Das Verfahren ist fur die Analyse von Bildern unterschiedlicher M-FISH Exp erimente -sowohl chromosomal und sub chromosomal, als auch inter- und intrachromosomal- geeignet

zur

Erlangung der Doktorwurde

der

Naturwissenschaftlich-Mat hemati schen

Gesamtfakultat

der

Ruprecht-Karls-Universitat Heidelberg

vorgelegt von

Dipl.-Phys. Kaan Saracoglu

aus Kirkuk

Tag der mundl. Prufung 7. Novemb er2001

Gutachter:

Prof. Dr. Bernd Jahne

Prof. Dr. Dr. Christoph Cremer

Multiplex-FISHist einevor wenigen Jahren entwickelteMetho de, mit der sich alle

menschlichen Chromosomen mit mehreren Farbstoen kombinatorisch farb en las-

sen [Sp e96a , Sp e96b ,Sch96]. BeiVerwendung von mehralsvier Farb en lassen sich

b ei 31 Kombinationsmoglichkeitenalle Chromosomen in einer eindeutigen kombi-

natorischen Weise farb en und werden mit geeigneten sp ektroskopischen Metho den

anhand ihrer sp ektralen Informationunterscheidbar.

Im Rahmen dieser Arb eit hab e ich ein automatisches Verfahren fur die Analy-

se von Bildern M-FISH markierter Chromosomen und sub chromosomaler Prob en

entwickelt,das signikanteVerb esserungen und robuste Analysen,sowieerweiterte

Moglichkeiten der Analyse mit Hilfe der M-FISH Technologie bietet. Das Verfah-

ren basiert auf Clusteranalyse im Farbraum und kombiniert Farbinformation mit

Ortsinformation,umchromosomaleBereicheimBildvolumenzuidentizieren. Das

Verfahren ist fur die Analyse von Bildern unterschiedlicher M-FISH Exp erimente

-sowohl chromosomal und sub chromosomal, als auch inter- und intrachromosomal-

geeignet. Identizierung einzelner Chromosomen, sowie Volumenund Positionsb e-

stimmungb eidreidimensionalenAufnahmenimInterphase-ZellkernsindimPrinzip

eb enso moglich.

Image Analysis of MFISH - Summary

Multiplex-FISHis a combinatorialstaining technique that allows the simultaneous

detection and discrimination of all human chromosomes. Using at least ve uo-

ro chromes all chromosomes can b e uniquely lab eled in a combinatorial way and

identiedby their sp ecic sp ectral signature.

Within this thesis I develop ed a novel approach for the automated analysis of M-

FISH images, yielding robust classication results and allowing the analysis of M-

FISH images of dierent exp eriments. The metho d combines sp ectral information

with spatial informationto tesselatethe image into regions of similarcolor. Subse-

quentlyaclusteranalysisincolorspace andanal classicationstepare p erformed

to identify the biological targets. This approach is applicable to images of dif-

ferent M-FISH exp eriments, allowing the analysis of interchromosomal as well as

intrachromosomal abnormalities in the genome. It also allows the 3D analysis of

M-FISH lab eled chromosomesininterphase nuclei.

1 Biologische Grundlagen 14

1.1 Die DNA. . . 14

1.2 Gene . . . 16

1.3 Genexpression . . . 17

1.4 Replikationvon DNA-Molekulen. . . 18

1.5 Der Zellzyklus . . . 18

1.6 GenetischeVeranderungen . . . 19

1.7 In Situ Hybridisierung . . . 20

1.8 Multiplex-Fluoreszenzin situ Hybridisierung . . . 21

1.9 ComparativeGenomic Hybridization(CGH) . . . 22

2 Physikalische Grundlagen 24 2.1 Mikroskopie . . . 24

2.1.1 Linsen . . . 24

2.1.2 Auosungsvermogen . . . 25

2.1.3 Axiale Auosung . . . 26

2.1.4 KonfokaleMikrokopie (CLSM). . . 27

2.2 LaserinduzierteFluoreszenz (LIF) . . . 28

2.3 Grenzen der konfokalen Mikroskopie. . . 30

2.3.1 Photonenstatistik . . . 30

2.3.2 Sattigungs- und Bleicheekte . . . 31

2.3.3 Nyquist Theorem . . . 32

2.4 Aufnahmevon M-FISH-Bildern . . . 32

2.4.1 Das MFISH System. . . 32

2.4.2 Das SKY System . . . 34

3 Grundlagen der Bildverarbeitung 37 3.1 Klassizierung . . . 37

3.2 Clusteranalyse . . . 37

3.2.1 K-Means-Algorithmus . . . 39

3.2.2 Fuzzy-Clusteranalyse . . . 39

3.3.1 Einfache Verkettung . . . 42

3.3.2 Hybride Verkettung . . . 42

3.3.3 Zentroide Verkettung . . . 42

3.4 Rauschen . . . 43

3.5 Faltung und Filterung . . . 44

3.5.1 Der Gausslter . . . 45

3.5.2 Der Medianlter . . . 46

3.5.3 Anisotrop er Diusionslter. . . 47

3.6 Dekonvolution . . . 49

4 Methodik 51 4.1 Maximum-Projektion . . . 52

4.2 Hintergrundskorrektur . . . 53

4.3 Farbinformationund Datenraum . . . 55

4.4 Bedeutung der Farb e b ei M-FISH Bildern . . . 56

4.4.1 Winkelals Distanzmass . . . 57

4.4.2 Euklidischer Abstand als Distanzmass . . . 58

4.5 Mo dellbasierteSegmentierung . . . 59

4.5.1 Farbmo dell . . . 60

4.6 Tesselierung . . . 61

4.6.1 Wahl der Startpunkte b eim Regionenwachstum . . . 62

4.7 Clustersuche . . . 63

4.8 Klassizierungder Regionen . . . 64

4.8.1 Merging klassizierterRegionen . . . 66

4.9 Zusammenfassungder Metho dik . . . 66

5 Anwendungen 69 5.1 Anwendungen in2D . . . 69

5.1.1 NormaleMetaphase . . . 69

5.1.2 Ab errante Metaphase . . . 70

5.1.3 ChromosomaleBarco des . . . 72

5.1.4 Telomere . . . 73

5.2 Anwendungen in3D . . . 74

5.2.1 3-Farb en Exp eriment mit sieb enChromosomenpaaren in der Interphase . . . 75

6 Ergebnisse und Diskussion 78 6.1 Auosung und Hybridisierungsschema. . . 79

6.2 Klassikationsgute von M-FISHimVergleichmitSKYfurMetapha- sen in 2D . . . 81

6.3.1 Binare Klassikation . . . 82

6.3.2 Klassikation mitEuklidischemAbstand . . . 84

6.3.3 Regionenwachstum mit Euklidischem Abstand als  Ahnlich- keitsmass . . . 85

6.3.4 Clustersuche  ub erEuklidischenAbstand . . . 87

6.4 ChromosomaleBarco des . . . 89

6.5 Telomere . . . 90

6.6 Anwendungen in3D . . . 91

6.7 ZusammenfassendeDiskussion . . . 95

7 Zusammenfassung 98 8 Bedienung der Software 102 8.1 Die Datei classes . . . 102

8.2 Die Datei menu . . . 104

9 Publikationen im Rahmen dieser Dissertation 109

Robert Frost

"Der Mensch,dieKrone derSchopfung, das klugsteund stolzesteGeschopf,das die

Evolutionhervorgebrachthat,steht,wasseinengenetischenBauplanangeht,fastauf

einerStufemitWurmernund Fliegen."Diesenb emerkenswerteAussagekonnteman

am 12.02.2001 in einer grossen deutschen Tageszeitung lesen. Die Entschlusselung

des menschlichen Genoms brachte zu Tage, dass das menschliche Erbgut oenbar

nur zwischen 26000 und 40000 Gene b esitzt, etwas mehr als der Fadenwurm, der

einen Millimeterlang ist und praktisch



ub er kein Gehirn verfugt. No ch vor einem

Jahr waren Forscher mit einer Zahl von bis zu 130000 Genen ausgegangen. Die-

se Zahl b eruhte auf der Vorstellung, dass ein Gen fur die Synthese eines Proteins

zustandig ist, die Zahl der Gene in etwa derjenigen der Proteine entspricht. Diese

Vorstellung istdamit hinfallig.

DenGenenstehenalsodrei-biszehnmalsovieleProteinegegenub er. Oenbar kann

einGenden BauplanfurverschiedeneProteineliefern. MitdieserErkenntnisgewin-

nen weitere Zweige der Molekularbiologie an Bedeutung: Post- Genomics, das sich

mit der Aktivierung und Deaktivierung von Genen und dem Ableseprozess durch

Botenmolekuleb eschaftigt, und dieProteomik, dieUntersuchung der Proteine, ih-

rer Pro duktion und ihres komplexenWechselspielsin den menschlichenZellen. Die

Erforschung von Proteinen ist jedo ch sehr viel komplexer, da ihre Wirkung nicht

nurauf ihrermolekularenStruktur,sondern auchaufihrerDynamik,ihremZusam-

menspiel b eruht. Eiweisse werden in der Zelle synthetisiert, mo diziert,angehauft

und transp ortiert,sieb eeinussenandereProteineeb enso wieGene. DieAnnahme,

dass Gene und Proteine sich in geradlinigen kausalen Wirkungsketten verhalten,

dass zum Beispiel Gen A fur die Synthese von Protein A sorgt, das dann Protein

B aktiviert, welches wiederum Eiweiss C anschaltet, ist nach dem heutigen Stand

der Erkenntnis



ub erholt. Ihr Verhaltenistviel zufalliger und unstrukturierter. Der

Biologie fehlt jedo ch der theoretische Rahmen, um solcheSysteme zu b eschreib en,

wahrend in der Mathematik und Physik schon zahreicheMetho den existieren, um

solchesVerhalten zuerfassen.

Do ch nichtnurdie geringeZahl der Gene isterstaunlich,sondern auchihre Vertei-

lunginnerhalbdesGenoms. DagibtesausgedehnteBereiche,indenensichgarkeine

Gene b enden, wahrend sieinanderen Abschnittendichtan dichtliegen. Auchdie

Verteilung der Gene auf die Chromosomen ist nicht gleichmassig. Chromosom 18

b eispielsweise ist b esonders genarm und b esteht ub er die Halfte aus solchen Leer-

stellen.

