UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF
Klinik und Poliklinik für Gefäßmedizin Direktor: Prof. Dr. med. E. Sebastian Debus
Sphingosin-1-phosphat -
Assoziationen zwischen Blutspiegel und Atherosklerose
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg
vorgelegt von Irina Soltau aus Hamburg
2 Angenommen von der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 19.09.2018
Veröffentlicht mit Genehmigung der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.
Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. Axel Larena-Avellaneda
3 Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht in:
Soltau I., Mudersbach E., Geissen M., Schwedhelm E., Winkler M. S., Geffken M., Peine S., Schoen G., Debus E. S., Larena-Avellaneda A. and Daum G. (2016). "Serum-Sphingosine-1-Phosphate Concentrations Are Inversely Associated with Atherosclerotic Diseases in Humans." PLoS One 11(12):e168302
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung... 9
1.1. Periphere arterielle Verschlusskrankheit ... 10
1.1.1. Definition ... 10 1.1.2. Epidemiologie ... 10 1.1.3. Pathogenese ... 10 1.1.4. Klinische Symptomatik ... 11 1.1.5. Diagnostik ... 12 1.1.6. Therapie ... 14 1.1.7. Nachsorge ... 18 1.2. Extrakranielle Carotisstenose... 19 1.2.1. Definition ... 19 1.2.2. Epidemiologie ... 19 1.2.3. Pathogenese ... 19 1.2.4. Klinische Symptomatik ... 20 1.2.5. Diagnostik ... 20 1.2.6. Therapie ... 23
1.3. Restenosen als relevante Komplikation einer invasiven Therapie ... 26
1.4. Sphingosin-1-phosphat ... 28
1.4.1. Synthese und Abbau von S1P ... 29
1.4.2. S1P-Rezeptoren ... 30
1.4.3. Bioverfügbarkeit von S1P ... 32
1.5. Fragestellung und Zielsetzung ... 34
2. Material und Methoden ... 35
2.1. Studiendesign ... 35
2.1.1. Ethikantrag ... 35
2.1.2. Studiengruppen ... 35
2.1.3. Studienverlauf ... 36
2.2. Bestimmung des Stenosegrades mittels Ultraschall ... 40
2.3. Bestimmung der S1P-Konzentration im Serum ... 41
5
3. Ergebnisse ... 43
3.1. Stabilität des Serum-S1P ... 43
3.2. Präoperative Serum-S1P-Konzentrationen in Gefäßpatienten und gesunden Blutspendern ... 44
3.2.1. Charakterisierung der Studienkollektive ... 44
3.2.2. Vergleich der Serum-S1P-Spiegel zwischen den Studienkollektiven ... 45
3.2.3. Serum-S1P-Konzentrationen in Abhängigkeit von Geschlecht und Alter 47 3.2.4. Untersuchung potentieller Einflussfaktoren auf den präoperativen Serum-S1P-Spiegel ... 49
3.2.4.1. Assoziationen zwischen den Serum-S1P-Konzentrationen und den Erkrankungsstadien ... 50
3.2.4.2. Assoziationen zwischen den Serum-S1P-Konzentrationen und den Risikofaktoren für Atherosklerose bzw. den Komorbiditäten ... 51
3.2.4.3. Assoziationen zwischen den Serum-S1P-Konzentrationen und der präoperativen Medikation ... 52
3.2.4.4. Assoziationen zwischen den präoperativen Serum-S1P-Konzentrationen und den präoperativen Laborparametern ... 52
3.3. Untersuchungen der Serum-S1P-Konzentrationen im Verlauf: postoperativ und im Zeitraum der Rekonvaleszenz ... 54
3.3.1. Untersuchung potentieller Einflussfaktoren auf den postoperativen Serum-S1P-Spiegel ... 55
3.3.2. Assoziationen zwischen den postoperativen Serum-S1P- Konzentrationen und den prä- bzw. postoperativen Laborwerten ... 57
3.4. Serum-S1P-Konzentrationen im Kontext der klinischen Endpunkte... 60
4. Diskussion... 62
4.1. Studienkollektive und S1P-Bestimmung ... 63
4.2. Niedrige Serum-S1P-Konzentrationen korrelieren mit Atherosklerose ... 64
4.3. Serum-S1P-Konzentrationen im Kontext des klinischen Verlaufs ... 69
4.4. Limitationen der Studie ... 72
5. Fazit und Ausblick ... 73
6. Zusammenfassung ... 74
7. Abkürzungsverzeichnis ... 76
6
9. Danksagung ... 91
10. Lebenslauf ... 92
11. Anhang ... 93
11.1. Patientenaufklärung und -einwilligung ... 93
11.2. Daten der Kontrollkohorte ... 96
11.3. Daten der Patientenkohorte (Carotisstenose-Patienten) ... 98
11.4. Daten der Patientenkohorte (pAVK-Patienten) ... 104
7
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Hochgradige Stenose der A. femoralis communis ... 14
Abbildung 2: Farbkodierte Dopplersonographie der Carotisgabel ... 21
Abbildung 3: Sonographie der A. carotis interna ... 21
Abbildung 4: Synthese- und Abbauwege von Sphingosin-1-phosphat ... 29
Abbildung 5: Studienverlauf ... 36
Abbildung 6: Serum-S1P-Konzentrationen in Abhängigkeit der Lagerungsart und -zeit... 43
Abbildung 7: Verteilungskurven der Serum-S1P-Werte in gesunden Kontrollen und Gefäßpatienten ... 45
Abbildung 8: Serum-S1P-Konzentrationen in Gefäßpatienten sind niedriger als in einer Kontrollkohorte aus Blutspendern ... 46
Abbildung 9: Serum-S1P-Konzentrationen sind unabhängig vom Geschlecht ... 47
Abbildung 10: Vergleich der Serum-S1P-Konzentrationen zwischen Kontroll- und Patientengruppen gleichen Alters ... 48
Abbildung 11: Korrelationen zwischen den Serum-S1P-Konzentrationen und dem Parameter „Alter“ innerhalb der Patienten- und Kontrollkohorte ... 49
Abbildung 12: Assoziationen der präoperativen Serum-S1P-Konzentrationen mit den Risikofaktoren und ausgewählten Komorbiditäten innerhalb der Patientenkohorte ... 51
Abbildung 13: Assoziationen der präoperativen Serum-S1P-Konzentrationen mit der präoperativen Medikation innerhalb der Patientenkohorte ... 52
Abbildung 14: Korrelationen zwischen den präoperativen Serum-S1P-Konzentrationen und den präoperativen Laborparametern ... 53
Abbildung 15: Serum-S1P-Konzentrationen des Patientenkollektivs im Verlauf ... 54
Abbildung 16: Assoziationen der postoperativen Serum-S1P-Konzentrationen mit den Risikofaktoren und ausgewählten Komorbiditäten innerhalb der Patientenkohorte ... 56
Abbildung 17: Assoziationen der postoperativen Serum-S1P-Konzentrationen mit den Operationsdaten ... 57
Abbildung 18: Korrelationen zwischen den postoperativen Serum-S1P-Konzentrationen und den präoperativen Laborparametern ... 58
Abbildung 19: Assoziationen der Serum-S1P-Konzentrationen mit den klinischen Endpunkten ... 61
8
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Einteilung der pAVK nach Fontaine und Rutherford anhand der
klinischen Symptomatik ... 12
Tabelle 2: Klinische Klassifikation der extrakraniellen Carotisstenose ... 20
Tabelle 3: Stenosegraduierung der A. carotis interna ... 22
Tabelle 4: Ein- und Ausschlusskriterien ... 36
Tabelle 5: Erhobene Variablen und ihre Definition ... 37
Tabelle 6: Erhobene Laborparameter ... 39
Tabelle 7: Abschätzung des Stenose-/Restenosegrades anhand der Flussgeschwindigkeiten. ... 40
Tabelle 8: Charakteristika der Studienkollektive. ... 44
Tabelle 9: Erkrankungsstadien und zugehörige Serum-S1P-Konzentrationen. ... 50
Tabelle 10: Korrelationen der postoperativen Serum-S1P-Konzentrationen mit den postoperativen Laborparametern ... 59
Einleitung
9
1. Einleitung
Durch atherosklerotische Gefäßveränderungen hervorgerufene Erkrankungen gewinnen in den immer älter werdenden Bevölkerungen der Industrienationen zunehmend an Bedeutung. Zu den wichtigsten Krankheitsbildern gehören u.a. die koronare Herzkrankheit (KHK), die periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) und die Carotisstenose. Kommt es bei diesen Krankheitsbildern zu einer relevanten, fortschreitenden Einengung bzw. dem Verschluss des Gefäßlumens, so ist eine dem Krankheitsstadium angepasste Therapie notwendig. Eines der Hauptprobleme in der Gefäßmedizin stellt die Restenose bzw. der Reverschluss der Gefäße nach erfolgter Rekonstruktion dar. Die Restenoseraten unterscheiden sich je nach verwendeten Materialen und je nach betroffenem Gefäßabschnitt. So liegen beispielsweise die Restenoseraten bei Verwendung eines Venenbypasses im femoro-poplitealen Bereich nach 5 Jahren bei ca. 25% und bei Verwendung eines Kunststoffbypasses bei ca. 50-60% (Norgren et al. 2007). Eine der Hauptursachen für das Auftreten der Restenosen ist die Intimahyperplasie (IH), bei der die Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen eine wesentliche Rolle spielen (Clowes et al. 1983, Weintraub 2007). Bisherige wissenschaftliche Untersuchungen deuten darauf hin, dass dem ubiquitär im menschlichen Körper vorkommenden Lipid Sphingosin-1-phosphat (S1P) wichtige regulierende Funktionen im Gefäßsystem zukommen. Hierzu gehören u.a. die Regulation der Gefäßpermeabilität und der Zellmigration im Rahmen der Intimahyperplasieausbildung (Lucke und Levkau 2010, Daum et al. 2009, Obinata und Hla 2012). Bisherige klinische Studien an KHK-Patienten kamen hinsichtlich der Korrelation zwischen der Schwere der Erkrankung und der Höhe der Serum-S1P-Spiegel im Vergleich zu gesunden Probanden zu gegensätzlichen Ergebnissen (Deutschman et al. 2003, Sattler et al. 2010).
