Toxizitäts-Daten

Durch DON ausgelöste akute Toxizität wird hauptsächlich durch Erbrechen und Darmbeschwerden gekennzeichnet, und dies vor allem beim Schwein. Weiterhin stellen sich bei den Tieren Lustlosigkeit, Inaktivität, Hautreizungen, Nervenstörungen, Diarrhoe und rectale Hämorrhagien ein. Weiterhin können in den Mundpartien nekrotische Läsionen entstehen, die Mucosa des Magens und des Dünndarms wird zerstört, begleitet von Hämorrhagien, welche bis zu einer starken Gastritis und zum Tod führen können (PIER et al., 1980; SCUDAMORE, 1998; WOOD et al., 2003).

Die minimale Dosis an DON bei 9-10 kg schweren Schweinen, welche Erbrechen auslöst beträgt bei intraperitonealer Verabreichung 0,05 mg/kg KG (Körpergewicht) und 0,1–0,2 mg/kg KG bei oraler Gabe. Eine verminderte Futteraufnahme bei Schweinen wurde bei Konzentrationen von 0,6 mg DON/kg natürlich kontaminiertem Futter beobachtet, während die reduzierte Futteraufnahme bei Gehalten von 3-6 mg DON/kg Futter auftritt, wenn reines DON zum Futter zugemischt wurde (ERIKSON, 2003). Wird das Toxin in das Futter gegeben, so verringert sich der Futterverbrauch von 20–45 kg schweren Schweinen bei

einer Dosis von 3,6 mg/kg um 20% bzw. um 90% bei einer Dosis von 40 mg/kg (FORSYTH et al., 1977; SCHWEIGHARDT und SCHUH, 1981).

Die Werte für akute Toxizität (DON und Acetyl-DON) nach einer einzigen Dosisgabe ist bei allen Verabreichungsrouten ähnlich. Es gab keine bemerkenswerten Unterschiede bei der akuten Toxizität bei männlichen und weiblichen Tieren (IPCS, 1990). Die akute Toxizität in Bezug auf DON wurde von FORSELL et al. (1987) mit einer LD₅₀ (letale Dosis, bei der 50%

der Tiere sterben) oral an B6C3F₁-Mäusen von 78 mg/kg KG angegeben. In SCF (1999) ist außerdem die LD50 oral von DDY-Mäusen mit 46 mg/kg KG angegeben. Schweine sind zweimal empfindlicher bezüglich DON als Ratten (VESONDER et al., 1979).

Eines der Hauptmerkmale einer akuten und subakuten Toxikose durch Trichothecene ist die Erschöpfung des Lymphgewebes, was zeigt, dass Trichothecene die Immunantworten verändern (UENO, 1987b). Dies spiegelte sich auch in zahlreichen Studien wieder:

• Männliche, 4-6 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden bis zu 2 Wochen mit Futter gefüttert, welches mit DON versetzt war. Ab Konzentrationen von 1,5 mg/kg KG pro Tag und höher wurden reduzierte Immunantworten auf rote Blutkörperchen von Schafen diagnostiziert sowie ein verringertes Thymusgewicht mit extremer Atrophie (ROBBANA-BARNAT et al., 1988).

• Ähnliches zeigte sich bei einer weiteren Studie mit BALB/c-Mäusen, denen DON über das Futter in Dosen von 0,35 bis 6,5 mg/kg KG über 7 Tage verabreicht wurde. Die Futteraufnahme war bei allen Dosen verringert. Bei einer Dosis von 1,3 mg/kg KG wurde eine verringerte Gewichtszunahme, ein verringertes Thymusgewicht und eine verringerte kardiale Proteinsynthese festgestellt (ROBBANA-BARNAT et al., 1987).

• Weibliche B6C3F₁-Mäuse wurden 6 Wochen lang mit Futter gefüttert, welches DON enthielt. Bei Konzentrationen ab 1 mg/kg KG pro Tag und höher wurden erniedrigte Leukocytenzahlen festgestellt (FORSELL et al., 1986).