Der Mithilfe von Bioinformatikern ist es zu verdanken, dass man heute ca. 10000

menschlichen Genen eine Funktion zuordnen kann. Etwa 1100 menschliche Gene

sind dafur b ekannt,eineKrankheitauslosen zukonnen, wenn siemutieren,also ihr

genetischerCo deverandertwird. Glucklicherweisegibt eszwarmehralseinhundert

Gene, dieRepaparaturwerkzeuge b ereitstellen,deren Aufgab ees ist,solcheDefekte

bosartige Tumorezuruckzufuhren. Mehr



ub erdieUrsachender Krebsentstehungzu

erfahren und entsprechendeTherapienzu entwickeln,istdahereineder wichtigsten

Aufgab en der medizinischenForschung.

Die b eiKrankheiten auftretenden genetischen Anomaliensind dab ei vielfaltig. Ge-

ne konnen



ub erreprasentiert sein o der ganz fehlen, ab er auch ganze Chromosomen

konneninkrankenZellenfehleno der inmehralszweiKopienauftreten. Sehrhaug

kommtes auch zu inter- und intrachromosomalenUmbauten: Ein DNA Abschnitt

von ChromosomA ndetsich

"

plotzlich\ aufChromosom Bwieder,o der aufeinem

versetztenBereichdesselb en Chromosoms.

Dab ei gibt es verschiedene exp erimentelle Metho den, um die genomische Struk-

tur und Aktivitat aufunterschiedlichergenomischerAuosung sichtbarzumachen.

Allen imfolgenden aufgefuhrtenMetho den liegtdie Technikder Hybridisierung zu-

grunde. Man machtsich hierdie Eigenschaft der DNA-Bausteine (Nukleinsauren)

bzw. Sequenzenzunutze,mitinihrerBasenabfolgekomplementarenSequenzenBin-

dungen einzugehen: Interessierende Bereiche auf den DNA Einzelstrangen konnen

sichtbar gemachtwerden,in demder diesemBereichkomplementareAbschnitt mit

radioaktiveno der uoreszierenden Molekulen markiertwird.

DazuzahlenunteranderemdieComparativeGenomische Hybridisierung(CGH)zur

Analyse der Kopienanzahl chromosomalerRegionen mit einer Auosung von etwa

10Mbp unddieSerielle Analyse von Genexpression zur Untersuchung derAktivitat

einzelnerGene,mithohercytogenetischerAuosungimBereichvoneinigentausend

Basenpaaren. SiendenihreAnwendungimBereichderBio-Chip-Technologieunter

anderem b ei den sogenannten DNA-Microarrays. Ein DNA-Microarray o der DNA-

Chip b esteht aus einem Trager mit einer meist glasernen Ob erache, auf den ra-

sterformig unterschiedlicheNukleinsaurenals Hybridisierungszieleaufgetragen und

xiert werden. Anschliessend gibt man in Losung b endliche komplementare Nu-

kleinsaure-Molekule hinzu. Dab ei handelt es sich in der Regel um die Bausteine

zweierunterschiedlicherDNAs,diezuvormitunterschiedlichenFarbstoenmarkiert

wurden,wob eieinealsReferenzdient. ZweiwichtigeAnwendungendieserTechnolo-

giesinddieUntersuchunggenomischerImbalanzenin der Tumorgenesemitgenomi-

scherDNA,unddieAnalyseder GenexpressionmitmRNA(messengerRib oNucleic

Acid),das Aufschlussgibt



ub erStowechselwege,ReaktionenaufArzneimittelund

Umweltb edingungen. Parallele Abfrage einer grossen Anzahl von Zielstellen in der

DNA, Automatisierungder Chippro duktion,Automatisierungder Auswertung und

die VerizierbarkeiteinzelnerDaten mitherkommlichenmolekularbiologischen Me-

tho den sind dab ei wichtige okonomischeVorzuge der Chip-Technologie.

Eineexp erimentellerAnsatz mitniedrigerer genomischerAuosungimBereichvon

einigenMillionenBasenpaaren istdiesogenannteFluoreszenzin situHybridisierung

zischerDNA-Prob en. EineWeiterentwicklunghiervonistdiesogenannteMultiplex-

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (M-FISH),eineTechnikdiees erlaubt,mitHilfe

mehrerer Farbstoedas gesamteGenom -also alle24 Chromosomen-,in einem Ex-

p erimentmit unterschiedlichen Farb en und Farbkombinationenzu markieren. Mit

geeigneten sp ektralen Techniken wird die Identizierung aller Chromosomen einer

Zelle eines Patienten und damit ihre Sortierung in ein sogenanntes Karyogramm

moglich(Karyotypisierung), das Aufschluss ub er die Kopienanzahl der Chromoso-

menund dieinterchromosomalenAb errationengibt. Ab er auchintrachromosomale

Ab errationenundAnomalieninsp ezischenBereicheninnerhalbder Chromosomen

konnenmitdieser Technologie sp ezischgefarbt und untersucht werden.

MitsolchenAnalysenkonnenZusammenhangezwischenKrankheitsbild(Phanotyp)

undgenomischerStruktur(Genotyp)erstelltwerden. FruhdiagnosenundPrognosen

zum Krankheitsverlaufwerden auf der Basis dieser Informationen moglich. Recht-

zeitigetherap eutischeMassnahmenkonnenzumTeilschonvorAusbruchderKrank-

heit eingeleitet werden, was die Chancen einer erfolgreichen Behandlung drastisch

erhoht. AnomalieninderDNAkonnenaufunterschiedlichengenomischenAuosun-

gen auftreten. Es kann daher sein, dass mehrere Exp erimentenotwendig sind, um

alle b ei einer Krankheit sp ezisch auftretenden genetischen Ab errationen zu erfas-

sen. Gewonnene exp erimentelle Daten mussen daher in Datenbanken gesp eichert,

aktualisiertund mitneuen exp erimentellenResultatenerweitert undsynchronisiert

werden. Mit Verfahren aus dem Bereichder kunstlichen Intelligenzlassen sich aus

solchen Datenbanken Strukturen detektieren,die Ruckschlusse auf funktionale Zu-

sammenhangeliefern.

MitfortschreitenderEntwicklunginderBiotechnologie,derzunehmendenDatenut

und Komplexitatder zub ewaltigenden Aufgab enistinden letztenJahrenauchder

Bedarf an automatischen Analyseverfahren zur Fruherkennunggenetischb edingter

Krankheiten rapide angestiegen. Damit erhebt sich die Notwendigkeit interdiszi-

plinarerForschungund Entwicklung-diese Arb eitisteinSchrittindiese Richtung.

Kern dieser Dissertation war die Entwicklung einer robusten, exiblen, automa-

tischen Analysemetho de von M-FISH Bildern. Es sollte nicht nur die zuverlassi-

ge Karyotypisierung von normalen und ab erranten Zellen, sondern auch die Ana-

lyse von alternativen, auf M-FISH basierenden Exp erimenten mit kleinen DNA-

sp ezischen Prob en und Exp erimenten zur Untersuchung von intrachromosomalen

Anomalien erlaub en. Eine Analyse von dreidimensionalen Bildaufnahmen von M-

FISH markierten Chromosomen im Interphase-Zellkern ist eb enso moglich. Mor-

phologische Grossen der einzelnen Chromosomen und ihre relativen Positionen zu-

einander konnen b estimmt werden. Wahrend im zweidimensionalen das Resultat

direktveriziertwerdenkann, istdiesimdreidimensionalenFallschwieriger,da das

Signal-Rausch-VerhaltnishierschlechterunddieFarbinformationdamitdiuser ist.

WeiterhinfuhrenUb erlappungenzwischenChromosomeninnerhalb desZellkernszu

irrefuhrenden Farbsignalen, die zu erkennen nur schwer wenn nicht gar unmoglich

ist. Und nicht zuletzt die dreidimensionaleStruktur macht eine Verizierung

 ub er

alle Bereicheaufwendig.

ZentraleBedeutungb eidieserArb eit hattedieAnalyseimmehrdimensionalenFar-

braum unddie Untersuchung der Farbraumcharakteristikb eiunterschiedlichenEx-

p erimenten. Dab ei ging esnichtnur umdieFrage einer robusten Identikation aus

bildverarb eitungstechnischer Sicht, sondern auch um Fragen der exp erimentellen

Moglichkeiten, die farblicheUnterscheidung der Chromosomen und damit die

"

ex-

p erimentelle\Auosungzuoptimieren,umeineoptimaleIdentifkationzuerreichen.

Wichtigab er war esauch,Grenzendieser Technikund Fehlerquellender akkuraten

Identikation zu erkennen und aufzuzeigen. Zu Beginn dieser Arb eit handelte es

sichb eiMFISHumeinesehrneue Technologie. Auffolgende Arb eitenkonntediese

Dissertation aufsetzen:[Sp e96a , Sch96 , Gar96 , Eil98].

BeiHybridisierungsexp erimenten treten schwerquantizierbare Rauschquellen auf.

Das ideale Hybridisierungsexp eriment sollte eine homogene Farbung der biologi-

schen Praparate gewahrleisten. Das ist jedo ch nur selten der Fall, meistens sind

die Intensitatsschwankungen innerhalb kleinerBereichesehr stark. Die Grunde fur

diese Inhomogenitaten sind im Detail no ch nicht genauverstanden. Bei Mehrfach-

hybridisierungen,wieesb eiM-FISHExp erimentenderFallist,kommenno chweite-

re Schwierigkeiten hinzu. BestimmteFluoreszenzkombinationenfuhren b ei einigen

ChromosomenzusehrschwachenHybridisierungen. DieHybridisierungsqualitatder

unterschiedlichenFarbstoeunddieBildaufnahmederunterschiedlichenFarbkanale

mussenaufeinander abgestimmtwerden. Standardisierte Farb eprotokolle und Pro-

b enkitshab ensicherstkurzlichetabliert,weshalbjedesLab or,dasaufdiesemGebiet

arb eitet, zunachst sein eigenes Hybridisierungsprotokoll und -Schema entwickelte.

Das wiederum stellte hohe Anspruche an die Bildverarb eitung und erforderte e-

xible Analysemetho den, um der unterschiedlichen Qualitat der anfallenden Daten

gerechtzuwerden.

Daessichb eiderAnalysegenomischerImbalanzenmitHilfederCGHgleichfallsum

ein Mehruoreszenzexp erimenthandelt,konnten wesentlicheTeileder fur die Ana-

lyse von M-FISH Bildern entwickelten Metho den auch auf die Analyse von DNA-

Microarraysangewendetwerden. DazuwurdeeigenseineSoftwareimRahmeneiner

Diplomarb eit entwickelt[Rud00]. Obwohl der Schwerpunkt dieser Arb eit nichtauf

dieser Entwicklungb eruht,werdenauchfurdiese Anwendung diefurdas Verstand-

nis notwendigenbiologischenund exp erimentellenGrundlagen dargelegt.