Die Entwicklung eines Biomarkers mit prädiktiver Funktion hinsichtlich der Auftretenswahrscheinlichkeit einer klinisch relevanten Intimahyperplasie wäre von großer Bedeutung. So könnten beispielsweise die antikoagulative Therapie und das Nachsorgeschema individualisiert und gefährdete Patienten früher erkannt werden.
Einleitung
10
1.1. Periphere arterielle Verschlusskrankheit
1.1.1. Definition
Die periphere arterielle Verschlusskrankheit ist eine Erkrankung, bei der die arterielle Durchblutung einer oder mehrerer Extremitäten reduziert ist. Ursächlich hierfür ist eine Stenose oder Okklusion der arteriellen Strombahn. Diese entstehen meistens aufgrund einer atheromatösen Arteriosklerose, die Veränderungen der Gefäßwände hervorruft. Nur selten liegen entzündliche, genetische oder traumatische Ursachen zugrunde (Espinola-Klein und Trampisch 2015; Duvall und Vorchheimer 2004).
1.1.2. Epidemiologie
Die Angaben zur Prävalenz der pAVK divergieren sehr je nach Literaturgrundlage. Die Deutsche Gesellschaft für Angiologie nennt eine Prävalenz von ca. 3-10% (Diehm et al. 2004, Criqui et al. 1985). Jenseits eines Alters von 70 Jahren erhöht sich die Prävalenz auf 15-20% (Diehm et al. 2004, Criqui et al. 1985). Das Verhältnis von asymptomatischen zu symptomatischen Patienten liegt bei ca. 4:1 und ist altersunabhängig (Norgren et al. 2007).
1.1.3. Pathogenese
Wie bereits erwähnt, ist die Atherosklerose die häufigste Ursache einer arteriellen Verschlusskrankheit. Hierbei kommt es in der Gefäßwand im Rahmen eines sehr komplexen und z.T. auch noch nicht vollständig geklärten entzündlichen Prozesses, aufgrund einer Läsion im Endothel, zu einer Akkumulation von Lipiden, Zellen (wie z.B. Makrophagen und T-Zellen) und in Folge auch von fibrösem Material (Ross 1999). Im Laufe der Zeit entwickeln sich aus anfänglich kleinen Läsionen komplexe Plaques, die das Gefäßlumen u. U. deutlich einengen und zu einem Elastizitätsverlust des Gefäßes führen können (Ross 1999). Prädisponierend für Atherosklerose sind Gefäßbifurkationen und Gefäßabzweigungen als Ergebnis von turbulenterem Fluss und erhöhten laminaren Scherkräften (Frangos et al. 1999). DeBakey und Kollegen teilten 1984 die fünf häufigsten Lokalisationen der Atherosklerose ein: Die Koronararterien, die großen Äste des Aortenbogens, die Viszeralarterien, die terminale Aorta mit ihren großen Ästen und als fünfte Kategorie ein gleichzeitiges Auftreten einer Kombination aus zwei der ersten vier Kategorien (DeBakey et al. 1985). Diese
Einleitung
11 Einteilung zeigt, dass die Atherosklerose nicht nur die Ursache von Pathologien der peripheren Arterien ist, sondern gleichzeitig auch für Erkrankungen wie z.B. der KHK und Stenosen der A. carotis verantwortlich ist. Die Risikofaktoren für das Auftreten einer arteriellen Verschlusskrankheit ähneln denen, die sich begünstigend auf die Ausbildung von Atherosklerose auswirken (Übersicht in: Bartholomew und Olin 2006). Man unterscheidet zwischen beeinflussbaren und nicht beeinflussbaren Risikofaktoren. Zu den nicht beeinflussbaren Risikofaktoren gehören ein höheres Lebensalter und das männliche Geschlecht. Zu den beeinflussbaren Risikofaktoren zählen ein Nikotinkonsum, ein Diabetes mellitus, eine Hyperlipidämie und ein arterieller Hypertonus (Murabito et al. 1997, Wattanakit et al. 2005).
1.1.4. Klinische Symptomatik
Das klassische Symptom der pAVK stellt die Claudicatio Intermittens (CI) dar, welche erstmals von den französischen Medizinern Jean-Francois Bouley und Jean-Martin Charcot im 19. Jahrhundert beschrieben wurde (Lacombe 2005). Ursächlich hierfür ist eine unzureichende Blutversorgung der Muskulatur unter Belastung aufgrund atherosklerotischer Gefäßveränderungen, aber noch ausreichender Sauerstoffzufuhr der Muskulatur in Ruhe (Norgren et al. 2007). Nach einer bestimmten Gehstrecke müssen die Patienten aufgrund der Schmerzen für einen Moment stehen bleiben, ehe sie wieder weitergehen können. Daher wird diese Erkrankung im deutschen Sprachraum auch als „Schaufenster-Krankheit“ bezeichnet (Espinola-Klein und Trampisch 2015). Bei der Hälfte der Patienten stabilisiert sich dieser Zustand durch Ausbildung von Kollateralgefäßen und bei einem Viertel kommt es zu einer spontanen klinischen Besserung. Bei einem weiteren Viertel der Patienten mit CI kommt es jedoch zu einer fortschreitenden Verschlechterung der Extremitätendurchblutung, welche sich in Ruheschmerzen und Gangrän- bzw. Nekrosenbildung an den Extremitäten äußert. In diesem Zustand reicht die Blutversorgung der betroffenen Region in Ruhe nicht mehr aus. Die Patienten beschreiben häufig eine Linderung der Beschwerden bei Beintieflagerung (Espinola-Klein und Trampisch 2015, Norgren et al. 2007). Bei Patienten mit einer solchen chronischen kritischen Extremitätenischämie beträgt die Einjahresmortalität ca. 20% (Norgren et al. 2007).
Einleitung
12 In Deutschland wird die pAVK anhand ihrer Symptomatik nach den Fontaine-Stadien eingeteilt, international erfolgt die Einteilung jedoch anhand der Rutherford-Klassifikation (Tab. 1) (Espinola-Klein und Trampisch 2015).
Tabelle 1: Einteilung der pAVK nach Fontaine und Rutherford anhand der klinischen Symptomatik: (modifiziert nach Espinola-Klein und Trampisch 2015)
1.1.5. Diagnostik
Neben der Anamnese und klinischen Untersuchung stehen apparative Untersuchungsmethoden zur Einschätzung der pAVK zur Verfügung.
Dopplerverschlussdruckmessung und Knöchel-Arm-Index
Die Messung des Dopplerverschlussdrucks erfolgt mit der Dopplersonde über der Arteria tibialis anterior und über der Arteria tibialis posterior. Für die Einschätzung der pAVK wird der höhere der beiden Werte verwendet. Dieser Blutdruck wird in Relation zum systolischen Blutdruck am Oberarm gesetzt. Der Quotient aus dem höheren der beiden peripheren Werte und dem systolischen Druck wird Knöchel-Arm-Index oder auch „ankle-brachial-index“ (ABI) genannt. Der ABI wird immer für beide Beine bestimmt. Nach den Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Angiologie ist ein
ABI-Einteilung nach Fontaine Einteilung nach Rutherford
Stadium Klinik Grad Kategorie Klinik
I asymptomatisch 0 0 asymptomatisch
II
Claudicatio intermittens (CI) IIa: Gehstrecke >200m IIb: Gehstrecke <200m I 1 leichte CI I 2 mäßige CI I 3 schwere CI III ischämischer Ruheschmerz II 4 ischämischer Ruheschmerz IV Ulkus, Gangrän III 5 kleinflächige Nekrose III 6 großflächige Nekrose
Einleitung
13 Wert von <0,9 beweisend für das Vorliegen einer pAVK. Ein ABI-Wert von <0,5 weist auf das Vorliegen einer kritischen Ischämie hin (Tacke et al. 2015). Bei Patienten mit Diabetes mellitus kann der ABI nur eingeschränkt beurteilt werden, da in ca. 10-30% fälschlich zu hohe Werte gemessen werden. Dieses Phänomen hat seinen Ursprung in der verminderten Komprimierbarkeit der Gefäße aufgrund einer Mönckeberg-Mediasklerose (Tacke et al. 2015).
Gehstreckenmessung
Um Claudicatio-Beschwerden einer pAVK zu objektivieren, wird die maximale schmerzfreie Gehstrecke standardisiert mittels Laufbandergometrie (3,2km/h und 10-12% Neigung) ermittelt. Zuvor erfolgt die ABI-Messung in Ruhe. Verringert sich der ABI nach Belastung um 20% im Gegensatz zum Ausgangswert, ist dies beweisend für die Diagnosestellung einer pAVK. Während der Laufbanduntersuchung werden die schmerzfreie Gehstrecke, die maximale Gehstrecke und die Schmerzlokalisation dokumentiert (Tacke et al. 2015).
Farbkodierte Dopplersonographie (FKDS)
Zur detaillierten Diagnostik der Gefäße hat sich die farbkodierte Dopplersonographie in der Gefäßmedizin als bildgebende Methode der Wahl etabliert. Es handelt sich hierbei um eine nicht-invasive Untersuchungsmethode, die es erlaubt, Aussagen über die Morphologie eines Gefäßes zu treffen, die Intima-Media-Dicke zu bestimmen und atherosklerotische Veränderungen zu erkennen. Mit Hilfe des pw-Dopplers (gepulster Doppler) lassen sich die hämodynamischen Flusseigenschaften beschreiben und so z.B. Rückschlüsse auf Stenosen oder Verschlüsse im Gefäß ziehen (Abb. 1). Die FKDS eignet sich zur Therapieplanung und Verlaufskontrolle. Die Nachteile dieser Methode liegen in der hohen Untersucherabhängigkeit und der eingeschränkten Aussagekraft, z.B. bei stark ausgeprägter Mediasklerose und Verkalkungen (Tacke et al. 2015).