• Männlichen entwöhnten Swiss-Webster-Mäusen wurde DON in Konzentrationen von 0 bis 7,5 mg/kg KG per Schlundsonde über 35 Tage verabreicht. Die meisten der Tiere, denen die beiden höchsten Dosierungen (2,5 mg/kg KG und 7,5 mg/kg KG) verabreicht wurden starben. In der Gruppe mit 2,5 mg/kg KG pro Tag zeigten sich Läsionen in Thymus, Milz, Lymphknoten und Gastrointestinaltrakt. Bei allen DON-haltigen Dosierungen wurden abnehmende Futteraufnahme, verringertes Körpergewicht, verringerte Gewichte von Thymus und Herz sowie ein erhöhtes Magengewicht festgestellt (ARNOLD et al., 1986).

Nach subchronischer oraler Exposition an verschiedenen Species (Maus, Ratte, Schwein) zeigten sich zahlreiche Effekte, wie z.B. verringerte Futteraufnahme, verringerte Gewichtszunahme und veränderte Gehalte bei einigen Blutparametern einschließlich der Immunoglobuline (ERIKSEN und ALEXANDER, 1998; BAARS et al., 1999).

In einer 90-Tage-Studie mit männlichen Sprague-Dawley-Ratten wurden Futterrationen mit DON verabreicht (1 mg/kg KG pro Tag), welche zu einer 10%igen Gewichtsabnahme führten, obwohl das Futter nicht verweigert wurde (MORRISSEY et al., 1985).

Zu bleibenden signifikanten Erhöhung des Serum-IgA kam es bei weiblichen und männlichen B6C3F₁-Mäusen (8-10 Wochen alt), welche bis zu 12 Wochen mit DON in 10 mg/kg Dosen gefüttert wurden. Bei 2 mg/kg zeigte sich dieser Effekt nicht. Daraus folgte ein NOEL (no observed effect level) für DON von 0,4 mg/kg KG pro Tag (GREENE et al., 1994a).

Bei einer Studie über 94-96 Tage am Schwein mit dem kritischen Effekt des reduzierten Wachstums und Effekten auf die Leber sowie das Serumalbumin kamen BERGSJO et al.

(1993) zu einem NOAEL (no observed adverse effect level) von 0,06 mg/kg KG/Tag, mit natürlich kontaminiertem Futter.

B6C3F1-Mäuse besitzen nach IVERSON et al. (1995) eine ähnliche Empfindlichkeit wie Schweine bezogen auf lebenslange Fütterungsstudien. In einer chronischen Fütterungsstudie über 2 Jahre wurde B6C3F1-Mäusen Nahrung, welche mit reinem DON versetzt war, gegeben. Die Dosen waren im Bereich von 0 bis 1,1 mg/kg KG pro Tag bei den männlichen Tieren und 0 bis 1,5 mg/kg KG pro Tag bei den weiblichen Tieren. Das Überleben war nicht signifikant verändert. Die durchschnittliche tägliche Futtermenge war bei den weiblichen Tieren unverändert, bei den männlichen Tieren jedoch ab einer Dosis von 0,5 mg/kg KG pro Tag um ca. 8 % reduziert. Bei den Männchen fiel die signifikant reduzierte Gewichtszunahme bei 0,5 mg/kg KG und bei den Weibchen bei 1,5 mg/kg KG auf. Der unterdrückende Effekt des DON auf die Gewichtszunahme wird in dieser Studie nicht mit der verminderten Futteraufnahme assoziiert. Es wurde gezeigt, dass die Effekte auf das Körpergewicht in den ersten 20% der gesamten Lebensspanne verursacht werden. DON verursachte keine biologisch relevanten Effekte auf hämatologische und klinisch-chemische Parameter. Die Weibchen zeigten eine 56%ige Zunahme beim Serum-IgA und eine Zunahme unter 10% des IgG bei Dosen von 0,7 und 1,5 mg/kg KG pro Tag. Das relative Gewicht der Leber nahm bei den männlichen Tieren bei Konzentrationen ab 0,5 mg/kg KG pro Tag ab. Bei der Dosis von 1,1 mg/kg KG pro Tag war das relative Gewicht der Milz verringert sowie das relative Gewicht der Testes erhöht. Ein erhöhtes Auftreten von präneoplastischen oder neoplastischen Veränderungen wurde nicht beobachtet. Tatsächlich

zeigte sich eine signifikante dosisabhängige Abnahme bezüglich des Auftretens von präneoplastischen und neoplastischen Läsionen in der Leber. Dieser Trend beruht vielleicht auf der bekannten Korrelation zwischen Körpergewicht und dem Auftreten von spontanen Leber-Neoplasmen in dem verwendeten Mäusestamm. Die kritischen Effekten dieser Studie sind die Verringerung des Gewichtes bei beiden Geschlechtern und die Abnahme des relativen Gewichtes der Leber bei den männlichen Tieren. Der NOEL betrug 0,1 mg/kg KG pro Tag (IVERSON et al., 1995).