Zunachst lege ich die fur diese Arb eit relevanten biologischen und fur die Bildauf-

nahme wichtigen physikalischen Grundlagen in Kapitel 1 und 2 dar. Dazu zahlen

vor allem die Technik der Multiplex - Fluoreszenz in situ Hybridisierung und die

sp ektrale Bildaufnahme am Mikroskop. Anschliessend geb e ich im dritten Kapitel

eineEinfuhrunginrelevantegrundlegendeBildverarb eitungsop erationen. InKapitel

4 b eschreib eichausgehend von der Analysedes Farbraums dievon mirentwickelte

Metho dik, die sich zusammengefasst am Ende des Kapitels wiederndet. Anwen-

dungen, die ich in Kapitel 5 prasentiere, sind im vierten Kapitel zum Teil schon

vorweggenommen, um den Weg der Entwicklung anschaulich und nachvollziehbar

zu dokumentieren. Ergebnisse meiner Metho dik diskutiere ich in Kapitel 6. Eine

etwas ausfuhrlichere Zusammenfassung ndet sich am Ende dieser Arb eit und ist

bilingualgehalten.

Biologische Grundlagen

DieZelleistdiestrukturelleBasisfurjedenOrganismusundweistStowechselsowie

die Fahigkeit,sich zurepro duzierenauf. Man unterscheidetzwischenProkaryonten

und Eukaryonten, letztere weisen eine Zellkern auf und b estehen im wesentlichen

aus dem Nukleus (Zellkern), dem Cytoplasma und der Zellmembran. Im Zellkern

b endet sichdas Chromatin, dieGesamtheit der Chromosomen, und als kompakte

Struktur das Nukleolus (Kernkorp erchen), indem die ribosomale RNA (rRNA) sy-

thetisiert wird. Das Zellkernplasma (Karyoplasma) wird durch die Kernmembran

vom Cytoplasma getrennt. In den Zellen aller Leb ewesen istdie

"

Erbgutinformati-

on\ auf demselb en Makromolekul-der DNA- gesp eichert. Durch Untersuchungen

an Bakterien und ihren Viren 1

ist in den vierziger Jahren erstmals der eindeuti-

ge Nachweisfurdie Funktion der DNA als Trager dieser Informationen, der Gene,

gelungen.

1.1 Die DNA

Die Desoxyrib onukleinsaureisteinlangesPolymermolekul,dasaus kettenartigmit-

einanderverbundenenPurinbasenAdenin,Thymin,GuaninundCytosin,sowiewei-

teren Proteinen, dieals Geruststoe dienen,aufgebaut ist. Der Grundbaustein der

DNA istdas Nukleotid, das sich aus dreiEinheitenzusammensetzt:

einemZucker,der Desoxyrib ose

einer stickstohaltigen Purinbase

und einer Phosphorsaure.

Im Falle der DNA ist der Zucker eine Desoxyribose und die moglichen Basen sind

Adenin (A), Guanin (G), Cytosin(C) und Thymin (T). Bei der RNA dagegen ist

1

Dasentscheidende Exp erimentdazustammtvonO.AveryundMitarb eitern.

funfzigerJahrenhat E.Chargafestgestellt,dass dasVerhaltnisvonA zuT(U)und

das von G zu C immergleichist, weshalb die prozentuale Basenzusammensetzung

jeder DNAvorausgesagt werden kann.

In der Folgezeit zeigten Rontgenstruktur-Analysen, dass die DNA eine regelmassi-

ge Perio dik aufweist und aus zwei Einzelstrangen aufgebaut ist. 1953 schlossen

J.D.Watson und F.Crickauf dieDopp elhelixstruktur.

In Abb. 1.2 b) ist die Dopp elhelix als Dopp elspirale gezeigt, deren Einzelstrange



ub erStufen(Wasserstobruckenbindungen)miteinanderverbundensind. DieBander

enthaltendieZucker-Phosphat-Teile,wahrenddieStufen durch dieBasenb eschrie-

b en werden. Allerdingssind nurganz sp ezielleBasenpaarungen, namlichA-T bzw.

G-C, moglich.

Abb.1.1: DieBasen derDNAund ihre Paarung (Quelle:Kni95)

FolglichsinddiezweiBasenstrangekomplementarzueinander. Aufgrunddessenkann

von der Nukleotid-Sequenzdes einen Strangs die des anderen abgeleitetwerden.

Beim Menschen ist die gesamte Erbgut auf 23 Chromosomenpaaren gesp eichert.

Man unterscheidet dab ei zwischen den 44 Autosomen und den zwei Gonosomen,

den Geschlechtschromosomen. DerUnterschiedzwischenMann undFrau b estehtin

genaueinemChromsom: dieFrauhat zweiX-Chromsomen,wahrendder mannliche

Karyotyp ein X- und ein Y-Chromosom aufweist. Menschliche Chromsomen ent-

halten im Mittel 310 9

Basenpaare. Das entspricht einemDNA-Strang mit einer

Lange von 5-10 cm.

c sog.Kalottenmo dell-Darstellung(blau: H,gelb: O, grau: CinderPhospho diesterkette,

hellgrau: Cbzw.N in den Basen,rot: P).(Quelle:Kni95)

1.2 Gene

Gene sind Abschnitte auf den DNA-Strangen. Die biologische Funktion des Gens

ist dab ei inder Sequenzseiner Basenpaare ko diert. Diese Informationumfasst eine

ReihevonAnweisungenzurSyntheseeinesRNA-Molekuls,dasanschliessendentwe-

der dieSynthesevon Proteinmolekulen (z.B. Enzyme)veranlasst o der selbst in der

Zelle eineFunktion



ub ernimmt. Dieser Vorgang wird alsGenexpression b ezeichnet

(s. Abs. 1.3) [Bro93 ]. Die Entschlusselung des menschlichenGenoms brachte

 ub er-

raschend zuTage, dass der Mensch

"

nur\ zwischen 25000 und 40000 Gene b esitzt.

Man war bisher von einer weit hoheren Zahl ausgegangen. Der Vergleich mit der

Zahlvonbiszu130000Proteinen,lasstdenSchlusszu,dasseinGenfurdieSynthese

mehrerer Proteinezustandig seinkann,entgegender bisherigen Vorstellung.

Die Verteilung der Gene innerhalb der DNA ist dab ei alles andere als homogen.

Da gibt es ausgedehnte Wusten, in denen sich gar keine Gene b enden (intergene

DNA), wahrend sie in anderen sogenannten Hotsp ots dicht an dicht liegen (siehe

Abb. 1.3). In hoheren Organismenkonnendiese intergenenRegionenso gross sein,

dass der Anteil der Gene an der gesamten zellularen DNA nur einige Prozent b e-

tragt.

Abb. 1.3c)veranschaulicht,dassdieentsprechendeNukleotidsequenzinlediglichei-

nemderb eidenStrangederDopp elhelixenthaltenist. EntsprechendseinerFunktion

b ei Replikationsprozessen nennt man diesen Matrizenstrang. Im Durchschnitt b e-

Abschnitte der DNA, in

c) geb en die Pfeile die

Richtungen an, in der

die biologische Informa-

tion wahrend der Gen-

expression gelesen wird.

(Quelle:Bro93)

stehteinGenauseinigenhundert(n)Basenpaaren,wasinsgesamtca.4 n

Moglichkei-

ten ergibt,von denender grosste TeiltatsachlichbiologischeInformationenenthalt.

Die DNA imZellkerndes Menschen etwaist circa3000 Mbp lang [Kni95].

2

Die funktionellenEinheitender DNAsind Basentripletts. Dieseko dierendie20 un-

terschiedlichenAminosauren, welche die Bausteine der Proteine darstellen[Lin89].

Genb ereicheaufder DNAsind durchwohldenierteStart-und Stopsequenzenmar-

kiert. Das Start-Codon b esteht fur alleGene aus den dreiBasen (A T G). Ein der

Startsequenz vorgelagerter Promotor b esteht aus einer b estimmten Basensequenz,

an die Ableseenzyme in stabiler Weise binden. Zwischen Start- und Stop-Co don

liegen die dieAminosaurenko dierendenTripletts. Interessant ist, das mehrereTri-

pletts in ein und dieselb e Aminosaure ko dieren, da es 4 3

= 64 mogliche Dreier-

Kombinationender 4 unterschiedlichenBasengibt. Dreider 64 mglichenKombina-

tionen sorgen fur das Ende der Protein-Transkription. Sie lauten UAA, UAG und

UGA.

1.3 Genexpression

Die Genexpression ist der Vorgang, der die in den Genen enthaltene Information

der Zelle zuganglich macht. Dab ei wird die DNA des Gens zuerst in RNA und

anschliessend in ein Protein



ub ersetzt. Dies wird auch als das zentrale Dogma der

Molekulargenetikb ezeichnet[Cri70].

Die erste Stufe der Genexpression, die Transkription, wird von allen Genen durch-

laufen. Wahrend dieses Prozesseswird ein RNA-Molekulsynthetisiert 3

, wob ei eine

2

Megabasenpaare

3

Ineiner ZellesindimmerBausteine b eidergenetischerSaurenvorhanden.

Stufen der Genexpression

(Quelle:Bro93)

komplementare Abschrift des Matrizenstrangs des jeweiligen Gens erfolgt.

Die zweite Stufe ist die Translation. Diese wird allerdings nur von solchen Ge-

nen durchlaufen, fur diedas Endpro dukt der Expression nicht das RNA-Transkript

selbst darstellt. Das RNA-Molekul, nun als mRNA b ezeichnet, veranlasst b ei der

Translation die Synthese eines Makromolekuls, dessen Aminosauresequenz durch

die Nukleotidsequenzder mRNAb estimmtist. Die Endpro dukte der Genexpressi-

on sind dieProteine,man sprichtvon Bioproteinsynthese.

Die Aktivitat der Gene, die durch komplexe Prozesse reguliert wird, ist demnach

auf die Expression zuruckzufuhren. Quantitative Veranderungen der Genexpressi-

on wirken sich auf das Mengenverhaltnis der resultierenden Proteine aus, was die

Entstehungeines Tumorszur Folge hab en kann.