Einleitung
14 Angiographie
Die intraarterielle digitale Subtraktionsangiographie (DSA) ist der Goldstandard zur Gefäßdarstellung aufgrund ihrer hohen Genauigkeit. Ein besonderer Vorteil der intraarteriellen DSA gegenüber der computertomographischen Angiographie (CTA) oder der Magnetresonanzangiographie (MRA) besteht in der Möglichkeit von Diagnostik und Intervention innerhalb einer Behandlung. Die DSA ermöglicht es, die Gefäße ohne Überlagerung benachbarter Strukturen darzustellen. Die Nachteile dieser Methode ergeben sich aus der notwendigen Invasivität und den daher möglichen Komplikationen. Zudem ist eine Röntgen- und Kontrastmittelexposition notwendig. Als rein diagnostische Maßnahme ist die Gefäßdarstellung auch mittels CTA oder MRA möglich (Tacke et al. 2015).
1.1.6. Therapie
Allgemeine therapeutische Ziele bei der Behandlung der pAVK sind die Verbesserung der Lebensqualität sowie das Verhindern einer Progression der Erkrankung u.a. durch Senkung des kardiovaskulären Risikoprofils. Diese Ziele werden stadienabhängig durch konservative, medikamentöse, interventionelle oder auch durch offen-chirurgische Behandlungen angestrebt (Lawall et al. 2015a).
Abbildung 1: Hochgradige Stenose der A. femoralis communis: Morphologisch dargestellt ist eine Stenose im Sinne einer Einengung des Gefäßlumens (Pfeil) sowie eine relevante Flussbeschleunigung auf ca. 400cm/s (gestrichelter Pfeil).
Einleitung
15 Basistherapie der pAVK
Bei bestehendem Nikotinabusus ist die sofortige Nikotinkarenz indiziert, da Nikotinabusus als stärkster Risikofaktor für die Entstehung einer pAVK gilt (Hirsch et al. 1997). Einer Hyperlipidämie ist mit einem geeigneten Cholesterinsyntheseenzymhemmer (CSE-Hemmer) entgegenzuwirken, welcher gleichzeitig als Sekundärprävention vaskulären Ereignissen vorbeugt (Lawall et al. 2015b). Das Ziel liegt gemäß den Leitlinien der European Society for Cardiology (ESC) bei einem LDL-Spiegel von <100mg/dl, bzw. <70mg/dl bei Patienten mit sehr hohem Risiko (Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Atherosclerosis Society (EAS) et al. 2011). Eine optimale Einstellung des HbA1c bei Diabetikern ist von großer Bedeutung, da das Risiko von schädlichen Folgen der pAVK mit jeder Erhöhung des HbA1c um 1% um ca. 28% steigt (Adler et al. 2002). In Bezug auf den häufig vorliegenden arteriellen Hypertonus sollten bei pAVK-Patienten Blutdruckwerte von <140/90mmHg angestrebt werden (Lawall et al. 2015b). Sowohl asymptomatische als auch symptomatische Patienten sollten einen Thrombozytenaggregationshemmer erhalten. Ein weiterer Bestandteil der Basistherapie, insbesondere in den Stadien I und II nach Fontaine, ist das strukturierte Gehtraining, damit sich Kollateralkreisläufe im entsprechenden Gefäßabschnitt bilden können. Sollte das Gehtraining nur eingeschränkt möglich sein, die Lebensqualität aber aufgrund der CI deutlich eingeschränkt sein und ein Stadium IIb nach Fontaine vorliegen, können vasoaktive Substanzen wie Cilostazol oder Naftidrofuryl von Nutzen sein (Lawall et al. 2015b).
Invasive Therapie der pAVK
Reichen die Basistherapie und das strukturierte Gehtraining nicht aus, um die CI zu verbessern, oder liegt eine kritische Ischämie vor, so sind interventionelle und/oder offen-chirurgische Rekonstruktionsmöglichkeiten der arteriellen Strombahn notwendig. Generell wird empfohlen, bei Mehretagenläsionen zunächst die Einstromhindernisse zu beheben. Die bekannte Klassifikation von Gefäßläsionen der pAVK in den Trans-Atlantic-Inter-Society-Consensus (TASC) I und II ist inzwischen nicht mehr geeignet, um eine Zuordnung zu primär endovaskulärer oder chirurgischer Behandlung zu treffen. Die Deutsche Gesellschaft für Angiologie spricht daher ihre
Einleitung
16 Behandlungsempfehlungen je nach klinischem Stadium der pAVK und Lokalisation der Gefäßläsion aus (Huppert et al. 2015).
Endovaskuläre Therapieoptionen
Grundlage für alle endovaskulären Therapieverfahren ist der perkutane Zugang mit Seldingertechnik. Entwickelt wurde dieser Zugangsweg 1953 von dem Radiologen Sven-Ivar Seldinger: Zunächst wird die zu punktierende Region mittels Lokalanästhetikum betäubt. Anschließend erfolgt eine Gefäßpunktion mit einer Kanüle. Nach erfolgreicher Positionierung der Kanüle im Gefäß wird ein flexibler Führungsdraht über die Kanüle in das Gefäß vorgeschoben und die Kanüle anschließend unter Abdrücken der Punktionsstelle entfernt. Der Führungsdraht verbleibt zunächst im Gefäß. Über ihn kann im nächsten Schritt die für den jeweiligen Eingriff notwendige Schleuse in das Gefäß eingeführt und der Führungsdraht anschließend entfernt werden (Seldinger 1953).
Zu den endovaskulären Therapieoptionen gehört die Technik der perkutanen transluminalen Angioplastie (PTA) mit und ohne Stentimplantation. Die PTA wurde in den 60er Jahren von Dotter und Judkins entwickelt, die mit Hilfe von übereinander geschobenen Kathetern eine Dilatation des betroffenen Gefäßabschnitts erreichten (Dotter und Judkins 1964), bevor Grüntzig in den 70er Jahren die Ballon-Angioplastie entwickelte (Grüntzig und Hopff 1974). Zu jeder PTA gehört zunächst die angiographische Darstellung der Gefäßläsion. Im nächsten Schritt gilt es, den stenosierten Bereich intraluminal mit Hilfe eines Drahtes zu passieren, um dann einen geeigneten Ballonkatheter vorschieben und expandieren zu können. Hierbei ist auf die richtige Größenwahl in Abhängigkeit des Gefäßlumens zu achten, um die Läsionen (Einriss der Intima und Umverteilung des Plaquematerials) gering zu halten. Inzwischen gibt es medikamentenbeschichtete Ballons, Cutting Ballons und mit Stickstoffoxid gefüllte Ballons, die bei der Kryoplastie zum Einsatz kommen (Storck und Krankenberg 2012). Je nach Morphologie und Lokalisation der Stenose kann die PTA mit der Implantation eines Stents kombiniert werden. Hier wird unterschieden zwischen selbstexpandierend, ballonexpandierend und medikamentenbeschichtet (z.B. mit Zytostatika oder Heparin) oder aber auch bioresorbierbar. Selbst- bzw. ballonexpandierende Stents unterscheiden sich vor allem in ihrer Flexibilität und ihre Widerstandskraft gegenüber äußerer Kompression. So eignen sich selbstexpandierende Stents z.B. in gelenknahen Bereichen aufgrund der hohen
Einleitung
17 Flexibilität und des hohen Widerstands gegenüber äußerer Kompression. Bei stark verkalkten Plaques zeigen ballonexpandierende Stents ihren Vorteil in den höheren Radialkräften (Debus und Gross-Fengels 2012).
Offen-chirurgische Therapie
Je nach Art und Lokalisation der Gefäßläsion kommen chirurgische Verfahren zum Einsatz. Eine Möglichkeit ist die Thrombendarteriektomie (TEA), welche erstmals im Jahre 1946 von Joao Cid Dos Santos erfolgreich durchgeführt wurde. Nach Eröffnung des Gefäßlumens wird hierbei die Plaque aus dem Gefäß herausgeschält. Dies erfolgt mit Hilfe eines Dissektionsspatels, welcher die Plaque inklusive der Intima aus dem Gefäß entfernt. Dieses Verfahren kommt z.B. bei stenosierenden Prozessen der Femoralisgabel und an der Carotisbifurkation zum Einsatz. Um eine Gefäßdissektion aufgrund der iatrogen geschaffenen Stufe zwischen Media und Endothel zu verhindern, ist es teilweise notwendig, die distale Stufe mittels Adaptationsnaht zu fixieren (Dos Santos 1976, Debus und Gross-Fengels 2012). Nach einer lokalen TEA wird häufig eine Patchplastik angeschlossen, da eine Direktnaht u.U. zu einer Einengung des Gefäßlumens führen kann. Als Patchmaterial sind prinzipiell autologe Venenpatches oder alloplastische Materialien zur Verwendung geeignet. Häufig werden auch xenogene Patches aus bovinem Perikard verwendet. Handelt es sich um eine längerstreckige Läsion, welche u.U. auch noch chirurgisch schwer zugänglich ist (z.B. Iliakalgefäße), eignet sich das Verfahren der Ringdesobliteration (antegrad und retrograd möglich). Hierbei wird das betroffene Gefäß an einer gut zugänglichen Stelle freipräpariert, eröffnet und die Dissektionsschicht dargestellt. Mit Hilfe eines über die Plaque geschobenen Ring-Stripers kann nun durch Vorschieben eine langstreckige Desobliteration vorgenommen werden (Debus und Gross-Fengels 2012).