Eine vom IARC 1993 einberufene Arbeitsgruppe stufte DON in Gruppe 3, d.h. als „nicht klassifizierbar als menschliches Kanzerogen“ (not classifable as to its carcinogenicity to humans), ein (JECFA, 2001), jedoch war zu dieser Zeit die oben beschriebene negative chronische Studie an Mäusen noch nicht verfügbar.

In destilliertem Wasser gelöstes DON erwies sich als embryotoxisch und teratogen nach der Gabe über eine Schlundsonde an 4 aufeinanderfolgenden Tagen (Tag 8-11 der Gestation) an 15-19 Swiss-Webster-Mäuse (KHERA et al., 1982). Die Inzidenz der Resorption war 100% bei Dosen von 10 oder 15 mg/kg KG und 80% bei 5 mg/kg KG. Die Dosis von 5 mg/kg KG reduzierte die Anzahl der lebenden Feten und auch das durchschnittliche Gewicht der Feten, verglichen mit den Kontrollen. Der NOAEL in Bezug auf die Teratogenität der Maus mit dem kritischen Effekt von Skelettabnormitäten liegt nach KHERA et al. (1982) bei 0,5 mg/kg KG/Tag.

In einer Mehrgenerationenstudie zur Reproduktionstoxizität mit weiblichen und männlichen F₀-Mäusen (Swiss Webster) erhielten diese Futter, welches DON in Dosierungen von 2,0 mg/kg KG (15 männliche und 15 weibliche Tiere) bzw. 0,38; 0,75 oder 1,5 mg/kg KG (7 männliche und 59 weibliche Tiere) enthielt. Es gab 30 Kontrolltiere in der ersten Studie und 26 in der zweiten. Nach 30 Tagen Fütterung konnten sich die Mäuse innerhalb ihrer Dosisgruppe verpaaren, und die schwangeren Weibchen brachten ihre Nachkommen normal zur Welt. Die F_1a-Nachkommenschaft wurde bis zum Alter von 21 Tagen untersucht und dann getötet. Die F0-Mäuse wurden wieder verpaart. Die Weibchen, welche verpaart wurden, um F_1b-Nachkommen zu schaffen, wurden am Tag 19 der Gestation getötet, und die Feten wurden vor allem auf viszerale und Skelettfehlbildungen hin untersucht. Reduzierte Futteraufnahmen sowie verringerte Gewichte wurden bei den weiblichen und männlichen F0 -Mäusen beobachtet. Weiterhin wurden Verringerungen bei der Anzahl der lebenden Nachkommen und dem postnatalen Körpergewicht der F_1a -Nachkommenschaft, der Zahl der lebenden Feten und des fetalen Körpergewichtes der F1b-Generation festgestellt. Adverse Effekte auf die Fertilität der F₀-Mäuse konnten nicht festgestellt werden. Wichtige Fehlbildungen bei den F1b-Feten wurden ebenfalls nicht gefunden. Ergebnisse des

Austauschens von Nachkommen zwischen den Kontrollmuttertieren und den 1,5 mg/kg KG Muttertieren zeigten, dass sowohl die postnatale Überlebensrate als auch das Körpergewicht advers durch die pränatale Exposition ebenso wie durch eine kombinierte prä- und postnatale Exposition beeinflusst werden (KHERA et al., 1984). Der NOAEL mit dem kritischen Effekt der postnatalen Sterblichkeit liegt nach KHERA et al. (1984) bei der Maus bei 0,38 mg/kg KG/Tag.

Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht 165 g) wurden mit Futter, welches mit DON versetzt wurde (2 mg/kg KG) über 60 bzw. 15 Tage hinweg vor der Verpaarung gefüttert. Ratten, welche dieses Futter während der Schwangerschaft und der Stillperiode aufnahmen, zeigten keine klinischen Symptome einer Toxizität, jedoch wiesen sie geringere Gewichte als die Vergleichstiere auf. Bei nur 50% der Verpaarungen bei den mit DON gefütterten Tieren kam es zur Schwangerschaft im Vergleich zu 80% bei den Kontrolltieren. Die Gewichtszunahmen der Nachkommen waren bei beiden Gruppen bis zum Tag 14 vergleichbar, ab dann hatten die Kontrolltiere wesentlich größere Gewichtszunahmen. Histologische Veränderungen der Testes oder der Ovarien wurden bei den Nachkommen der behandelten Tiere nicht gefunden (MORRISSEY und VESONDER, 1985).

In einer weiteren Studie bezüglich der Teratogenität von DON wurden männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (3 Gruppen à 15 weibliche und 15 männliche Tiere) mit DON-haltigem Futter gefüttert, welches Gehalte von 0,25; 0,5 oder 1,0 mg/kg KG enthielt.

Die Kontrolltiere bestanden aus 2 Gruppen von männlichen und weiblichen Tieren. Nach 6 Wochen der Futtergabe wurden die Tiere verpaart. Die Weibchen bekamen weiterhin das Futter und wurden am letzten Tag der Schwangerschaft getötet. Die Feten wurden bezüglich ihrer pränatalen Entwicklung beurteilt. Adverse Effekte konnten mit Ausnahme der Erweiterung des Nierenbeckens und der Harnblase nicht beobachtet werden (KHERA et al., 1984).

Es wird von 2 Studien an Schweinen berichtet, bei denen DON über das Futter während der Gestation verabreicht wurde. Die Tiere, denen 0,1-4,8 mg DON/kg Futter verabreicht wurde, zeigten offensichtlich keine mütterliche Toxizität oder verringerte Futteraufnahme. Jedoch verursachten 1-2 mg/kg Futter (entspricht 0,03-0,07 mg DON/kg KG/Tag) verringerte Gewichtszunahmen. Effekte bezüglich der Anzahl an Nachkommen, der Überlebens- oder der Missbildungsrate wurden nicht beobachtet. Dosierungen unterhalb von jenen, welche zu verringerten Gewichtszunahmen führen, zeigten keinen Effekt von DON bezüglich der Reproduktion (BERGSJO et al., 1992; 1993; ERIKSEN und ALEXANDER, 1998; BAARS et al., 1999).

Zusammenfassend ist zur Reproduktionstoxizität und Teratogenität von DON zu sagen:

• DON wirkte teratogen bei Mäusen nach Verabreichung mit der Schlundsonde.

• Jedoch erwies es sich bei Mäusen und Ratten als nicht teratogen, wenn es oral über das Futter verabreicht wurde.

• Eine Zunahme der postnatalen Mortalität wurde bei Mäusen bei einem NOAEL von 0,38 mg/kg KG beobachtet (KHERA et al., 1984).

• Bei Ratten wurde eine leichte Abnahme der Fertilität bei 2 mg/kg KG (einzige getestete Dosis dieser Studie) beobachtet, während bei einer anderen Rattenstudie Dosierungen bis zu 1 mg/kg KG keinerlei Effekte zeigten.

DON ist nicht mutagen bezüglich der Salmonella typhimurium Stämme TA98, TA100, TA1535, TA1537 und TA1538, jeweils mit oder ohne S-9-Fraktion aus der Rattenleber (KUCZUK et al., 1978; UENO et al., 1978; WEHNER et al., 1978a). Nicht-toxische und toxische Dosen an DON (0,1-1000 mg/l) erhöhen die außerplanmäßige DNA-Synthese in primären Kulturen an Rattenhepatocyten nicht signifikant (BRADLAW et al., 1985). DON (Gehalte von 2-3 µg/ml) induzierte auch keine Genmutationen im HPRT-Locus-Test an Hamster-V79-Zellen. DON steigert die Zelltransformation in Embryozellen der Maus in vitro und induzierte klastogene Effekte. Es hemmt die Proteinsynthese in chinesischen Hamster-Ovarzellen in vitro im selben Dosisbereich, bei dem auch klastogene Effekte auftreten (HSIA et al. 1998; LEATHERMAN und MIDDLEBROOK, 1993; ROGERS und HEROUX-METCALF, 1983).