1.4 Replikation von DNA-Molekulen

Der grundlegendeProzess b ei der Entwicklung von Organismen ist dieZellteilung;

b ei jederTeilungmusseinevollstandigeKopiealler Genehergestelltwerden. Dab ei

ist ein hohes Mass an Genauigkeit notwendig, da schon sehr geringe Fehlerquoten

(z.B. 1 Fehler pro 10000 Nukleotiden) eine b etrachtliche Anhaufung an Verande-

rungen innerhalb der Gene verursachen konnen. Dadurch b estehtdie Gefahr, dass

leb enswichtigeInformationenverlorengehen.

Aufgrund der sp eziellen Basenpaarungen dient ein DNA-Strang dem anderen als

Matrize, die Dopp elhelix kann sich folglich aus demin der Zelle vorhandenen bio-

chemischenMaterial selbst replizieren.

1.5 Der Zellzyklus

Der Zellzyklus lasst sich in vier Phasen G1, S, G2 und M unterteilen. Die ersten

drei werden zur Interphase zusammengefasst. Die M-Phase heisst auch Mitose,

die Phase der Zellteilung. Sie ist b esteht aus Prophase, Metaphase, Anaphase und

Telophase. Die Gesamtheit dieser Phase b eschreibt den zyklischen Vorgang der

Replikation der DNA und Vererbung der genetischen Information auf die To chter-

zellen.

In der Interphase liegen die Chromosomen im Zellkern in der weniger stark kon-

densierten Form vor. Die eigentliche DNA-Synthese ndet in der S-Phase statt.

G1 und G2 sind



Ub ergangsphasen zwischen der Synthesephase und der Mitose. In

der G1-Phase steigtdie biologischeAktivitatder ZellemiteinemAnstieg der RNA

Pro duktion. Nachder DNA-SyntheseinderS-Phase wird dieZelleinder G2 Phase

durchBildung vonTeilungsproteinenaufdieMitose vorb ereitet. Inder mitotischen

Prophase werden Kernmembran und Nucleolen aufgelost und der Spindelapparat

um die Zellp ole ausgebildet. Anschliessend bilden sich zwischen den Polen Spin-

delfasern, die mit einer Anordnung der Chromosomen durch den Spindelapparat

einhergeht. Die Metaphaseplatte entsteht (Metaphase). Als Anaphase b ezeichnet

man den folgenden Vorgang der Trennung der Schwesterchromosomen hin zu den

Zellp olen. In der Telophase ndet der eigentlicheTeilungsprozess statt: Kernmem-

bran und Nucleolen werden neu gebildet, die Chromosomen dekondensieren, die

Zellplatte wird gebildet, dieZelle teiltsich. Der Zellzyklusist durchlaufen und die

DNA-Synteseinder Interphase kann neu b eginnen.

DurchAufschraubungs- und Faltungsmechanismenkondensieren dieChromosomen

in der Mitoseund erreicheneinemittlereLange von 5-10 m[Czi81]. Siesindnach

Farbung im Mikroskop alsChromosomenin ihrer b ekannten Form sichtbar. Durch

den Ansatzpunktder Spindelfasern, demCentromer wird das Chromosom ineinen

kurzen p- und eine langenq-Armunterteilt.

1.6 Genetische Ver



anderungen

Der Entstehung karzinogener Zellen gehen verschiedene genetische Veranderungen

der DNA voraus, die man in zwei Klassen unterscheidet. Mutationen sind Punkt-

veranderungen, d.h.AustauscheinereinzigenBaseo derVeranderungen,diesichauf

einen sehr b egrenztenBereichder DNAb eschranken. Sie entstehenhaug wahrend

des Replikationsprozesses o der durch chemische und physikalische Mutagene. Um

die Zahl dieser oft auf naturliche Weise entstehenden Mutationen gering zu hal-

ten, existieren Reparatur-Mechanismen. Darunter sind Enzyme zu verstehen, die

b eim

"

Abfahren\derEinzelstrangedieDNAerneuern,ab er auchgegeb enenfallsden

"

programmierten Zellto d\ (Apoptose) einleitenkonnen. ImGegensatz zuMutatio-

nen b ezeichnetmanmitRekombinationen dieUmordnungenvonDNA-Abschnitten.

Diese sind zumTeil erwunscht,da auf diese Weise genetische Vielfaltentsteht und

erhalten wird.

SolchegenetischeVeranderungenkonnendieRegulationsmechanismenderartin ih-

rer Funktion storen, dass sichein ungebremstes Wachstum entwickeltund letztlich

Deletion (Verluste) und Amplikation (Vervielfaltigungen) gewisser Gensequenzen

typischeMerkmale.

1.7 In Situ Hybridisierung

Ende dersechzigerJahrewurdevonGallund PardueeineTechnikentwickelt,diees

ermoglicht,einzelneRegionenderDNAzumarkieren. DazuwirddieDNAzunachst

denaturiert, d.h. die Wasserstobruckenbindungen der Basenpaare werden aufge-

bro chenunddieDNAausihrerdopp elhelikalenStrukturindieb eidenEinzelstrange

getrennt. AuftrennenderDNAinihreEinzelstrange(Denaturierung) geschiehtz.B.

durchWarme[Str96]. Danachwird dieDNAkomplementarenDNA-Prob enwieder

renaturiert. DenVorgang der BindungeinermarkiertenDNA-Einzelstrangprob ean

denaturiertechromosomaleDNAb ezeichnetmanalsHybridisierung. EineBindung

ndet



ub erall dort statt, wo sich komplementareBasensequenzenb enden.

Im Falle der chromosomalen in-situ-Hybridisierung b endet sich die denaturierte

DNAi.A.aufeinemObjekttrager,wahrenddermarkierteStrangvoneinerzugesetz-

ten Sonde stammt. Zunachst wurden zur Markierung radioaktive Stoe verwendet,

bspw.

3

H und der Nachweis der hybridisiertenund markierten DNA erfolgte ub er

Autoradiographie. Allerdings ist dieses Signal nicht immer deutlich sichtbar und



ub erdeckt zudem einen relativgrossen Teil des Chromosoms. Bei der Fluoreszenz-

in-situ-HybridisierungsindhingegendieNukleotidemituoreszierendenSeitengrup-

p enmarkiert. DieFluoreszenzsignale,diemittelseinemFluoreszensmikroskopnach-

gewiesen werden, sind aufgrund ihrer Strahlungseigenschaften b esser geeignet; die

dadurcherreichtehohereAuosungistgegenub erdemerstgenanntenVerfahrenvon

grossem Vorteil.



Ub erdieslassen sich mit unterschiedlichmarkierten DNA-Sonden

(klonierte DNA-Fragmente)verschiedeneGenortein einemExp erimentanfarb en.

Diese Metho de machteineortsspezische Bindung einer DNA-Prob e allerdings nur

dann moglich, wenn die zum markierten DNA-Stuck komplementare Nukleotidse-

quenz nur an einem Ort eines individuellen Chromosoms vorkommt. Es handelt

sichin dieseFall umeineEinzelkopie-Seque nz. Sollte dieDNA-Prob e jedo ch neb en

ortssp ezischen Sequenzen auch ho ch- o der mittelrep etitive Sequenzen enthalten,

die auf allen Chromosomen vorkommen,hybridisiert die DNA-Prob e an alleChro-

mosomen, so dass das ortsp ezische Signal nicht langer erkennbar sein wird. Man

istaus diesemGrundindenletztenJahrenzur CISS-Hybridisierung (Chromosomal

In Situ Suppression)



ub ergegangen [Cre88]. Zu einem geeigneten Zeitpunkt wer-

den in die Hybridisierungslosung nicht markierte ho chrep etitive DNA-Sequenzen

hinzugegeb en, die an die rep etitiven Sequenzen der Chromosomen binden. Eine

unsp ezische Bindung der markierten Prob en wird damit unterdruckt. Die Tech-

nik ermoglichtnicht nur die sp ezische Markierung von Metaphase-Chromosomen,

DNA,diealleSequenzeneinesb estimmtenChromosomsenthalt(Library-DNA).Sol-

che chromosomensp ezischen DNA-Bibliothekenkonnten entwickeltwerden, nach-

dem es gelang, individuelle Chromosomen mit dem Verfahren der uoreszenzakti-

vierten Chromosomen-Sortierunganzureichern[Cre84].

1.8 Multiplex-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

DadieWahrscheinlichkeitzurDetektiongenomischerAnomalienmitderZahlgleich-

zeitig verwendeter DNA-Prob en steigt, wurden in den letzten Jahren verschiedene

Techniken entwickelt, um moglichst viele gleichzeitig hybridisierte Prob en zu un-

terscheiden. FISH ist dab ei die ideale Basis fur diese Metho den, da eine Vielzahl

sp ektral unterschiedlicherFarbstoe fur FISHzur Verfugung stehen.

Abb.1.5: Prinzip desM-FISH Verfahrens.(Quelle:[Eil98])

BeiM-FISHwerdenmehreresp ektralunterschiedlicheFarbstoezurMarkierung

der DNA verwendet. Dab ei wird die Zahl unterscheidbarer Prob en durch kombi-

natorische Farbung signikant erhoht. Die ersten kombinatorischen Ansatze gab

es schon Ende der achtziger, Anfang der neunziger Jahre [Ned89, Ned90, Rie92a,

Rie92b, Len93 , Pop93, Wie93]. Es wird nicht mehrnur eine einzige, sondere meh-

rere Fluoro chrome gleichzeitig an die DNA-Prob en hybridisiert, die dann an ihre

komplemetaren Sequenzen binden. Da es b ei n Farbstoen 2 n

1 moglicheKom-

bination gibt, reichen5 Farbstoe aus (2 5

1=31), umdas gesamte Genom, also

alle 24 Chromosomen unterschiedlichzu farb en und damit sp ektral unterscheidbar

furein5-Farb en Exp eriment.

Abb. 1.6: Typisches Hybridisierungsschema eines 5-Farb en m-FISH Exp eriments. Jedes

ChromosomerhalteineeindeutigeKombinationvonFarbstoenunddamiteineeindeutige

sp ektrale Signatur. Die Darstellung der Chromosomen erfolgt



ub er Falschfarb en, die in

der ob erenLeistezu sehen sind.

1.9 Comparative Genomic Hybridization (CGH)

CGH wurde zur Detektion ungewohnlicher Kopienzahlveranderungen von Sequen-

zender Nukleinsaureineinemo der mehrerenGenenentwickelt[Kal92]. Grundlage

dieser Metho de ist das FISH-Verfahren. Mit CGH kann die relative Kopienzahl-

veranderungenvon tumorsp ezischenGensequenzenalsFunktiondesOrtesder ent-

sprechendenSequenzen ineinemReferenzgenomausgedruckt werden[CGH95].