Kommen aufgrund der Morphologie und Lokalisation der Gefäßläsion weder eine interventionelle Versorgung noch ein lokaler chirurgischer Eingriff in Betracht, besteht die Indikation zur Bypassimplantation. Zur Wahl stehen autologe Materialien wie die körpereigene Vene oder aber alloplastische Materialien wie z.B. Polytetrafluorethylen (PTFE) oder Polyester. Generell wird für die distalen Beinarterien die Verwendung einer autologen Vene als Bypassmaterial empfohlen, da hiermit bessere 5-Jahres-Offenheitsraten erzielt werden können (Rümenapf 2015, Norgren et al. 2007).
Zusätzlich gibt es auch die Möglichkeit, interventionelle und offen-chirurgische Verfahren in sogenannten Hybrideingriffen zu kombinieren; beispielsweise bei
Einleitung
18 hochgradigen Stenosen oder Verschlüssen der A. femoralis und gleichzeitig vorliegenden Ein- und/oder Ausstromhindernissen der Iliacal- bzw. Femoralarterien (Huppert et al. 2015).
Ist die arterielle Verschlusskrankheit schon derart fortgeschritten, dass es zu einem irreversiblen Gewebsuntergang mit fehlenden peripheren Dopplersignalen gekommen und eine Revaskularisierung nicht mehr möglich ist, bleibt als Ultima Ratio nur die Amputation. Es werden Minor- und Majoramputationen unterschieden, wobei die Grenze hierbei die Knöchelregion bildet (Wozniak und Baumgartner 2012).
1.1.7. Nachsorge
Die Deutsche Gesellschaft für Angiologie empfiehlt ein strukturiertes Nachsorgeprogramm für Gefäßpatienten. Dieses sollte regelmäßige Kontrolluntersuchungen beinhalten, bei denen die klinischen Symptome erfragt, Risikofaktoren nach Möglichkeit reduziert und wenn notwendig, weitere Behandlungsoptionen evaluiert werden. Zudem sollte auch eine mögliche kardiovaskuläre Komorbidität untersucht werden. Neben der klinischen Untersuchung gehört auch eine nichtinvasive apparative Diagnostik der Gefäße (Dopplerverschlussdruckmessung und FKDS) zur Nachsorge (Dohmen et al. 2015).
Einleitung
19
1.2. Extrakranielle Carotisstenose
1.2.1. Definition
Bei der extrakraniellen Carotisstenose handelt es sich um eine Einengung der A. carotis communis und/oder der A. carotis interna, wodurch je nach Kollateralisations-möglichkeit eine intrakranielle Minderperfusion, oder aber ein intrakranieller thrombembolischer Gefäßverschluss resultieren kann. Von großer klinischer Relevanz ist die Unterscheidung zwischen symptomatischer und asymptomatischer Carotisstenose (Eckstein et al. 2012).
1.2.2. Epidemiologie
In der Altersgruppe unter 50 Jahren beträgt die Prävalenz der noch nicht hochgradigen asymptomatischen Carotisstenose (Stenosegrad 50-69%) 0,2% bei Männern und fast 0% bei Frauen, wohingegen die über 80-jährigen Männer in 7,5% und Frauen in 5,0% eine Stenose aufweisen (de Weerd et al. 2010). Symptomatische Carotisstenosen finden sich hingegen deutlich seltener: hier liegt die Rate bei über 80-jährigen Männern bei 3,1 % und bei über 80-jährigen Frauen bei 0,9% (de Weerd et al. 2010).
1.2.3. Pathogenese
In über 90% der Fälle liegt eine Atherosklerose als Ursache einer Carotisstenose vor (Eckstein 2004). Die Carotisbifurkation ist aufgrund der Strömungsverhältnisse eine Prädilektionsstelle. Die Pathogenese der Atherosklerose und ihre Risikofaktoren entsprechen weitestgehend denen der pAVK (s. 1.1.3.). Klinisch symptomatisch wird die Carotisstenose häufig durch eine arterio-arterielle Embolie mit resultierender cerebraler Ischämie (Eckstein 2004). Zu den selteneren Ursachen gehören Dissektionen, die fibromuskuläre Dysplasie, radiogene Carotisstenosen und Aneurysmen (Eckstein et al. 2012, Eckstein 2004).
Einleitung
20
1.2.4. Klinische Symptomatik
Symptomatische Stenosen der A. carotis manifestieren sich durch neurologische Ereignisse, wie sie z.B. bei der transitorisch ischämischen Attacke (TIA), der Amaurosis fugax oder dem cerebralen Insult auftreten (Ringleb et al. 2012). Anhand des klinischen Erscheinungsbildes kann man die Carotisstenose folgendermaßen einteilen (Tab. 2):
Tabelle 2: Klinische Klassifikation der extrakraniellen Carotisstenose: (modifiziert nach Eckstein 2004)
Stadium Symptomatik
I asymptomatisch
II IIa: Amaurosis fugax
IIb: TIA (< 24h und vollständig reversibel) III IIIa: crescendo TIA (>24h)
IIIb: progredienter Apoplex
IV ipsilateraler Apoplex innerhalb der letzten 6 Monate
Sind in den 6 Monaten vor Diagnosestellung einer relevanten Carotisstenose keine hierfür typischen Symptome aufgetreten, handelt es sich definitionsgemäß um eine asymptomatische Carotisstenose (Ringleb et al. 2012).
1.2.5. Diagnostik
Im Rahmen der Anamnese des Patienten gilt es, die vaskulären Risikofaktoren zu erfragen. Zusätzlich sollten neurologische Symptome wie Schwindel, Sehstörungen, Lähmungserscheinungen sowie bereits stattgehabte Schlaganfälle anamnestiziert werden (Eckstein et al. 2012). Ggf. ist die Anamnese des Patienten durch eine fachneurologische Untersuchung zu ergänzen. Ergibt sich der Verdacht einer Carotisstenose, so ist die farbkodierte Dopplersonographie als apparative Diagnostik Methode der ersten Wahl (Abb. 2 und 3) (Ringleb et al. 2012).
Einleitung
21 Gemäß den Kriterien der Deutschen Gesellschaft für Ultraschall in der Medizin (DEGUM) lässt sich der Stenosegrad anhand der Morphologie im Ultraschallbild sowie der gemessenen Flussgeschwindigkeiten einteilen (Arning et al. 2010) (Tab. 3). Die S3-Leitlinien der Carotisstenose empfehlen zur Vereinheitlichung die Verwendung der
Abbildung 2: Farbkodierte Dopplersonographie der Carotisgabel: Dargestellt ist eine Plaque, die sich im Abgangsbereich der A. carotis interna befindet und das Gefäßlumen einengt (Pfeil).
Abbildung 3: Sonographie der A. carotis interna: Dargestellt sind echoreiche Plaques im B-Bild-Modus, die in das Gefäßlumen der A. carotis interna ragen.
Einleitung
22 NASCET-Kriterien zur Graduierung des Stenosegrades (Ringleb et al. 2012). Diese haben ihren Ursprung in einer amerikanischen Studie, dem North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial (NASCET) (North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial Collaborators 1991).
Tabelle 3: Stenosegraduierung der A. carotis interna: (modifiziert nach Arning et al. 2010); Graduierung des Zutreffens des jeweiligen Kriteriums von „(+)“ – „+++“. ACC=A. carotis communis, ACI=A. carotis interna.
Stenosegrad nach
NASCET-Definition (%) 10 20-40 50 60 70 80 90 Verschluss B-Bild +++ + Farb-Doppler-Bild + +++ + + + + + +++ Systolische Spitzengeschwindigkeit im Stenosemaximum [cm/s] 200 250 300 350 -400 100 -500
Kollateralen und Vorstufen (+) ++ +++ +++
Diastolische Strömungsver-langsamung prästenotisch (ACC) (+) ++ +++ +++ Strömungsstörungen poststenotisch + + ++ +++ (+) Enddiastolische Strömungsgeschwindigkeit im Stenosemaximum [cm/s] <100 <100 <100 <100 Konfetti-Zeichen (+) ++ ++ Stenoseindex ACI/ACC ≥2 ≥2 ≥4 ≥4
Ergänzend zur FKDS gibt es die zusätzliche Möglichkeit einer kontrastmittelverstärkten Sonographie. Neben der Stenose lässt sich die Oberflächenstruktur der Plaques detaillierter beurteilen. Zusätzlich können auf diese Weise Neovaskularisationen detektiert werden, welche Auskunft über die Plaquestabilität geben können (Shalhoub et al. 2010, Staub et al. 2011).
Zu den ergänzenden diagnostischen Methoden, insbesondere vor geplanter Revaskularisation, gehören die MRA, die CTA sowie die DSA. Der kraniellen MRA
Einleitung
23 kommt eine zusätzliche Bedeutung sowohl beim Vorliegen neurologischer Symptome als auch zur präoperativen Diagnostik der asymptomatischen Carotisstenose zu (Ringleb et al. 2012). Vorteilhaft ist diese Methode vor allem bei erhöhtem Verkalkungsgrad, nachteilig bei bereits implantierten Fremdmaterialien aufgrund von Auslöschungsartefakten (Eckstein et al. 2012). Die DSA als Goldstandard der Gefäßdarstellung erlaubt es, genaue Aussagen über die Stenose und die nachfolgenden Gefäße zu geben. Als invasive Methode sind jedoch eventuelle Komplikationen zu berücksichtigen: z.B. neurologische Defizite und Komplikationen der Punktionsstelle (Eckstein et al. 2012).
1.2.6. Therapie
Basistherapie der Stenose der A. carotis
Gemäß der S3-Leitlinie der extrakraniellen Carotisstenose ist sowohl bei Patienten mit symptomatischer als auch mit asymptomatischer Carotisstenose die tägliche Einnahme von Acetylsalicylsäure als Thrombozytenaggregationshemmer indiziert (Ringleb und Eckstein 2012). 2005 konnte gezeigt werden, dass die perioperative Gabe von Statinen das Schlaganfallrisiko und die perioperative Letalität signifikant reduziert (McGirt et al. 2005). Zusätzlich zur medikamentösen Therapie sollte, wie bereits bei pAVK-Patienten erwähnt, eine Optimierung des individuellen vaskulären Risikoprofils (Lipidstoffwechsel, Diabetes mellitus, arterieller Hypertonus und Lebensstil-Modifikation) erfolgen (Ringleb et al. 2012).