Trichothecene beeinträchtigen das Immunsystem. DON-abhängige Apoptose wurde in Makrophagenzellen von Mäusen und Ratten in vitro beobachtet. Diese Ergebnisse sind bei allen Tieren relevant, da aus der Verabreichung von Trichothecenen an Nagetiere in vivo Apoptose in Thymus, Milz, Knochenmark und Leber resultieren (IHARA et al. 1997 und 1998; MIURA et al., 1998; SHINOZUKA et al., 1997 und 1998).

Trichothecene erhöhen die Produktion an IgA und reduzieren die Resistenz der Versuchstiere bezüglich bakteriellen Infektionen. Wie weiter vorne schon beschrieben führten IVERSON et al. (1995) eine 2-Jahresstudie mit B6C3F1-Mäusen durch. Diesen wurde Futter mit zugesetztem DON in Dosen von 0 bis 1,1 mg/kg KG pro Tag bei männlichen Tieren und 0-1,5 mg/kg KG pro Tag bei weiblichen Tieren verabreicht. Ausschließlich bei den Weibchen zeigte sich ein linearer dosisabhängiger Anstieg des Serum IgA und IgG.

In einem anderen Versuch mit B6C3F₁-Mäusen (8-10 Wochen alt; Dosen von 2-5 mg/kg KG pro Tag) zeigte sich, dass die Peyers Plaques Lymphocyten und mit etwas geringerem Ausmaß auch die Lymphocyten der Milz signifikant mehr IgA produzieren als diejenigen der Kontrolltiere (PESTKA et al., 1989 und 1990a, b; BONDY und PESTKA, 1991). Dieses IgA wird eine zeitlang in der Niere eingelagert (DONG und PESTKA, 1993).

DON rief bei in vitro-Versuchen an peripheren Blutlymphocyten der Ratte und des Menschen dosisabhängige Verringerungen der Proliferation der Lymphocyten hervor. Die Konzentration, bei der DON eine 50%ige Hemmung der Blastogenese produzierte sind 90 ng/ml bei der Ratte bzw. 220 ng/ml bei menschlichen Lymphocyten (ATKINSON und MILLER, 1984). Niedrige Dosen von DON können jedoch die mitogen aktivierte Proliferation der Lymphocyten auch stimulieren und die Resistenz in Bezug auf Infektionen erhöhen, was jedoch von der Anwendung des Toxins, der Dauer und der Dosis abhängt. Die verminderte Antwort des Immunsystems wird einfach durch die Hemmung der Proteinsynthese und die Apoptose, welche durch Trichothecene verursacht wird, begründet (PESTKA und BONDY, 1994; BONDY und PESTKA, 2000). Der stimulierende Effekt ist schwieriger zu erklären, jedoch wiesen Studien darauf hin, dass die Induktion von Cytokinen beteiligt ist.

Möglicherweise werden diese über die Induktion der MAP-Kinase hochgeregelt, was zu einer erhöhten mRNA-Expression führt (BONDY und PESTKA, 2000; ZHOU et al., 2003).

Das Ergebnis zweier Studien mit Mäusen zeigt, dass DON die Wiederstandsfähigkeit bezüglich Bakterieninfektionen (Listeria monocytogenes und Salmonella enteritidis) unterdrücken kann. Die immunsuppressiven Effekte der Trichothecene resultieren in einer erhöhten Rate und Schwere an Infektionen bei den Tieren. Betrachtet man diese erhöhte Infektionsempfindlichkeit, dann wird von einem NOAEL von 0,25 mg/kg KG/Tag bei Swiss-Webster-Mäusen (TRYPHONAS et al., 1986) und einem LOEL (lowest observed effect level) von 0,22 mg/kg KG/Tag bei männlichen BALB/c-Mäusen berichtet (BAARS et al., 1999;

DEIJNS et al., 1994). Nach PESTKA et al. (1987) wird die Resistenz bezüglich Listeria monocytogenes sogar in größerem Ausmaß reduziert, wenn DON und Zearalenon gleichzeitig verfüttert werden.

