Weizen für Kindernährmittel bei 1000 µg/kg liegt (BUCHELI et al., 1996).

4.1.11 Analytische Nachweismethoden (Übersicht)

Die Trichothecene werden von der Aufarbeitung her in zwei Gruppen eingeteilt:

• In die Gruppe B mit polaren Substanzen, welche eine Ketogruppe am C8 tragen.

• Die der Gruppe A, welche weniger polar sind, keine Ketogruppe am C8-Atom besitzen und auch nur weniger freie Hydroxylgruppen aufzeigen.

Zur Aufarbeitung von DON und anderen Typ B-Trichothecenen eignet sich vor allem eine wässrige Acetonitril-Lösung. Nach TRENHOLM et al. (1985) wird für die Extraktion von

natürlich kontaminierten Proben mehr Zeit (120 Minuten Schütteln) benötigt als für dotierte Proben. Um evtl. vorhandenes störendes Fett zu extrahieren, eignet sich n-Hexan oder ein anderes unpolares Lösungsmittel. Dieser Schritt muß vor der eigentlichen Festphasenextraktion stattfinden.

Nach DFG (2001) wird die GC am häufigsten nach Derivatisierung von DON zu flüchtigen Verbindungen eingesetzt, wobei die Detektion meistens entweder mit einem Elektroneneinfangdetektor (ECD) oder einem Massenspektrometer erfolgt. Der letztendlich sichere Nachweis des Toxins wird jedoch nur durch die massenspektrometrische Detektion ermöglicht (DFG, 2001).

Alternativen zur GC stellen die HPLC (High Performance Liquid Chromatography) und immunologische Methoden dar. Bei der HPLC wird eine C18-Säule mit einer mobilen Phase aus Acetonitril und Wasser verwendet. Die nachfolgende UV-Detektion von DON erfolgt bei 218 nm (CAHILL et al., 1999). Auch hier stehen inzwischen massenspektrometrische Detektoren zur letztendlichen Absicherung zur Verfügung.

Als immunologisches Verfahren kann ein ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) eingesetzt werden. Hier dient Wasser als Extraktionsmittel. Es folgt ein nachfolgender Clean- up über Immunoaffinitätssäulen (TRUCKSESS et al., 1995). Erwähnt werden sollte hier jedoch, dass die ELISA-Methoden zur Bestimmung von DON in der Regel nicht zwischen DON, 3-Acetyldeoxynivalenol, 15-Acetyldeoxynivalenol und 3,15-Diacetyldeoxynivalenol unterscheiden können, da die Antikörper gegen 3,7,15-Triacetyldeoxynivalenol gerichtet sind (JECFA, 2001).

4.2 Zearalenon

4.2.1 Struktur und Eigenschaften

Der Trivialname „Zearalenone“ (englisch) rühert von einer Kombination aus Giberella zeae, resorcyclic acid lactone, -ene (Hinweis auf die Doppelbindung vom C1´zum C2´) und - one (Hinweis auf das Keton am C-6´) (URRY et al., 1966). Es wird auch mit dem Synonym F2-Toxin bezeichnet.

Zearalenon gehört zur Gruppe der makrozyklischen Lactone (auch Macrolide genannt). Zearalenon besitzt mit seiner Summenformel von C₁₈H₂₂O₅ ein Molekulargewicht von 318. Die Substanz schmilzt unter Zersetzen bei 164-165°C. Die weißen Kristalle sind

löslich in Ether, Benzol, Chloroform, Ethylacetat, Acetonitril, Aceton, Alkoholen, wässrigen alkalischen Lösungen; dafür sind sie wenig löslich in Petrolether oder n-Hexan und unlöslich in Tetrachlorkohlenstoff (v. MILCZEWSKI, 1981; HIDY et al., 1977).

Abbildung 6 Zearalenon

Die chemische Struktur von Zearalenon und seinen Derivaten wurde von URRY et al.

(1966) aufgeklärt. Der chemische Name lautet: 2,4-Dihyroxy-6-(10-Hydroxy-6-Oxo-trans-1- Undecenyl)-β-Resorcylsäure-µ-Lacton (URRY et al., 1966). Eine umfassende Charakterisierung wurde von SHIPCHANDLER (1975) vorgenommen. Zu den bekanntesten Reaktionsprodukten gehören die diastereomeren Alkohole α- und β-Zearalenol. Ein weiteres bekanntes Zearalenonderivat ist die synthetische Verbindung α-Zearalanol, welche in vielen Ländern als Wachstumsförderer unter dem Handelsnamen Ralgro® für Fleischrinder eingesetzt wird, sowie seine diastereomere Verbindung β-Zearalanol und Zearalanon (HIDY et al., 1977; LINDSAY, 1985). Ralgro® ist seit 1989 in der Europäischen Union als Anabolika verboten. Insgesamt wurden inzwischen mehr als 100 Derivate des Zearalenons synthetisiert und aufgrund ihrer verschiedenen pharmakologischen Effekte klassifiziert (HURD, 1977;

SHIPCHANDLER, 1975).

Zearalenon besitzt im Gegensatz zu den endogenen Geschlechtshormonen, welche eine Steroidstruktur besitzen, eine phenolische Konfiguration (KURTZ und MIROCHA, 1978).

Die östrogene Aktivität des Zearalenons wird auf die den Östrogenen verwandte Molekülgeometrie und die Hydroxylgruppe am C2 zurückgeführt (GEDEK, 1980;

HABERMEHL, 1989).

Von großer diagnostischer Bedeutung ist die Eigenschaft des Zearalenons, unter UV- Licht zu fluoreszieren. Dabei ist die grünliche Fluoreszenz nach Anregung durch kurzwelliges Licht (256 nm) stärker ausgeprägt als die blaugrüne im langwelligen UV-Bereich (360 nm).

Das Absorptionsspektrum des in Ethanol gelösten Zearalenons hat drei Maxima im UV-Licht, und zwar bei 236, 274 und 316 nm (URRY et al., 1966; DESHPANDE, 2002).