Invasive Therapie der Stenose der A. carotis
Die Entscheidung zur invasiven Therapie einer Stenose der A. carotis ist in Abhängigkeit des Stenosegrades und des Vorhandenseins einer klinischen Symptomatik zu treffen. Generell werden symptomatische Stenosen ab einem Stenosegrad von 50% revaskularisiert (Ringleb et al. 2012). Grundlage für diese Indikation stellt die derzeitige Studienlage dar. In dem European Carotid Surgery Trial (ECST) wurden über 3000 Patienten, die eine Carotisstenose aufwiesen und innerhalb der vergangenen 6 Monate eine cerebrale Ischämie erlitten hatten, eingeschlossen und entweder rein medikamentös mit Thrombozytenaggregationshemmern oder kombiniert medikamentös und operativ mittels Carotisendarteriektomie (CEA)
Einleitung
24 behandelt. Es konnte gezeigt werden, dass ab einem Stenosegrad von ≥80% die CEA statistisch signifikant überlegen war: so betrug das Risiko für Schlaganfall und Tod 3 Jahre nach erfolgter Operation 14,9% gegenüber 26,5% bei rein medikamentöser Therapie (European Carotid Trialists Collaborative Group 1998).
Eine weitere Studie, die North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial (NASCET), die ebenfalls eine konservative medikamentöse Therapie mit einer kombinierten medikamentös-operativen Therapie verglich, kam zu ähnlichen Ergebnissen. Die CEA war bei Stenosen ≥70% der rein medikamentösen Therapie deutlich überlegen (Schlaganfallrisiko innerhalb von 2 Jahren: 9% gegenüber 26%), so dass die Studie aus ethischen Gründen abgebrochen wurde (North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial Collaborators 1991).
Auch wenn in den S3-Leitlinien eine Revaskularisierung ab einem Stenosegrad von ≥60% bei asymptomatischer Stenose empfohlen wird (Ringleb et al. 2012), deuten neuere Studienergebnisse darauf hin, dass das spontane neurologische Risiko unter optimaler medikamentöser Therapie geringer ist, als früher angenommen (Spence et al. 2010). Dementsprechend wird eine Indikation meist nur bei hochgradiger (≥80%) oder progredienter Stenose gestellt, sofern keine Symptome vorliegen. Andere Faktoren wie Plaquemorphologie oder stille, im MR/CT sichtbare Läsionen wurden in den großen Studien bisher nicht berücksichtigt.
Revaskularisierung der A. carotis
Zur Rekonstruktion der A. carotis interna stehen offene und endovaskuläre Verfahren zur Verfügung. Offen kann das Gefäß in Form einer lokalen Thrombendarteriektomie (Carotisendarteriektomie, CEA, meist mit Patch) oder Eversionsendarteriektomie (EEA) versorgt werden. Signifikante Unterschiede im Langzeitverlauf nach CEA oder EEA konnten bisher nicht gezeigt werden (Cao et al. 2001). In Ausnahmefällen kommen Bypassverfahren zum Einsatz.
Die CEA, erstmalig in den 50er Jahren durchgeführt, hat sich in den vergangenen Jahren als Standardverfahren durchgesetzt (Eastcott et al. 1954, DeBakey 1975). Die Durchführung der Thrombendarteriektomie entspricht im Wesentlichen der bereits in Kapitel 1.1.6. beschriebenen TEA.
Einleitung
25 Die Kombination einer CEA mit einer Patchplastik ist mit einer reduzierten perioperativen Schlaganfalls- und Letalitätsrate sowie einer reduzierten Restenoserate assoziiert (Rerkasem und Rothwell 2009).
Als interventionelles Verfahren bietet sich in entsprechend erfahrenen Zentren das Carotisstenting (CAS) gerade bei voroperierten Patienten mit einer Restenose nach CEA, bei Patienten mit sehr hohem Operationsrisiko und bei hochzervikalen Stenosen an (Ringleb et al. 2012). Die primäre Stentimplantation wies gegenüber der alleinigen Ballondilatation signifikant weniger Restenosen auf (McCabe et al. 2005). Als transluminaler Zugang wird in der Regel die A. femoralis nach Seldinger-Technik (s. 1.1.6.) gewählt. Für das Carotisstenting werden ausschließlich selbstexpandierende Stents verwendet (Eckstein et al. 2012). Zur Prophylaxe einer In-Stent-Restenose ist eine duale Thrombozytenaggregationshemmung mit Acetylsalicylsäure und Clopidogrel perioperativ sowie für mindestens vier Wochen postinterventionell empfohlen (Ringleb et al. 2012).
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1.3. Restenosen als relevante Komplikation einer invasiven Therapie
Das Auftreten von Restenosen nach invasiver Therapie einer pAVK oder Carotisstenose ist ein klinisch sehr relevantes Problem in der Gefäßmedizin. Die Restenoseraten unterscheiden sich zum einen nach Lokalisation und nach Art der durchgeführten Revaskularisation, zum anderen variieren die Restenoseraten auch von Studie zu Studie, was auf krankenhausspezifische Ursachen deuten könnte. Es wird zwischen primären und sekundären Offenheitsraten unterschieden, wobei bei den primären Offenheitsraten (im Gegensatz zu den sekundären Offenheitsraten) keine erneute Intervention oder Operation erfolgte.
Metaanalysen im aorto-iliakalen Bereich ergaben primäre Offenheitsraten zwischen 60-86% 4 bzw. 5 Jahre nach endovaskulärer Behandlung komplexer Läsionen (Jongkind et al. 2010). Neuere Daten zeigten hier 1-Jahres-Offenheitsraten nach primärem Stenting von ca. 93% unabhängig von der Läsionskomplexität (TASC A-D) (Bosiers et al. 2013). Eine weitere Studie ergab, dass die 5- und 10-Jahres-Offenheitsraten nach primärem Stening der Iliakalarterien mit Hilfe eines intravaskulären Ultraschalls bei ca. 89% bzw. 83% lagen (Kumakura et al. 2015). Bei aorto-iliakalen Gefäßläsionen, die mit einer Bypassimplantation behandelt wurden, lagen die 10-Jahres-Offenheitsraten von Y-Prothesen bei über 80% (de Vries und Hunink 1997). Nach einer erfolgreich durchgeführten TEA der A. femoralis konnten primäre Offenheitsraten von ca. 91% nach 5 Jahren verzeichnet werden (Kang et al. 2008). Endovaskuläre Behandlungen im femoro-poplitealen Bereich wiesen 3-Jahres-Offenheitsraten von ca. 76% nach Stentimplantation und ca. 42% nach alleiniger Ballon-Angioplastie auf (Laird et al. 2012). Nach 5 Jahren betrug die Offenheitsrate im femoro-poplitealen Bereich ca. 75% bei Verwendung eines Venenbypasses und schwankt je nach Literatur zwischen 39-52% bei Verwendung eines Polytetrafluorethylen-Bypasses (Norgren et al. 2007). Auch nach CEA und CAS sind Restenosen zu detektieren, welche nach zwei Jahren bei ca. 4,6% nach CEA und ca. 10,7% nach CAS lagen (Eckstein et al. 2008).
Verschiedene Ursachen führen zu einer Restenose bzw. einem Reverschluss. Neben thrombotischen Verschlüssen, degenerativen Veränderungen und Fortschreiten der Grunderkrankung ist insbesondere die Ausbildung einer Intimahyperplasie ursächlich, die durch das Trauma des operativen Eingriffs ausgelöst wird. Zu den wichtigen Funktionen eines unbeschädigten Endothels gehört u.a. die Freisetzung von
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27 antithrombotischen Faktoren (z.B. NO, Prostacyclin) (Pakala et al. 1997). Durch die im Rahmen eines Gefäßeingriffes resultierende Schädigung des Endothels sind diese Prozesse beeinträchtigt. Zusätzlich kommt es zu einer Freilegung subendothelialen Kollagens und u.U. auch zur Freisetzung thrombotischer Inhalte der Plaques, welche zu einer Gerinnungsaktivierung und Thrombozytenaggregation führen (Casscells et al. 1994, Weintraub 2007). Bei weiterem Fortschreiten kommt es zur Einwanderung medialer Muskelzellen, Bildung extrazellulärer Matrix und Entstehung einer intimalen Hyperplasie (Weintraub 2007). An der Intimahyperplasie sind u.a. aktivierte Thrombozyten beteiligt, die Botenstoffe wie Thromboxan A2 und platelet-derived growth factor (PDGF) freisetzen, die wiederum glatte Muskelzellen zur Migration und Proliferation stimulieren (Weintraub 2007). Die genauen molekularen Mechanismen, die zur Intimahyperplasie führen, sind jedoch weiterhin ungeklärt und bis heute gibt es keine spezifische pharmakologische Therapie zur Behandlung einer Intimahyperplasie nach einem Gefäßeingriff. Ebenso wenig steht ein Biomarker zur Identifizierung der entsprechenden Risikopatienten zur Verfügung.
Sphingosin-1-phosphat (S1P) ist ein bioaktives Lipid und besitzt sowohl pro- als auch antiatherogene Eigenschaften. Bisherige Studien an Tiermodellen konnten zeigen, dass über die unterschiedlichen S1P-Rezeptoren die Ausbildung einer Intimahyperplasie nach Endothelverletzung sowohl gefördert als auch unterdrückt werden kann (Shimizu et al. 2007, Wamhoff et al. 2008). Daraus lässt sich schließen, dass S1P über die Beeinflussung der Intimahyperplasieausbildung folglich auch an der Restenosenausbildung beteiligt sein kann. Im Folgenden wird dieses Lipid mit seinen Eigenschaften genauer betrachtet.