Als Prob e wird hier einerseits die gesamte DNA des Tumorgeweb es und anderer-

seits die normale Referenz-DNA verwendet, wob ei die Hybridisierung bzw. Ko-

HybridisierungaufaufgespreitetenMetaphase-Chromosomen 4

gesunderZellenstatt-

ndet. Die Tumor-DNA wird dab ei gewohnlicherweise mit grunem Fluoro chrom

gelab elt, wahrend dieReferenz-DNAmiteinemroten Fluoreszenzfarbstomarkiert

wird. Gleiche Anteile von Tumor- und Referenz-DNA

"

konkurrieren\ nun um die

gleicheZiel-DNA(imfolgendenmitTargetb ezeichnet).



AhnlichzuFISHwerdendie

FluoreszenzsignalefurjedeseinzelneTargetmiteinemFluoreszenzmikroskopgemes-

sen,imAnschlussb erechnetman dasVerhaltnisvongrunemSignal(Tumorgeweb e)

zu rotem (gesundes Geweb e). Rot-dominierte Verhaltnisse deuten auf Deletionen

und grun-dominierte auf Amplikationen in der Tumor-DNA hin [CGH95]. Abb.

1.7 zeigt eintypisches Beispiel.

DerVorteildieserMetho deb estehtdarin,dassineinemeinzigenExp erimentanhand

der Ungleichverteilungder Signale(Imbalanzen)entlangder Chromosomen-Achsen

genomweitVeranderungenin den Kopienzahleneinzelner Bereicheidentiziertwer-

den konnen. Zudem sind hier keine Vorinformationen ub er Veranderungen notig.

Durch CGH konnten insb esondere hamatologische Tumoren erfolgreich analysiert

werden(



Ub ersicht, [Lic00]).

4

Bezeichnung furdieorganisiertesteFormderChromosomenstruktur

Das Prin-

zip der

CGH.(Quelle:[Rud00])

DieseMetho dehatab er auchNachteile. SoistfureineeÆzienteAnalyseeinMinde-

stanteilvon ca. 35% an Tumorzellenin der Geweb eprob e notwendig [DuM95],was

sichzum Teiljedo ch alsproblematischerweisen kann. Auch sind diese Exp erimen-

te nur b edingt als Analysemetho den mit hohem Durchsatz geeignet, weil sowohl

die Herstellung als auch die anschliessende Auswertung manuell erfolgen mussen,

was einen hohenArb eits-und Zeitaufwand b edeutet. Desweiteren schranktdieGe-

stalt des Targets die Auosung ein. Kleinere Variationen, die durchaus fur eine

Klassizierung und Prognose von entscheidender Bedeutung sein konnen, bleib en

womoglichunentdeckt.

Physikalische Grundlagen

2.1 Mikroskopie

2.1.1 Linsen

Eine Linse ist im Prinzip eine fokussierende Blende. Licht, das durch einen Spalt

tritt, wird geb eugt. Es entsteht ein Beugungsbild mit Intensitatsmaxima und -

minima hoherer Ordnungen, deren Lage von der Wellenlange und der Geometrie

des Spalts abhangen. Durch die Form der Linse werden die optischen Weglangen

fur die Lichtstrahlen so verandert, dass dieMaxima hoherer Ordnung unterdruckt

werdenundnurfurdasHauptmaximumkonstruktiveInterferenzauftritt. DasBeu-

gungsbildeinesSpaltesistdab ei dieFouriertransformiertederSpaltfunktion,diedie

Formdes Spaltsb eschreibt. Dasleuchtetunmittelbarein,wennmansichdasInten-

sitatsprol in der Betrachtungseb ene als Summeder Schwingungszentren im Spalt

nach demHuygensschenPrinzip vorstellt. Die AmplitudenfunktionU(a;b),die das

Beugungsbild inder Bildeb eneb eschreibt,verdeutlichtdiesen Zusammenhang:

U(a;b)= Z Z

x;y

s(x;y)exp i(ax+by )

dxdy (2.1)

Die Ko ordinaten in der Blendeneb ene werden durch (x;y), die Blendenfunktion

durch s(x;y) b eschrieb en, die fur einen Spalt den Wert 1 hat; a und b sind die

raumlichen Frequenzen in der Bildeb ene. Sind (X ;Y) die Ortsko ordinaten in der

Bildeb eneind L dieBrennweitederLinse, sowiek dieWellenzahl,lassen sicha und

b schreib en als a =kX=L und b=kY=L. Die vollstandige theoretische Herleitung

dieser Formelergibt sich aus demKirchhoschen Integral Theorem.

Beim Durchgang duch das Objektiv werden aufgrund der b egrenzten raumlichen

AusdehnunghohereraumlicheFrequenzenamRandabgeschnitten. Diesfuhrtdazu,

dass das Bild eines Objekts nach Durchgang durch eine Linse einen Informations-

verlust erleidetund das Bildnichtvollstandigrepro duziert wird. Die geradefurdie

der Folge,dass das Beugungsbild an den Randernunscharfwird und verschmiert.

Die Formder b ewirkt, dass Licht,das von einemb estimmten Punktvor der Linse

ausgeht, ineinen denierten Punkt hinterder Linse geb eugt wird, und zwar genau

in den Punkt, furden die optischen Weglangen der von der Punktquelleausgehen-

den Lichtstrahlen gleich, was zu konstruktiver Interferenz fuhrt. Die normalisierte

laterale Intensitatsverteilung, die ein weit entfernter Punkt in der Fokaleb ene der

Linse erzeugtlautet:

I()=

2J

1 ()

2

(2.2)

J

1

() istdieBesselfunktionerster Ordnung, der normierteRadius mit

=kRsin; (2.3)

wob eiRderRadiusder Blende,derRaumwinkelundk =2=dieWellenzahlist.

Fur!0konvergiertderQuotient2J

1

()=gegen1/2,dergesamteTermalsogegen

1. Das Hauptmaximum heisst Airy Disk. Diese wird durch die ersten Nullstellen

der Besselfunktiondeniert,ihrRadius lasst sichmitsin=R=f schreib en als

r

Air y

=0:61

0

NA

: (2.4)

Linsen weisen Abbildungsfehler auf, die die theoretische Auosung in der Mikro-

skopie verschlechtern. Die Abbildungseigenschaften von Linsen verschlechternsich

dab ei im allgemeinen mit zunehmendem Abstand von der optischen Achse. Un-

terchromatischerAberrationverstehtmandieDisp ersion verursachteunterschiedli-

cheBrechung und damit Abbildung von LichtunterschiedlicherWellenlange. Licht

hoherer Frequenz wird starker gebro chen, damit liegt der Fokus solchen Lichts vor

langerwelligem. Der Unterschied in der Lage des Brennpunkts kann im sichtbaren

Sp ektrum bis zu einer Wellenlange b etragen. Spharische Aberrrationen sind Ab-

weichungenund Fehler in der Ob erache der Linse. Ein einfaches Beispiel ist der

Astigmatismus,derdurcheinenanisotrop enKrummungsradiusverursachtwird. Bei

mo derne Mikroskop en sind solcheAbbildungsfehlerweitgehendkorrigiert. Fureine

ausfuhrlicheBehandlung zudiesemThemamussandieser Stelleaufweiterfuhrende

Sp ezialliteratur der Optikverwiesenwerden.

2.1.2 Au



osungsverm

 ogen

ZuBeginnder MikroskopiewardasAuosungsvermogenvor allemdurchtechnische

Probleme b ei der Fertigung von Linsensystemen b estimmt. Vor allem chromati-

scheundspharischeAbb erationenwarendieHauptursachen furdieBegrenzungdes

Auosungsvermogens. Heutzutage sind diese Probleme grosstenteils b ehob en, so

ner Welleneigenschaftistesnichtmoglich,dasLichtdurcheineendlichgrosseLinse

in einem b eliebig kleinen Punkt zu bundeln. Die Verteilung der Lichintensitat im

Fokushat deshalb eineendlicheGrosse.

DeniertmandieAuosungsgrenzealsdenAbstandderBilderzweierPunktquellen,

b ei dem das Maximumdes einen im ersten Minimumdes anderen Beugungsbildes

ist, so ergibt sich mit=3:832,furdieerste Nullstelleder Besselfunktion

sin= 3:832

kR

=1:22

2R

=0:61

0

nR

(2.5)

Hier ist die Wellenlange n der Brechungsindex des Mediums, in dem sich das

Objektb endetundderhalb e



OnungswinkeldesObjektivs. DasPro duktnsin

wird als die Numerische Apertur (NA) des Objektivs b ezeichnet und lasst sich

auch schreib en als NA = nR=f. R und f sind resp ektive der Radius und die

Brennweite der Linse. Fur eine hohe Auosung sind also eine kleine Wellenlange

undeinehohenumerischeAp erturerforderlich. ManverwendetdaherImmersionsole

mit einemhohen Brechungsindex (n 1:5). Bei kurzen Wellenlangen (kleiner als

450 nm)



andertsichder BrechungsindexvonGlas stark,so dass dieObjektivezwar

auf ein mono chromatisches Beleuchtungslichtkorrigiertwerden konnen,jedo ch das

breitbandige Fluoreszenzlicht nicht ho chauosend zuruck abgebildet werden kann.

DiemaximaletheoretischeAp erturb etragt4,demspharischenRaumwinkel,deren

Realisierungan praktischeGrenzenstosst. SchritteindieRichtung,dieNumerische

Ap erturoptischerSystemezuerhohen,wurdenmitderEntwicklungder4und4

ThetaMikroskopie vollzogen,dieinsb esondere Auosungsverb esserungen inaxialer

Richtung erzielen[Hel94a, Hel94b]. Die theoretischeAuosung inaxialer Richtung

konnteexp erimentellveriziertwerden. Dievorausgesagte lateraleAuosungwurde

hingegen nichterreicht.

2.1.3 Axiale Auosung

EineahnlicheDenitionfurdieaxialeAuosungergibtsichmitdemerstenMinimum

des Intensitatsprols der PSF(PointSpreadFunction) inaxialer Richtung[BW80].

z

min

= 2n

0

NA 2

(2.6)

DiequadratischeAbhangigkeitderaxialenAuosungimNennerfuhrtzudrastischer

Diskriminierung in axialer Richtung b ei Erhohung der Numerischen Ap ertur, die

exp erimentell durch die 4-Mikroskopie b estatigt werden konnte. Das Verhaltnis

von axialerzu lateralerAuosung b etragt

z

min

r

Air y

= 3:28n

NA

(2.7)

DasersteConfocal-Stage-Scanning -O ptical-S ystem furtransmittiertesundreektier-

tes inkoharentes Licht wurde b ereits 1957 von M.Minsky zum Patent angemeldet

und in den folgenden Jahren weiterentwickelt. Die biologische Anwendung konnte

durch die Entwicklung der konfokalen Laser Scanning Fluoreszenz Mikroskopie er-

heblicherweitert werden ( [Cre78],[Cox82 ],[Res85]).