Obwohl DON weniger akut toxisch ist als die potenteren Trichothecene, werden die immuntoxischen Eigenschaften als von größerer Wichtigkeit eingestuft als die von z.B. T-2-Toxin verursachten spektakulären Hämorrhagien (GREENE et al., 1994b). Veränderungen im Immunsystem von Mäusen treten schon bei geringen Konzentrationen auf, ähnlich jenen, denen der Mensch auch ausgesetzt sein kann (HSIEH, 1987). Einer der am häufigsten beobachteten Effekte in Kurzzeit- und Langzeitstudien bei den meisten Spezies ist das reduzierte Wachstum. Bei Verabreichung von höheren Dosen werden Thymus, Milz, Herz

und Leber angegriffen. Als NOEL wird 0,1 mg/kg KG pro Tag aus der Studie von IVERSON et al. (1995) angenommen, da in der 2-Jahres-Studie Mäuse bei dieser Dosis nur eine leichte, jedoch nicht signifikante Erniedrigung des Körpergewichtes und keine weiteren Veränderungen aufwiesen. DON erwies sich in obiger Studie als nicht karzinogen bei Mäusen. Bei Gentoxizitätstests war DON negativ in in vitro Genmutationstests, jedoch wurden bei weiteren Tests klastogene Effekte induziert. DON besitzt daher nur eine fragliche oder keine Gentoxizität, ist jedoch definitiv ein Krebspromotor aufgrund seiner Cyto- und Immuntoxizität (HSIEH, 1987). Möglicherweise kann die Entwicklung von Krebs durch die Selektion von Zellen, welche resistenter bezüglich Cytotoxizität sind, beziehungsweise durch die Stimulation der Teilung von Zellen, welche genetisch verändert sind, induziert werden.

Vielleicht ist DON auch ein Promotor der Karzinogenese durch die Schädigung des Immunsystems eines Lebewesens und so durch die Unterminierung des natürlichen Abwehrmechanismus gegen die Entwicklung von abnormalen Zellen (HSIEH, 1987). DON zeigte sich teratogen bei Mäusen nach der Verabreichung per Schlundsonde. Nach oraler Verabreichung an Ratten und Mäuse traten jedoch keine teratogenen Effekte auf. DON zeigte Reproduktionseffekte wie z.B. Embryotoxizität und erniedrigtes Gewicht der Feten in verschiedenen Spezies (Maus, Ratte, Schwein) (JECFA, 2001).

Der provisorische ADI (acceptable daily intake) kann daher aus den NOAELs von Toxizitätsstudien mit der Einbeziehung von Unsicherheitsfaktoren berechnet werden. Von der EU wurde ein derzeitiger ADI von 1 µg/kg KG pro Tag unter Einbeziehung eines Sicherheitsfaktors von 100 aufgrund der Studie von IVERSON et al. (1995) angenommen (PIETERS et al., 2002). Bei dieser täglichen Aufnahmemenge soll es nicht zu Effekten wie der Beeinflussung des Wachstums, des Immunsystems und der Fortpflanzung durch DON kommen (JECFA, 2001).

Unter Zugrundelegung der durchschnittlichen täglichen Aufnahmemengen an DON über Brot (Mittelwert von 107 Proben [Jahr 1999]: 154 µg/kg) und Nudeln (Mittelwert von 39 Proben [Jahr 1999]: 440 µg/kg) ergibt sich für einen Erwachsenen von 60 kg KG eine Ausschöpfung des ADI-Wertes (1 µg/kg KG pro Tag) von 63% für 1999 allein aus Brot und Nudeln mit jahrgangsabhängig signifikanten Schwankungen (DFG, 2001).

Kinder weisen nicht nur die höchste relative Aufnahmemenge an DON auf (aufgrund der relativ hohen Weizenaufnahme in dieser Personengruppe), sondern gehören auch der durch die Effekte von DON (geringeres Wachstum) am meisten verwundbaren Personengruppe an.

Kinder von einem Jahr weisen die höchste Aufnahmemenge an DON auf (PIETERS et al., 2002). Nach PIETERS et al. (2002) sind 80% der einjährigen Kinder Gehalten oberhalb des

derzeitigen ADI, und 20% der einjährigen Kinder sind Gehalten, welche mindestens doppelt so hoch sind wie der derzeitige ADI, ausgesetzt.