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1.4. Sphingosin-1-phosphat
Sphingosin-1-phosphat (S1P) ist ein bioaktives Lipid aus der Familie der Sphingolipide, welche ubiquitär im menschlichen Organismus zu finden sind. Sphingolipide entstammen dem Sphingomyelin, welches im Jahre 1884 von dem deutschen Mediziner Johann L.W. Thudichum als Bestandteil der grauen und weißen Hirnsubstanz entdeckt wurde. Dieses Molekül versah Thudichum mit dem Präfix „Sphingo“ in Anlehnung an die Sphinx aus der griechischen Mythologie (Thudichum 1884).
Bis zum Anfang der 90er Jahre ging man davon aus, dass S1P lediglich ein Abbauprodukt von Sphingomyelin darstellt und daher in biologischen Membranen gefunden wird. Das wissenschaftliche Interesse an S1P wuchs enorm, als entdeckt wurde, dass S1P wichtige Funktionen bei der Regulation des Zellwachstums einnimmt und als Ligand für bestimmte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren fungiert (Lee et al. 1998), wobei es u.a. die Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern reguliert
(Zhang et al. 1991, Olivera und Spiegel 1993). Im Laufe der folgenden Jahre wurden zahlreiche weitere Funktionen von S1P entdeckt, wie z.B. die Beteiligung an der Angiogenese (Liu et al. 2000), der Immunität (Allende et al. 2004), inflammatorischen Prozessen und der Regulation von Apoptose (Cuvillier et al. 1996).
Einleitung
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1.4.1. Synthese und Abbau von S1P
Eine Ausgangssubstanz für S1P ist das Sphingomyelin. Mit Hilfe der Sphingomyelinase wird das Sphingomyelin zu Ceramid umgewandelt, welches wiederum durch die Ceramidase zu Sphingosin umgebaut wird. S1P entsteht in einem weiteren Schritt durch Phosphorylierung von Sphingosin durch die Sphingosinkinase (SphK) (Abb. 4). Neben diesem Syntheseweg kann S1P auch nach einer Kondensationsreaktion aus Serin und Palmitoyl-CoA de novo generiert werden (Fyrst und Saba 2010).
Der Abbau von S1P erfolgt über zwei Wege: zum einen reversibel mittels Dephosphorylierung durch S1P-Phosphatasen zu Sphingosin und zum anderen irreversibel mittels Spaltung durch S1P-Lyasen zu Ethanolamin-1-phosphat und Palmitaldehyd (Chalfant und Spiegel 2005). Der letztere Abbauweg scheint von größerer biologischer Bedeutung zu sein (Yatomi et al. 2001).
Abbildung 4: Synthese- und Abbauwege von S1P: Dargestellt sind die Ausgangs- und Abbausubstanzen von S1P mit ihren jeweiligen chemischen Strukturformeln. S1P wird entweder de novo aus den Grundsubstanzen Palmitoyl-CoA und Serin in einer Kondensationsreaktion gebildet, oder aber aus der Grundsubstanz Sphingomyelin. Der Abbau kann reversibel durch S1P-Phosphatasen oder irreversibel durch eine S1P-Lyase erfolgen.
Einleitung
30
1.4.2. S1P-Rezeptoren
S1P vermittelt seine Funktionen über 5 verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (S1PR1-5), die wiederum verschiedene intrazelluläre Signalkaskaden aktivieren. S1PR1, S1PR2 und S1PR3 werden ubiquitär exprimiert und spielen auch im Gefäßsystem eine Rolle (Anliker und Chun 2004). Der S1PR4 kommt überwiegend in lymphatischen und hämatopoetischen Geweben sowie in der Lunge vor (Gräler et al. 1998). Der S1PR5 findet sich im Gehirn und in der Milz (Im et al. 2000).
S1PR1
Im Gefäßsystem spielt der S1PR1 eine wesentliche Rolle bei der Vaskulogenese und der Aufrechterhaltung der endothelialen Barrierefunktion (Lucke und Levkau 2010). Nicht nur der systemische Knockout des S1PR1 führt bei Mäusen zum intrauterinen Tod (Liu et al. 2000), auch ein spezifischer Knockout des S1PR1 in Endothelzellen ist letal (Allende et al. 2003). Grund hierfür ist die endothelzellspezifische S1PR1-abhängige Rekrutierung von glatten Gefäßmuskelzellen (Allende et al. 2003). Weiterhin ist der S1PR1 für den Austritt von Lymphozyten aus den primären und sekundären lymphatischen Organen essentiell (Matloubian et al. 2004). Die Erkenntnisse über die Wirkung des S1PR1 im Immunsystem macht man sich bereits in der Therapie der Multiplen Sklerose zunutze. Hier wird FTY720 (Fingolimod) eingesetzt, welches nach endogener Phosphorylierung den S1PR1 zunächst aktiviert, dann aber zur Internalisation und Degradation des Rezeptors führt und somit einen funktionellen S1PR1-Antagonisten darstellt (Kappos et al. 2006). Klinisch hat Fingolimod damit eine immunsuppressive Wirkung (Kappos et al. 2006).
Neben den immunsuppressiven Eigenschaften reduzierte die Gabe von Fingolimod als funktioneller S1PR1-Antagonist in einem Mausmodell für Atherosklerose die Ausbildung atherosklerotischer Läsionen (Keul et al. 2007, Nofer et al. 2007). Eine Erklärung für diese Beobachtung liegt darin, dass es durch Fingolimod zu einer Beeinträchtigung der Lymphozyten- und Makrophagenfunktion kommt. So führt Fingolimod zu einer Reduktion der Lymphozytenzahl und proinflammatorischer Zytokine und unterdrückt die Migration von Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen (Keul et al. 2007, Nofer et al. 2007). Einen direkten Hinweis auf eine Rolle des S1PR1 bei der Ausbildung einer Intimahyperplasie nach Endothelverletzung
Einleitung
31 lieferte ein Rattenmodell, in dem eine Denudation der A. carotis zu einer Induktion der S1PR1-Expression führte (Wamhoff et al. 2008).
S1PR2
Für die normale Gefäßentwicklung ist der S1PR2 nicht notwendig, wie Untersuchungen an S1PR2-Knockout-Mäusen zeigten. Bei diesen Mäusen fand sich jedoch ein Hörverlust, der durch einen Defekt in der Stria vascularis mit Haarzellverlust zu erklären war (Kono et al. 2007). In arteriellen Verletzungsmodellen führte der S1PR2 zu einer Inhibierung der Intimahyperplasieausbildung (Okamoto et al. 2000, Shimizu et al. 2007), was wahrscheinlich auf eine Unterdrückung der Migration bzw. Proliferation und eine Steigerung der Expression von Differenzierungsgenen in glatten Muskelzellen zurückzuführen ist (Grabski et al. 2009, Shimizu et al. 2007). Passend zu diesen Beobachtungen zeigte sich nach Denudation von Rattencarotiden mit folgender Intimahyperplasieausbildung eine verminderte Expression des S1PR2 (Wamhoff et al. 2008). Im Endothel verringert der S1PR2 die Barrierefunktion (Sanchez et al. 2007) und ist damit ein funktioneller Gegenspieler des S1PR1.
S1PR3
Zu den Funktionen des S1PR3 gehören u.a. die intrazelluläre Ca2+-Freisetzung, die
Induktion von Zellmigration und die Regulation der NO-abhängigen Vasodilatation (Ishii et al. 2002, Nofer et al. 2004). S1PR3-Knockout-Mäuse zeigten keinen besonderen Phänotyp, obwohl der S1PR3 vielfältige Signalwege aktivieren kann (Kono et al. 2004). Systemische Doppelknockouts von S1PR2 und S1PR3 führten jedoch zu Mäusen mit schweren vaskulären Abnormitäten und einer erhöhten embryonalen Letalität. Es ist daher davon auszugehen, dass diese Rezeptoren redundante bzw. kooperative Funktionen besitzen (Kono et al. 2004). Eine wichtige Funktion scheint der S1PR3 am Herzen zu besitzen. So zeigte sich in einem Mausmodell für myokardiale Ischämie, dass über einen S1PR3-abhängigen Mechanismus der NO-Freisetzung der Reperfusionsschaden limitiert wird (Theilmeier et al. 2006). Hinsichtlich einer Regulation der Intimahyperplasieausbildung nach Arterienverletzung zeigten Untersuchungen an S1PR3-Knockout-Mäusen, dass der Effekt vom Verletzungsmodell abhängig ist: so förderte der S1PR3 die Intimahyperplasie nach Denudation der Iliofemoralarterie (Shimizu et al. 2012), zeigte
Einleitung
32 aber einen inhibitorischen Effekt nach Ligatur der A. carotis (Shimizu et al. 2012, Keul et al. 2011).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass S1P-Rezeptoren potentiell sowohl pro- als auch antiatherogene Eigenschaften besitzen. Dies beruht auch darauf, dass die verschiedenen S1P-Rezeptoren unterschiedliche Signalwege regulieren und so der Effekt von S1P u.a. vom Expressionsmuster der S1P-Rezeptoren im jeweiligen Gefäßabschnitt abhängig ist. Interessanterweise kann dieses Expressionsmuster in den unterschiedlichen arteriellen Gefäßsystemabschnitten variieren (Shimizu et al. 2012). Für klinische Studien bedeutet dies, dass die S1PR-bezogenen Effekte zwischen den verschiedenen atherosklerotischen Krankheitsbildern unterschiedlich ausfallen können.