Beieiner konfokalen Anordnungistder Beleuchtungs-undDetektionslichtwegsym-

metrisch. Der prinzipielle Aufbau eines CLSM b esteht (Abb. 2.1) aus koharenter

Punktlichtquelle,Beleuchtungsobjektiv,Kollimatorlinse,Lo chblende und Detektor.

Der koharenteLichtstrahlder Laserquellewird mitHilfeeines dichroischenSpiegels

und des Mikroskop objektivs in die farbstomarkierte Prob e fokussiert; ggf. wird

hier ein erstes Pinhole zur raumlichen Filterung verwendet. Ein Teil des von der

angeregten Prob e ausgehenden Fluoreszenzlichteswird p er Objektivlinsedurch ein

Pinhole inden Detektorfokussiert.

Abb.2.1: SchematischerAufbaudes konfokalenLaser ScanningMikroskops

Als Folge der Anordnung wird eine erhohte laterale Auosung von bis zu 200 nm

und eine verb esserte Tiefenauosung von etwa 500 nm erzielt, die es ermoglicht,

dunne Schnittbildaufnahmenaus Prob en zu erhalten. Durch wiederholtes laterales

Scannen b ei verschiedenen Tiefen entlang der optischen Achse erhalt man so ein

dreidimensionalesDatenvolumen, das mit Hilfeder digitalen Bildverarb eitung aus-

gewertet werden kann.

ImVergleichzum konventionellenFluoreszenzmikroskop giltfurdie Intensitatsver-

I(z)=

2J

1 (z)

z

4

(2.8)

also im Prinzip das Quadrat von (3.4). Das liegt daran, dass sich die Punkt-

Abbildungs-Funktion von Punktlichtquelleund Punktdetektor im Fokus der Linse



ub erlagern. Das lateraleAuosungsvermogenistaufgrund der vergrossertenNume-

rischenAp erturmitderIntensitatsverteilunginobigerGleichunggegenub erkonven-

tionellen Aufnahmen um etwa 27% verb essert. Die verb esserte Auosung entlang

der optischen z-Achse ist imWesentlichen der Lo chblende zuverdanken,die direkt

vor demDetektorsystemp ositioniert wird. DurchsiewirdFluoreszenzlichtaus ob e-

ren und unteren angeregtenSchichten weitgehend diskriminiert.

DerEinsatzvonLasernalsLichtquelleinkonfokalenMikroskopieinnichtunb edingt

notwendig, hat sich ab er b ewahrt, da Laser intensives quasi-mono chromatisches

Lichtliefern,dassichgutfokussieren lasst. Damitwerden hohenPhotonenraten er-

zielt,um b eihohen raumlichenFrequenzennahe der Auosungsgrenze einenhohen

Kontrast, Signal-Rausch Verhaltnis und damit Bilder hoher Qualitat zu erhalten.

Ein Problemvon Laserlichtist seine hohe Koharenzlange,die zuInterferenzenaus-

serhalb des Fokus und in der Bildeb ene, sogenannten speckles, fuhrt, die die Bild-

qualitatb eeintrachtigen. EinPinholevordemDetektorschatAbhilfe,danurLicht

aus demFokussiervolumenin den Detektorgelangen kann.

Ein MFISH taugliches konfokales Laser Scanning Mikroskop steht no ch nicht zur

Verfugung. Mit herkommlichen CLSMs lassen sich 3-Farb en Exp erimente jedo ch

analysieren, wenn man sich auf sehr wenige Farbstoe b eschrankt. Das LEICA

TCS 4D Mikroskop b esitzt zumBeispieleinen Filterschieb erfur DAPI,FITC,Cy3

und Cy5. Diese Farbstoe lassen sichmit den vorhandenden Linien der HeNe und

Ar-Ionen Laser des Mikroskops anregen (488 und 568 nm).

Die AnalysedreidimensionalerInterphase Exp erimentemitmehrals dreiFarbstof-

fen (s. Abs. 6.6, Abb. 6.21) ist zur Zeit nur mit Epiuoreszenzmikroskopie mit

anschliessenderDekonvolutionfurjedeneinzelnenKanal moglich. Einsolches nicht

konfokales Mikroskop fur die Analyse von zweidimensionalen Aufnahmen wird in

Abschnitt2.4.1 b eschrieb en.

2.2 Laserinduzierte Fluoreszenz (LIF)

Durch Absorption eines Photons mit der Energie h kann ein Atom o der Molekul

in einen hoheren Energiezustand angeregt werden.

DieAnregungsenergie kann durch Emissioneines Photons h 0

wiederabgegeb en

werden. Als Fluoreszenz wird die spontane Emission von Strahlung b ezeichnet. Es

b esteht auch dieMoglichkeit,Molekule imoptischangeregten Niveau durch Stosse

schema fur Laser-

induzierte Fluores-

zenz.

in andere angeregte Niveaus zu bringen. In diesemFallsprichtman von Phospho-

reszenz. Bei der Fluoreszenz entsteht ein quantenmechanisch erlaubter



Ub ergang,

wahrendb eiderPhosphoreszenz einquantenmechanischverb otener



Ub ergang,mei-

stens von einemTriplett- zu einemSingulettzustand,entsteht. Dies



aussert sich in

der durchschnittlichenLeb enszeit des angeregten Zustands, dieb ei derFluoreszenz

im Bereichvon 10 8

s liegt. Typische Leb enszeiten von Phosphoreszenz liegen b ei

Millisekunden bisSekunden.

Wennjedo chdieStossaktivierungvernachlassigtwerden kann, wirdfurjedesabsor-

bierte Photon h

a

ein Fluoreszenzphoton h

Fl

(mit

Fl

a

) ausgesandt. Der

Bruchteil aller angeregten Molekule, die nicht strahlungslos deaktiviert werden,

sondern ein Fluoreszenzphoton aussenden, wird Quantenausbeute (" 1) genannt

[Dem96].

Benutzt man als Detektionsgerat einen Photomultiplier b enutzt, so erhalt man b ei

N

a

absorbiertenPhotonen innerhalb eines RaumwinkelsQ

N

e

=N

a

"(Q=4) (2.9)

Photo elektronen, diezu N

e

Signalpulsen fuhren.

e

: Sekundaremissionsko eÆzient

N

a

: Anzahl der absorbierten Elektronen

" : Quantenausb eute

ÆQ : Raumwinkel

Bei der LIF-Sp ektroskopie wird die Laserwellenlange

L

kontinuierlich durchge-

stimmt und die vom Detektor erfasste Fluoreszenzleistung P

Fl (

L

) als Funktion

von

L

gemessen. Das so erhaltene Sp ektrum nennt sich Anregungsspektrum. Die

grosste Empndlichkeitwirdfur =1, also stossfreie Bedingungen, erhalten.

Typisches Merkmal aller Farbstoe ist ein delokalisiertes -Elektronensystem, das

durch Kohlenstoringstrukturen entsteht. Die Elektronen dieses Systems konnen

leichtangeregt werden und inAbhangigkeit der Energieder emittiertenElektronen

entstehendann Farb en verschiedenerWellenlangen.

2.3 Grenzen der konfokalen Mikroskopie

In der (vor allem dreidimensionlalen) Mikroskopie gilt es, einen moglichst kleinen

Bereich eines Praparats mit einer moglichst hohen Photonendichte anzuregen, oh-

ne es dab ei zu b eschadigen, und nur aus diesem optisch angeregten Volumen eine

moglichsthohePhotonenzahl zudetektieren. DieAnzahldetektierterPhotonen pro

Pixel b etragt dab ei nur einen Bruchteil (< 1%) der erzeugten Anregungsprozesse

[Paw95]. Ein fundamentales Verstandnis dieser Prozesse ist fur einen eÆzienten

Umgang miteinemkonfokalen Mikroskop unerlasslich,um optimale Aulosung und

Bildqualitat zu erzielen. Wie sich zeigen wird, herrscht eine Art Unscharfeprinzip

b ei der Bildaufnahme,das den Anwender zwingt,einen b estmoglichenKompromiss

zwischen Auosung, Geschwindigkeit,Kontrast, Beschadigung der Prob e, Beleuch-

tungsintensitat, Quantenausb eute, sowie Sattigungs- und Bleicheekten der Farb-

stoe zunden.

2.3.1 Photonenstatistik

Um b ei einer Messung einehohe Genauigkeitzuerzielen, ist es notwendig, so viele

Photonen wie moglich zu detektieren. Photonen unterliegen der Poissonstatistik.

Die Poisson-Verteilung b eschreibt die Verteilung von unendlich vielen Messungen

seltener Ereignisse, deren Nichteintreten wesentlich wahrscheinlicher ist, als deren

Eintreten.

P(k)= n

k

k!

exp n

(2.10)

Die Wahrscheinlichkeit, dass eine gemessene Zahlrate b ei einer mittleren Zahlrate

von n Photonen zwischenn p

n und n+ p

n liegt,b etragt 63%, dieStandardab-

weichung wird allein durch den Mittelwert n b estimmt ( = n). Hat man b ei-

spielsweiseeinemittlerePhotonenzahl von100gemessen,liegen63%der Messungen

zwischen90und110. DieMessungindiesemBeispielweisteine10%ige( p

n=n)Sta-

tistik auf. Weitaus b essere Statistikenerhalt man mit hohen Photonenzahlen. Mit

n =90000 istdieStatistikauf0.3%verb essert. DieGenauigkeitderMessunghangt

von der Anzahl der gemessenenPhotonen ab. Die Photonenstatistik stellt also ei-

ne ProzessinterneRauschquelledar, diehohe Zahlraten fur zuverlassige Messungen

notwendig macht [Paw95]. Beihohen Photonenzahlen kann die Poissonverteilung

durch eineGaussverteilungangenahert werden.