1.4.3. Bioverfügbarkeit von S1P
S1P ist als normaler Bestandteil in menschlichem Plasma und Serum zu finden (Yatomi et al. 1997). Die Konzentrationen im Blut und in der Lymphflüssigkeit liegen 2-3 Größenordnungen höher als im Gewebe, so dass ein S1P-Gradient besteht, welcher u.a. für den Lymphozytenegress aus den primären und sekundären lymphatischen Organen von entscheidender Bedeutung ist (Maceyka und Spiegel 2014, Allende et al. 2003). Als Hauptquellen für Plasma-S1P finden sich Erythrozyten und aktivierte Thrombozyten sowie vaskuläre Endothelzellen (Yatomi et al. 1995a, Pappu et al. 2007, Ito et al. 2007, Venkataraman et al. 2008).
Erythrozyten besitzen hohe S1P-Konzentrationen, da sie weder eine S1P-Lyase noch eine S1P-Phosphatase exprimieren und daher S1P nicht abbauen können (Ito et al. 2007). Diese Eigenschaft wurde bisher für keinen anderen Zelltyp gefunden (Ito et al. 2007). Es ist daher davon auszugehen, dass vermutlich hauptsächlich Erythrozyten für die basalen S1P-Spiegel im Plasma verantwortlich sind (Ito et al. 2007).
Thrombozyten können ebenso wie Erythrozyten S1P synthetisieren, da sie eine hohe Sphingosinkinaseaktivität besitzen (Ito et al. 2007). Ihnen fehlt allerdings die S1P-Lyase (Yatomi et al. 1995a, Yatomi et al. 2001). Da Thrombozyten nach Aktivierung S1P freisetzen, erhöhen sie auf diese Weise die lokale S1P-Konzentration nach Gefäßverletzung (Yatomi 2008).
Einleitung
33 Vaskuläre Endothelzellen scheinen S1P vor allem unter dem Einfluss von laminaren Scherkräften freizusetzen (Venkataraman et al. 2008). Als Erklärung könnte dienen, dass laminare Scherkräfte zu einer verringerten Expression der S1P-Phosphatase-1 und der S1P-Lyase führen (Venkataraman et al. 2008). Welche Zellen bzw. Mechanismen - wie z.B. eine Regulation von S1P-Transportern - den S1P-Spiegel im Blut genau definieren, ist bisher nicht bekannt.
Je nach Studie variieren die Konzentrationsangaben für S1P bei gesunden Probanden im menschlichen Serum von ca. 500 bis 1100nM und im Plasma von ca. 200 bis 400nM (Moritz et al. 2017, Winkler et al. 2015, Murata et al. 2000, Yatomi et al. 1997). Ursächlich für die höheren Werte im Serum könnte bei der Präparation freigesetztes S1P aus Thrombozyten sein (Yatomi et al. 1997).
Im Plasma ist der Großteil des S1P (ca. 60%) an Lipoproteine gebunden, hierbei vor allem an High Density Lipoprotein (HDL) und in absteigender Reihenfolge auch an Low Density Lipoprotein (LDL) und Very Low Density Lipoprotein (VLDL) (Murata et al. 2000). Das an HDL gebundene S1P scheint auch biologisch aktiv zu sein, da einige der HDL-vermittelten Effekte zumindest zum Teil dem S1P zugeschrieben werden können (Murata et al. 2000, Sattler und Levkau 2009). Die verbleibenden ca. 40% des S1P finden sich an Albumin gebunden (Murata et al. 2000).
Obwohl S1P in der Homöostase des Gefäßsystems potentiell eine wichtige Rolle spielt, gibt es bis heute nur zwei klinische Beobachtungsstudien, die S1P-Spiegel in Gefäßpatienten gemessen haben. Die Arbeitsgruppe von Deutschman et al. zeigte 2003, dass KHK-Patienten höhere Serum-S1P-Spiegel aufwiesen als gesunde Kontrollen. Weiterhin wurde eine positive Korrelation zwischen den Serum-S1P-Spiegeln und dem Schweregrad der KHK beschrieben (Deutschman et al. 2003). Sieben Jahre später kam jedoch eine andere klinische Studie an KHK-Patienten zu einer gegensätzlichen Schlussfolgerung: hier lagen die Plasma-S1P-Spiegel von KHK-Patienten unter denen gesunder Kontrollen (Sattler et al. 2010). Es ist bislang unklar, warum die beiden Studien zu derart gegensätzlichen Ergebnissen gekommen sind.
Einleitung
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1.5. Fragestellung und Zielsetzung
Ziel der hier vorliegenden Pilotstudie ist die Untersuchung potentieller Assoziationen zwischen den Serum-S1P-Spiegeln und den Erkrankungsbildern pAVK und Carotisstenose. Dabei sollen zunächst die basalen Serum-S1P-Level hinsichtlich möglicher Unterschiede zwischen gesunden Kontrollen und Gefäßpatienten miteinander verglichen werden. Weiterhin soll überprüft werden, ob die Serum-S1P-Konzentrationen zum einen mit dem klinischen Verlauf und zum anderen mit der Ausbildung einer relevanten Restenose korrelieren.
Ziel dieser Untersuchungen ist die Frage, ob den Serum-S1P-Spiegeln eine prädiktive Funktion im Rahmen atherosklerotischer Erkrankungen zukommt. Dies könnte u. U. neue Ansatzpunkte für eine individualisierte Therapie von Gefäßpatienten liefern, um im Hinblick auf Diagnostik und Nachsorge atherosklerotische Gefäßveränderungen frühzeitiger diagnostizieren und behandeln zu können.
Material und Methoden
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2. Material und Methoden
2.1. Studiendesign
2.1.1. Ethikantrag
Der Ethikantrag für diese Beobachtungsstudie wurde von der Ethik-Kommission der Ärztekammer Hamburg genehmigt (PV 3425).
2.1.2. Studiengruppen
Kontrollkollektiv:
Als Kontrollgruppe dienten 215 zufällig ausgewählte Blutspender des Instituts für Transfusionsmedizin des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf, die alle Kriterien gemäß der „Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten“ der deutschen Bundesärztekammer erfüllten. Dieses schloss Spender mit schweren Herz- und Gefäßerkrankungen aus. Die Proben wurden anonymisiert, wobei Geschlecht und Alter der Spender vermerkt wurden.
Patientenkollektiv:
Es wurden 131 Patienten eingeschlossen, die an der Klinik und Poliklinik für Gefäßmedizin des Universitären Herzzentrums Hamburg im Zeitraum von August 2011 bis Februar 2013 an einer stenosierenden Erkrankung der Hals- oder Becken-Beinarterien invasiv behandelt wurden. Die Ein- und Ausschlusskriterien sind der Tabelle 4 zu entnehmen.
Material und Methoden
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Tabelle 4: Ein- und Ausschlusskriterien
Einschlusskriterien Ausschlusskriterien
Patientenalter über 18 Jahren dilatative Form der Arteriopathie relevante pAVK (Stadium II-IV) Lebenserwartung < 2 Jahre relevante Stenose der A.carotis floride Infektionen bei der initialen
Aufnahme
spezifische Therapie geplant Osteomyelitis
guter bis mittelmäßiger Allgemeinzustand (ASA I-III)
bekannte Gerinnungsproblematiken (z.B. akute Thrombosen) relevante hochgradige KHK
2.1.3. Studienverlauf
Der Studienverlauf wird in Abbildung 5 zusammengefasst.
Alle Studienpatienten wurden leitliniengerecht therapiert. Die klinischen Daten der Patientenhistorie sowie der aktuellen Anamnese wurden anhand der Entlassungsberichte erfasst. Die erhobenen Parameter sind in Tabelle 5 dargestellt und definiert.
Bei jedem Patienten wurde vor der geplanten Intervention eine Blutentnahme durchgeführt, woraus neben den Routinelaborparametern (Tab. 6) der präoperative Serum-S1P-Spiegel bestimmt wurde (s. 2.3.). In den meisten Fällen erfolgte diese Blutentnahme im Rahmen der stationären Aufnahme (1-3 Tage vor der Intervention), in Ausnahmenfällen war der Blutabnahmezeitpunkt früher. Innerhalb der ersten 30 Tage nach Durchführung des geplanten Eingriffs erfolgte eine erneute Blutentnahme
Abbildung 5: Studienverlauf: Dargestellt ist der zeitliche Verlauf der Studie von der Aufnahme, über die Operation bis zu den Nachsorgeterminen.
Material und Methoden
37 (post-OP-Proben), aus der neben dem postoperativen-S1P-Spiegel mit Ausnahme des HDL dieselben Laborparameter wie präoperativ bestimmt wurden. Im Rahmen der Nachsorgeuntersuchungen (3, 6, 12 und 24 Monate nach dem Eingriff) wurde der Restenosegrad mittels Ultraschall bestimmt. Konnten die Patienten nicht zur Nachsorgeuntersuchung in der eigenen Ambulanz erscheinen, wurde der aktuelle Gefäßstatus inklusive auswärts durchgeführter FKDS-Untersuchungen beim behandelnden Arzt erfragt.
Als primäre Endpunkte wurden ein Verschluss der Rekonstruktion oder eine hochgradige Stenose mit folgender Reoperation definiert. Zu den sekundären Endpunkten gehörten Tod und Umzug der Patienten. Wurde nachfolgend eine Operation in einem anderen Gefäßabschnitt durchgeführt, so wurde auf die weitere Bestimmung der S1P-Konzentrationen aufgrund möglicher Interferenzen verzichtet, die klinischen und sonographischen Nachsorgeuntersuchungen erfolgten jedoch wie geplant.
Tabelle 5: Erhobene Variablen und ihre Definition: Die erhobenen Parameter sind unterteilt in allgemeine Parameter, Risikofaktoren für Atherosklerose, Komorbiditäten, die prä- und postoperative Medikation und Operationsdaten.