2.3.2 Sattigungs- und Bleicheekte

BeinichtzustarkenBeleuchtungsintensitaten(<1mW),isteineMoglichkeit,hohere

Emissionsraten und damithohere Detektionsraten zuerhalten,dieBeleuchtungsin-

tensitat zu erhohen. Die Absorptionsrate hangt linear von der Intensitat ab, mit

der Folge, dass mehr Farbstomolekule pro Volumeneinheit angeregt werden, und

mit wachsender Besetzung angeregter Zustande steigt die Anzahl sp ontaner Pho-

tonenemissionen. DamitstimulierteEmissionsprozessedieAnregungseÆzienznicht

b eeintrachtigen,mussendieangeregten Elektronenschnelleralsdiesp ontane



Ub er-

gangwahrscheinlichkeit(10 8

s) intiefereZustande des Anregungsbandes relaxie-

ren (10 12

s), umvon dort sp ontan unter Emission eines Photons in den Grund-

zustand



ub erzugehen. Andernfalls standen moglicherweise nicht alle Atome zur

sp ontanen Emission und damit zur Detektionzur Verfugung.

BeiAnregungsintensitaten>1mW



andertsichdielineareAbhangigkeitderAbsorp-

tionsraten imFokusvolumen,da mitzunehmenderIntensitat immermehrMolekule

pro Volumeneinheitangeregt und schliesslicheinZustand erreichtwird, in dem im

Fokalvolumennichtmehrgenugend Farbstomolekulezur Anregung zur Verfugung

stehen. Da ab er die Anregungsrate von Farbstomolekulen ausserhalb des Fokus

und damit das Anregungsvolumen ansteigt, b edeutet dies eine zunehmende Ver-

schlechterung der Auosung. Wichtig ist, dass das Fluoreszenzsignal nicht mehr

nur von der Farbstokonzentration abhangt, ab er genau auf dieser Annahme baut

die Digitale Bildanalyseauf! Ein weiteres Problemergibt sich durch Bleicheekte.

Farbstomolekule verandern sich photo chemischund verlieren ihre Eigenschaft zu

uoreszieren. Wenn mit zunehmender Intensitat die Bleichrate ansteigt, wird dies

vor allem b ei Volumenaufnahmen zum Problem. Da b eim optical sectioning ein

Teil des Anregungslichtes fur jeden abgetasteten Punkt immer durch das gesamte

Praparat lauft,verschlechtertsichdiePhotonenausb euteund damitdieBildqualitat

mit zunehmenderabgetasteter Schicht.

Eineb ei Aufnahmen amMikroskopoft nichtb eachteteTatsacheist, dasses fur ein

optischesSystemmiteinerAuosung,die(unterderVoraussetzung,dassdasSystem

ab errationsfrei ist) durch die NumerischeAp ertur der Linsen, den Brechungsindex

des Mediumszwischen Objektiv und Praparat und die Anregungswellenlange de-

niert wird, nureine optimalePixel-/Voxelgrosse existiert. DiePixelgrosse istdurch

lateralenAbstand zweierb enachbarterAbtastungen gegeb en. Das Nyquist Abtast-

theoremb esagt nun,dass, umeine Struktur bestimmter Grosse auosen zukonnen,

diese Struktur 2.3 Mal abgetastet werden muss. FurdiePixelgrosse b eiAufnahmen

b edeutet das nun folgendes:

Bei gewahltem Objektiv, und damit denierter Auosung, muss das Praparat in

einem Abstand vom Auosung/2.3 abgetastet werden. Eine etwas kleinere Pixel-

grosse fuhrt in der Regel zu einer verb esserten Bildqualitat,da



Ub ergange weicher

werden, allerdings ohne Informationsgewinn. Starkes



Ub erabtasten kostet viel Zeit

und b egunstigt Sattigungs- und Bleicheekteim Praparat. Unterabtastung hinge-

gen b edeutet einenInformationsverlustund sollte vermiedenwerden. DurchUnter-

abtastung konnen Strukturenabgebildet werden, dienicht vorhanden sind. Diesen

Eekt nennt man Aliasing. Die grosste raumliche Frequenz der Aufnahme ergibt

sichaus 1/(2.3*Auosung).

2.4 Aufnahme von M-FISH-Bildern

Zwei Mikroskop-Systeme mit unterschiedlicher Detektionstechnik hab en sich am

Markt durchgesetzt. Das MFISH System von Leica Microsystems, und das SKY

System von Applied Sp ectral Imaging (ASI). Ersteres verwendet sp ezische Fil-

tersatze,umdieSp ektralinformationinjedemPixelzudetektieren. DieAnzahl der

gescannten Bildernentsprichtdab ei der Anzahl verwendeterFluoro chrome. Die im

RahmendieserArb eitanalysiertenZellenwarenausschliesslichvondiesemTyp. Das

SKYSystemb eruhtaufderFourier-Sp ektrokopie. FurjedesPixelwirddieAutokor-

relationsfunktion des Signals gemessen. Die Fouriertransformierte dieser Funktion

ergibt das gesamte Sp ektrum in jedem Pixel. Damit ist die sp ektrale Auosung

dieses Systemswesentlichhoher(bis zu5nm). BeideSystemehab en ihrevor und

Nachteile,dieimKapitel 6 (Diskussion) b espro chen werden.

2.4.1 Das MFISH System

DiesesSystem(z.B.LeicaDMRXA-RF8EpiuoreszenzMikroskop)verwendeteinen

Satzsp ezischerAnregungs-undEmissionsltersowiedichroischemStrahlteiler,die

zur automatischen Bildaufnahme auf einer motorisierten Drehscheib e aufgebracht

sind (bis zu8 Filter). Abbildung2.3 zeigtdas Prinzip der Aufnahmeschematisch.

Die Bildaufnahme einer kompletten Metaphase wird dadurch in wenigen Sekun-

den moglich. Diese Filter sind jeweils sp ezisch fur die im M-FISH Exp eriment

verwendeten Fluoro chrome, um optimale Anregungs- und Emissionsraten, b ei mi-

nimalemCrosstalk zu erzielen, da sich die Anregungs- und Emissionssp ektren der

Fluoro chromein der Regel



ub erlagern. DieseBandpasslter durfen jedo ch nichtzu

schmalbandig sein, da die Belichtungszeiten mit abnehmender Bandbreite zuneh-

men (2min)[Eil98]. FolgendeFluoro chromehab en sich zumEinsatz inM-FISH

Exp erimentenb ewahrt:

DAPI,einintensiverFarbsto, der zur Gegenfarbung der gesamten DNAver-

wendetwird, mitAbsorptions- und Emissionsmaximab ei 350 und 460nm

DEAC(426 und 480nm)

Fluorescein (FITC) (490und 520nm)

sowiedieCyanineCy3 (554 und 568nm)

Cy3.5 (581 und 588nm)

Cy5 (652 und 672nm)

Cy5.5 (682 und 703nm)

Die Bildaufnahmeerfolt



ub ereine Sensys CCD-Kamera von Photometrics (Ko-

dak KAF 1400 Chip). Standardmassig wird ein Objektiv mit 100x Vergrosserung

(Plan Ap o, NA1.4)verwendet. BeiausgedehntenMetaphasen sind 63x(Plan Ap o,

NA 1.32) Objective



ublich. Als Lichtquellen b esitzt das Mikroskop eine 75W Xe-

non Bogenlamp e und eine 100W Quecksilb erdampf-Lamp e. Tab elle (2.1) zeigt die

Sp ezikationender sp ezischenFiltersatze furausgewahlte Fluoro chrome.

Komp onente DAPI FITC Cy3 Cy3.5 Cy5 Cy5.5 Cy7

Anregungslter 36020 47515 5465.5 5805 60219 6826 74017.5

Strahlteiler 400 497 557 593 647 697 765

Emissionslter 46020 52220 5677.5 61215 66715 72020 79020

Tab.2.1: Epicub e Filterkonguration fur dasLeica DMRXA-RF8Mikroskop in nm

Die Belichtungszeiten fur die einzelnen Fluoro chrome hangen im wesentlichen von

derWahlderFiltersatzeundihrerBandbreite,derEmpndlichkeitderKamera,dem

Sp ektrum der Lichtquelle sowie dem Hybridisierungsprotokoll, also der Farb eÆzi-

enz der Prob e ab. Typische Belichtungszeiten fur die Fluoro chrome sind 0.5s fur

DAPI, 3s fur FITC, 3s fur Cy3, 0.5s fur Cy3.5, 4s fur Cy5 und 7s fur Cy7. Die

gesamteZeitfurdieAufnahmeeinerMetaphase b etragtsomit etwa20s. Mitdiesen

Belichtungszeitenwird etwadie Halfteder 12BitDynamikder CCD Kamera(4096

max. Intensitat) erreicht. Die Belichtungszeiten mit der Quecksilb erlamp esind in

der Regel kurzer als die mit der Xenon Bogenlamp e. Sie wird daher vorzugsweise

b ei Aufnahmen verwendet.

Pixelshifts konnen b ei diesemSystem durchden Wechsel der Filtersatze entstehen

und b etragen im Mittel 1-2 Pixel in x- und y-Richtung. Sie werden automatisch

durch geeigneteKorrektur-Algorithmenb eseitigt [Sp e96a ,Eil98 ].

2.4.2 Das SKY System

Das SKY System(Sp ectraCub e) b eruhtauf einemanderen Ansatz [Sch96, Gar96 ].

Statt sp ezischeFiltersatzezuverwenden,wirdmitHilfeder Fourier-Sp ektroskopie

das gesamte Sp ektrum in jedem Pixel gemessen. Dazu wird das Fluoreszenzlicht

mit Hilfeeines Kollimators ineinSagnac Interferometergefuhrt, und anschliessend

in eine CCD Camera fokussiert. Interferometer spielen eine zentrale Rolle in der

FourierSp ektroskopie. Das Prinzip wird imfolgenden erlautert.

Der einfallende Lichtstrahl wird imInterferometer in zwei koharente Strahlen auf-

geteilt, fur die eine variable optische Weglange generiert wird. Dadurch wird der

eine Strahl gegenub er der Referenzwelle in der Phase verschob en. Die koharenten

Strahlen werdenwieder vereint,dieIntensitat fur unterschiedlicheoptische Wegun-

terschiede detektiert und so das Autokorrelationssignal in jedem Pixel abgetastet.

Eine anschliessende Fouriertransformation liefert das gesuchte Sp ektrum in jedem

Pixel.

Eine(nichtmono chromatische)LichtwellemitderFeldstarkeE(t)lasstsichb eschrei-

b en durch:

E(t)= Z

k

A(k)cos(2kx !t)Æk (2.11)

Hieristk=1= dieWellenzahlund A(k)dieAmplitudederWellenkomp onentemit

der Wellenzahl k. Die mittlere Intensitat dieser Lichtwelle ist gegeb en durch das

Integral

I = Z

k A(k)

2

Æk (2.12)

DieIntensitatfurzweiinterferierendeStrahlen(derselb enLichtwelle)mitoptischem

Wegunterschied(phasenverschob ene Wellen) Lb etragt

I(L)=0:5 Z

k A(k)

2

Æk+0:5 Z

k

I(k)cos(2kL)Æk (2.13)

Der erste Summandistnichtsanderes alsdieKonstante

I. DerzweiteTermist der

Interferenzterm,derdieSp ektralinformationinFormdesoptischenWegunterschieds

L enthalt. Dieseristab er nichtsanderesalsder Realteil der Fouriertransformierten

von I(k). Die Gleichung fur diegemessene Intensitat b eim Wegunterschied L lasst

sichalso schreib enals:

I(L)=C+<(FT[I(k)]) (2.14)

Misstmandie IntensitatineinemPixelsukzessivefurunterschiedlicheL,erhalt

man ein Interferogramm(Autokorrelationsfunktion), das die Fouriertransformierte

des Sp ektrums ist. In der Praxis wird dieIntensitat fur unterschiedliche(diskrete)

Wegunterschiede gemessen, so dass das Sp ektrumin jedem Pixel dieFouriertrans-

formierteeiner diskreten FunktionI(L) ist:

I(k)= X

L

I(L)exp( i2kL)l (2.15)

Der diskreten Fouriertransformation vorgeschaltet werden eine Phasenkorrektur,

Ap o disierung und das Auullen mit Nullen. Diese Schritte sind notwendig, um

zenzu unterdrucken.

DasSagnacInterferometerbasiertaufdemPrinziprotierenderSpiegel,umeinenop-

tischen Wegunterschiedzu erzeugen. Das Prinzip rotierender (paralleler)Spiegel in

Interferometernwurde1981von[Yas81]eingefuhrt. FurkleineWinkel( <<1r ad)

ist der optischeWegunterschied demWinkelprop ortional:

L

=

c fu r <<1 r ad (2.16)

Diesp ektrale Auosungb etragt furdasSagnacInterferometeretwa0:01, also4nm

b ei 400nm. In der Praxis wird ab er mit einer wesentlich geringeren sp ektralen

Auosung gearb eitet, d.h die Intensitat I(L) wird seltener (b ei weniger optischen

Weglangen) gemessen,umdie Zeitfur dieBildaufnahmezu verkurzen.



Ublichsind

10-15nm b ei 400nm, man erhalt damit 5-10 mal soviel Farbinformation pro Pixel

wie b eim FilterbasiertenMFISH System. Die Aufnahmezeit fur ein Bild b ei einer

Auosung von 10nm b etragt ca. 60s und steigt linear mit der Auosung auf 120s

b ei 5nm an [Gar96 ].

Grundlagen der Bildverarbeitung

3.1 Klassizierung

Als Klassizierung b ezeichnet man die Zuweisung von Objekten anhand b estimm-

terMerkmalezub ekannten Klassen. Sieistnichtsp ezischfurdieBildanalyseund

ndet eine breite Anwendung auf verschiedenenGebieten. In der Bildanalyse las-

sen sich zwei Typ en von Klassizierungen unterscheiden: die Pixelorientierte und

Objektorientierte. In komplexen Fallen gelingt die Objektsegmentierungnicht mit

einem einzigen Merkmal. Dann mussen mehrere Eigenschaften verwendet werden,

sowieeinKlassizierungsprozess,der die Bildpunkteden Objektenzuweist[Jah97 ].

Falls sich die verschiedenenObjekte gut vom Hintergrund unterscheiden und sich

nicht b eruhren und ub erlapp en, ist die sehr viel einfachere objektbasierte Klassi-

kation die b essere Wahl. Der Daten- und Rechenaufwand ist sehr viel geringer,

da die auf Pixeln b eruhenden Merkmaleder Objekte



ub er das gesamte Objekt ge-

mitteltund alsObjekteigenschaftverwendetwerdenkonnen. ParameterwieGrosse

und Form,sowiedieOrientierungsind weitereEigenschaften, diealsMerkmaledie-

nen konnen. Manchmal ist auch die Kombination b eider Verfahren sinnvoll: Die

pixelbasierte zur Trennung der Objekte und anschliessend die objektbasierte zur

Klassizierung. Die Analysevon M-FISH Bildernlasst sichals Klassizierungspro-

blemverstehen. Interpretiertmandas Lab eling-Schmema(s. Abb.1.6)alsKlassen,

die die Chromosomen reprasentieren, b esteht die Hauptaufgab e darin, jedes Pixel

anhand seiner Farbinformation(Merkmale)einer dieserFarbklassen zuzuordnen.

3.2 Clusteranalyse

Dien unterschiedlichenMerkmaleeinesDatensatzes spanneneinenn-dimensionalen

Raum,denMerkmalsraumauf. JedesPixelo der ObjektwirdindiesemRaumdurch

einen Merkmalsvektor (o der auch Datum)reprasentiert. Wirdein Objekto der eine

dieser Klasse im Merkmalsraum eng b eeinander liegen. Besitzt eine Objektklasse

eine enge Verteilung im Merkmalsraum, spricht man von einem Cluster. Sind die

Cluster gut getrennt, lassen sich die Objekte gut in b estimmteKlassen separieren

(Abb.4.6). SinddieMerkmalehingegenschlecht,kann dieszufehlendeno der ub er-

lapp enden Clusternfuhren, was einefehlerfreieKlassizierungerschwert.

Verfahren zur Clusteranalyse teilen einen nicht klassizierten Datensatz in homo-

gene Cluster ein.



Ahnliche Daten werden also demselb en Cluster zugeordnet. Die

Daten werden dab ei den Clustern aufgrund von Zugehorigkeitsgraden zugeordnet.

Wahrend diese b ei deterministischenVerfahren binar sind, b eschreib ensie b ei pro-

balistischenund fuzzybasiertenMetho den dieWahrscheinlichkeitder Zugehorigkeit

eines Datums (o der Merkmalsvektors)zueinemCluster.

ZweiArtenvonClusterverfahrengiltesdab ei zuunterscheiden: die



uberwachteund

dieunuberwachteClusteranalyse. BeiersterenwirdaprioriWissenindasSystemein-

gearb eitet. Unub erwachte Verfahren hingegen clustern den Datenraum blind, und

kommenimmerdann zumEinsatz,wennkeinVorwissen



ub erdieDaten und das zu

erwartendeErgebnisvorhandenist. Isthingegen solches Wissenvorwegb ekannt, so

sollte dieses unb edingt b ei einer Clusteranalyse verwendet werden. Unub erwachte

Verfahrensindinder RegelsehrvielrechenaufwendigerundlieferninsolchenFallen

selten gleichwertigeErgebnisse.

Die Analyse der Daten mit Clusterverfahren basiert auf den Abstanden der Daten

zu den Clusterzentren, den sogenannten Centroiden. Die Cluster werden dab ei so

b estimmt,dassfuralleClusterdieSummederAbstandederPunktezumCentroiden

innerhalb eines Clusters minimal, und gleichzeitig der Abstand der Cluster unter-

einander maximal wird. Dab ei liegt die Annahme zugrunde, dass alle Daten das

gleicheGewichthab en und einemClusterzugeordnetwerden, und dass alleCluster

Daten enthalten.

Die Clusteranalyse eines Datensatzes X =fx

1

;:::;x

n

g ink Cluster lost also folgen-

des Optimierungsproblem:

C

=ar gmin

ci k

X

i=1 n

X

j=1 d

2

(c

i

;x

j

) (3.1)

Dab ei istC =fc

1

;:::;c

k

gdieMenge derCluster bzw.ihrer Centroide,und d(c

i

;x

j )

der Abstandzwischen Cluster c

i

und Datumx

j .

Dazu muss ein geeignetes Distanzmass eingefuhrt werden, das das Clusterergebnis

je nach Datenstruktur erheblich b eeinusst. Sehr haug wird die Euklidische Me-

trikverwendet,o der b eiobjektbasierten Klassizierungsproblemenaucheinbinares

Abstandsmass. Die Minimierung des Euklidischen Abstands b edeutet im

 ubrigen

nichtsanderes alsdieBerechnung des Mittelwertes(Schwerpunktes).

Das b ekannteste Clusterverfahren ist der k-means Algorithmus. Er unterteilt den

Datensatz in Cluster gleicher Form, die durch das Abstandsmass b estimmt wird.

Haug wird hier der Euklidische Abstand verwendet. Das fuhrt dazu, dass der

Datenraum in hyp erkugelformige Cluster unterteilt wird. Die Cluster werden nur

durch ihreCentroidec

i

b eschrieb en. Sieb erechnen sichaus:

c

i

= P

n

j=1 x

j

n

(3.2)

Der k-meansAlgorithmusweistgute Klassikationsresultate aus, wenn dieClu-

stereine



ahnlicheFormundGrosseb esitzen,undihreFormvorderAnalyseb ekannt

ist.

3.2.2 Fuzzy-Clusteranalyse

Fuzzy-Cluster-Algorithmenzeichnensichdadurchaus, dass dieDaten den Clustern

aufgrund von Zugehorigkeitsgraden zugeordnet werden, die nicht binar sind, son-

dern Werte von 0...1 annehmen konnen. Handelt es sich um probabilistische Clu-

sterverfahren, konnen sie als Wahrscheinlichkeiten der Zugehorigkeiteines Datums

zu einemCluster interpretiertwerden. Das Optimierungsproblemin Gl.(3.1) wird

zu:

C

=ar gmin

c

i k

X

i=1 n

X

j=1 w

m

ij d

2

(c

i

;x

j

) (3.3)

Dab ei mussen diefw

ij

gfolgende Neb enb edingungenerfullen:

n

X

j=1 w

ij

> 0 8 i; i=1:::k (3.4)

k

X

i=1 w

ij

=1 8 j; j =1:::n (3.5)

Die fw

ij

g sind die Menge der Zugehorigkeitsgrade der Daten zu den Clustern,

C =fc

1

;:::;c

k

g dieMenge der Clusterbzw. ihrer Centroide, und d(c

i

;x

j

) der Ab-

stand zwischenClusterc

i

undDatumx

j

. DerExp onentm isteinFuzzier,der den

Einuss von Daten auf ClustermitgeringemZugehorigkeitsgrad b estimmt.

EineumfassendeBehandlungzumThemaFuzzy-Clusteranalysendetsichin[Hpp99].

Einige b ekannte Vertreterdieser Clusterverfahrenstelleichimfolgenden vor.