Variable Variablendefinition
allgemeine Parameter:
Geburtsdatum ---
Geschlecht männlich/weiblich
Erkrankung pAVK/Carotisstenose
erkrankte Seite links/rechts
Erkrankungsstadium bei Aufnahme
pAVK-Stadium nach Fontaine/ symptomatische/asymptomatische Carotisstenose Aufnahmedatum --- Entlassungsdatum --- Tod ja/nein Todesdatum --- Risikofaktoren für Atherosklerose:
Hyperlipidämie ja/nein; Gesamtcholesterin >200mg/dl
arterieller Hypertonus ja/nein; gemäß-WHO-Kriterien oder
Material und Methoden
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Nikotinabusus aktiv/nein/ehemalig
Diabetes mellitus ja/nein; gemäß WHO-Kriterien
Komorbiditäten:
Adipositas ja/nein; BMI >30kg/m²
Niereninsuffizienz ja/nein; GFR ≤60ml/min
koronare Herzerkrankung ja/nein
Herzinsuffizienz ja/nein
Herzrhythmusstörungen ja/nein; jegliche Rhythmusstörungen
COPD ja/nein; gemäß WHO-Kriterien
Malignom ja/nein; jegliches Malignom in der
Patientenhistorie prä- und postoperative Medikation:
ASS ja/nein Clopidogrel ja/nein Marcumar ja/nein Heparin ja/nein Statin ja/nein Operationsdaten: Z.n. Rekanalisation ja/nein Reoperation ja/nein
Extremität voroperiert ja/nein
Operationsdatum ---
Operationsgröße
klein (lokale TEA, einfache PTA und Stentimplantationen);
mittel (kombinierte TEA mit/ohne PTA/ Stenting oder einfache Bypass-OP): groß (aufwendige, kombinierte TEA mit/ohne
PTA/Stenting, größere Bypass-OP)
Operationstechnik offen-chirurgisch/endovaskulär
TEA (lokal und/oder retrograd) ja/nein
Patchimplantation ja/nein
Bypassanlage ja/nein
PTA ja/nein
Stentimplantation ja/nein
Material und Methoden
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Tabelle 6: Erhobene Laborparameter
Laborparameter Einheit Erythrozyten Mrd/ml Hämoglobin g/dl Hämatokrit % Thrombozyten Mrd/l Leukozyten Mrd/l HDL mg/dl Kreatinin mg/dl CRP mg/l
Material und Methoden
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2.2. Bestimmung des Stenosegrades mittels Ultraschall
Die farbkodierte Dopplersonographie (FKDS) wurde mit folgenden Geräten durchgeführt: GE LOGIQ E6 und GE LOGIQ E9 sowie dem Linearschallkopf 9 mit 2-10MHz von General Electrics.
Die Patienten wurden zur Untersuchung der A. carotis in Rückenlage mit leichter Überstreckung und Drehung des Kopfes zur Gegenseite untersucht. Nach Identifizierung der Carotisbifurkation im B-Bild wurden Gefäßmorphologie und Intima-Media-Dicke in der A. carotis communis bestimmt. Anschließend erfolgte die exakte Quantifizierung der Flussgeschwindigkeit im pw-Doppler mit einem Anschallwinkel von ≤60°.
Die Untersuchung der Patienten nach peripherer Rekonstruktion erfolgte in Rückenlage. Der postoperative Restenosegrad wurde für alle Gefäßabschnitte gleichermaßen anhand der Flussgeschwindigkeit im operierten Gefäßabschnitt eingeschätzt und, wie in Tab. 7 dargelegt, unterteilt.
Tabelle 7: Abschätzung des Stenose-/Restenosegrades anhand der Flussgeschwindigkeiten: Die Graduierung erfolgte mittels FKDS anhand der gemessenen Flussgeschwindigkeiten im initial operierten Gefäßabschnitt (gilt sowohl für pAVK- als auch für Carotisstenose-Patienten).
Flussgeschwindigkeit Stenosegrad 0cm/s Verschluss 1-99cm/s normal 100-199cm/s leichtgradig 200-299cm/s mittelgradig ab 300cm/s hochgradig
Material und Methoden
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2.3. Bestimmung der S1P-Konzentration im Serum
Nach Entnahme des Blutes wurden die Proben für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen, bevor sie anschließend bei 4°C gelagert wurden. Die Weiterverarbeitung erfolgte innerhalb von 48 Stunden nach der Entnahme. Hierfür wurde das Serum mittels Zentrifugation (10min, 1000xg) abgetrennt, aliquotiert und anschließend für die spätere Spiegelbestimmung bei -80°C eingefroren. Die S1P-Messungen erfolgten mittels Massenspektroskopie und wurden im Labor am Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf (Prof. Dr. Edzard Schwedhelm) unter Verwendung eines etablierten Protokolls durchgeführt (Shimizu et al. 2007). Nach Deproteinisierung der Proben mit 80% Acetonitril (in Wasser) wurden diese abzentrifugiert und die Überstände auf einer Zorbax SB-C8-Säule (Agilent) fraktioniert. S1P wurde mit einem binären Gradienten (Methanol, Ameisensäure) eluiert und in den Fraktionen mit einem Massenspektrometer (MS 1200, Fa. Varian) detektiert. Dabei wurde S1P (m/z = 380) in ein Tochterion (m/z = 264) fragmentiert, welches zur Quantifizierung verwendet wurde. Als interner Standard wurde C17-S1P (1000nM) verwendet. Jede Serumprobe wurde doppelt prozessiert und jede Messung erfolgte im Duplikat. Die 4 Messwerte pro Probe wurden anschließend gemittelt. Jede Platte enthielt zwei Qualitätsstandards (500nM und 1000nM S1P) sowie eine Kalibrierungsreihe (0nM, 100nM, 300nM, 1000nM, 3000nM S1P). Die daraus resultierende Kalibrierungskurve wurde zur Bestimmung der absoluten S1P-Konzentrationen in den Serumproben verwendet.
2.4. Auswertung und statistische Methoden
Die Erfassung der erhobenen Daten erfolgte tabellarisch mittels Microsoft Office Excel 2007. Die beschriebenen Datenanalysen wurden entweder mit Hilfe des Programms IBM SPSS Statistics 21 oder der Graph Pad Prism 6 Software durchgeführt. Die Graphiken wurden mit Graph Pad Prism 6 bzw. Microsoft Office Power Point 2016 erstellt.
Alle Untergruppen mit einer Anzahl von n<5 wurden aufgrund der zu geringen statistischen Aussagekraft von einer statistischen Auswertung ausgeschlossen. Die Datensätze wurden zunächst mit Hilfe des „D’Agostino-Pearson omnibus K2 Normalitätstests“ auf Normalverteilung geprüft. Lag diese vor, so wurde für Mittelwertsprüfungen der 2-seitige t-Test eingesetzt sowie für einen Vergleich von
Material und Methoden
42 mehreren Datensätzen eine Varianzanalyse (ANOVA) berechnet. Bei nicht-normalverteilten Datensätzen wurde für Mittelwertsprüfungen der Mann-Whitney-U-Test verwendet. Handelte es sich um einen Vergleich von Datensätzen aus mehr als zwei unabhängigen Stichproben, so wurde der Kruskal-Wallis-Test eingesetzt, bei gepaarter Analyse der Wilcoxon-Test. Eventuelle Korrelationen zwischen Serum-S1P-Konzentrationen und klinischen Parametern wurden unter Anwendung des Spearman’s Korrelationskoeffizienten identifiziert. Für die Analysen von binären Variablen wurde der Exakte Fisher-Test verwendet.
Die Daten sind als Mittelwert (MW) ± Standardabweichung bzw. ± Standardfehler dargestellt oder aber als Median und dem Konfidenzintervall mit einem Konfidenzniveau von 95% sowie der ersten und dritten Quartile. Das Signifikanzniveau wurde auf P≤0,05 festgesetzt.
Da viele Patienten die Termine zu Nachsorgeuntersuchungen trotz der vorherigen Aufklärung nicht regelhaft wahrgenommen haben, wurden die Nachsorgeuntersuchungsergebnisse für die statistische Auswertung in zwei Gruppen zusammengefasst. Alle Serum-S1P-Werte und Sonographieergebnisse, die zwischen dem 31. und 180. postoperativen Tag erhoben wurden, wurden definiert als „<6 Monate“. Entsprechende Erhebungen nach dem 180. postoperativen Tag wurden als „>6 Monate“ klassifiziert. Lagen für einen Patienten mehrere Messwerte innerhalb der jeweiligen Gruppe vor, so wurde der Mittelwert der S1P-Spiegel ermittelt und verwendet. Von einigen wenigen Patienten lagen sonographische Ergebnisse >24 Monate postoperativ vor. Sofern es sich hierbei nicht um das Erreichen eines primären Endpunktes handelte, wurde rückblickend angenommen, dass zum Zeitpunkt 24 Monate postoperativ ebenfalls noch kein primärer Endpunkt vorlag.
Ergebnisse
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3. Ergebnisse
3.1. Stabilität des Serum-S1P
Zunächst wurde untersucht, inwieweit die Dauer der Probenlagerung einen Einfluss auf den S1P-Spiegel nimmt. Hierzu wurden von 10 gesunden Probanden die Serum-S1P-Konzentrationen zum Zeitpunkt der Entnahme bestimmt und diese mit den Werten nach 24 Stunden Lagerung bei Raumtemperatur und nach jeweils 24, 48 und 72 Stunden Lagerung im Kühlschrank bei 4°C verglichen. Zwischen diesen Proben konnten keine signifikanten Unterschiede der S1P-Werte festgestellt werden (Abb. 6).
Abbildung 6: Serum-S1P-Konzentrationen in Abhängigkeit der Lagerungsart und -zeit: Von 10 gesunden Probanden wurden jeweils 5 Blutproben entnommen und das Serum präpariert (s. 2.3.). Jeweils eine Probe wurde sofort eingefroren (0 Stunden), die anderen nach Lagerung für 24 Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder nach Lagerung bei 4°C für 24, 48 oder 72 Stunden. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler gezeigt. Dieses Experiment wurde von Eileen Mudersbach im Labor von Prof. Dr. Edzard Schwedhelm (Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf) durchgeführt.
