Tierärztliche Hochschule Hannover
Effekte von Sphingosin-1-Phosphat und Analoga auf die Entzündungsreaktion und epidermale
Hyperproliferation in Modellen der Psoriasis
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Katrin Schaper
Hildesheim
Hannover 2012
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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer
2. Gutachter: Prof. Dr. Reinhard Mischke
Tag der mündlichen Prüfung: 9. Mai 2012
Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgesellschaft und die
Hannoversche Gesellschaft zur Förderung der Kleintiermedizin e.V. gefördert.
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Für meine Eltern
In Liebe und Dankbarkeit
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1 EINLEITUNG... 13
2 LITERATURÜBERSICHT ... 15
2.1 Die Haut ... 15
2.1.1 Aufbau und Funktion der Haut ... 15
2.1.2 Differenzierung der Keratinozyten ... 17
2.2 Dendritische Zellen ... 18
2.2.1 Entstehung und Differenzierung dendritischer Zellen ... 19
2.2.2 Charakterisierung einzelner Subtypen dendritischer Zellen in der Haut ... 20
2.2.2.1 Langerhanszellen (LC) ... 20
2.2.2.2 Dermale dendritische Zellen... 22
2.2.2.3 Plasmazytoide dendritische Zellen... 24
2.2.3 Langerhanszellen: Antigenaufnahme, -Präsentation und T-Zell-Differenzierung... 24
2.3 Sphingosin-1-Phosphat ... 27
2.3.1 Biosynthese und Abbau von S1P ... 27
2.3.2 S1P-Rezeptoren... 29
2.3.3 Effekte von S1P auf epidermale Zellen... 32
2.3.4 Effekte von S1P auf Immunzellen ... 32
2.3.5 S1P-Strukturanalogon FTY720 ... 35
2.4 Psoriasis vulgaris... 37
2.4.1 Histopathologische Charakteristika der Psoriasis vulgaris ... 37
2.4.2 Ätiopathogenese ... 39
2.4.3 Tiermodelle der Psoriasis... 40
2.4.3.1 Imiquimod-induziertes Entzündungsmodell der Maus ... 41
2.4.3.2 Mouse-Tail-Assay... 42
3 MATERIAL UND METHODEN... 44
3.1 Geräte und Reagenzien... 44
3.1.1 Geräte für die Zellkultur... 44
3.1.2 Reagenzien für die Zellkultur ... 45
3.1.3 Geräte/Reagenzien für den ELISA ... 45
3.1.4 Geräte/Reagenzien für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) ... 46
3.1.5 Geräte für die In-vivo-Versuche ... 46
6
3.1.6 Reagenzien für die In-vivo-Versuche ... 47
3.1.7 Testsubstanzen ... 47
3.1.8 Geräte für die Histologie ... 47
3.1.9 Reagenzien für die Histologie ... 48
3.1.10 Geräte/Reagenzien für die Proteinextraktion... 48
3.1.11 Geräte/Reagenzien für die Immunhistochemie... 48
3.1.12 Hergestellte Puffer und Lösungen ... 49
3.1.13 Versuchstiere ... 50
3.2 Versuchsübersicht ... 51
3.3 In-vitro-Versuche ... 53
3.3.1 Generierung dendritischer Zellen aus murinem Knochenmark ... 53
3.3.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR, Polymerase Chain Reaction) ... 53
3.3.2.1 RNA-Isolierung ... 54
3.3.2.2 Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ... 54
3.3.2.3 Agarose-Gel-Elektrophorese... 56
3.3.3 Stimulation dendritischer Zellen ... 56
3.3.3.1 Präinkubation mit S1P, FTY720 und FTY720P... 56
3.3.3.2 Präinkubation mit SEW2871, W146 und JTE-013 ... 58
3.3.4 Kommunikation zwischen murinen Keratinozyten und dendritischen Zellen ... 58
3.3.4.1 Präinkubation der dendritischen Zellen mit S1P ... 58
3.3.4.2 Präinkubation der Keratinozyten mit S1P ... 60
3.3.5 Bestimmung der Zytokinkonzentrationen mittels ELISA... 60
3.3.6 Versuch zur Antigenaufnahme dendritischer Zellen in vivo/ex vivo... 61
3.4 In-vivo-Versuche... 62
3.4.1 Imiquimod-induziertes Entzündungsmodell der Maus ... 62
3.4.1.1 Beurteilung der Entzündungsreaktion am Rücken... 64
3.4.1.2 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST)... 64
3.4.1.3 Local-Lymph-Node-Assay (LLNA)... 64
3.4.1.4 Proteinextraktion... 65
3.4.1.5 Bestimmung der IL-17- und IL-23-Konzentration mittels ELISA ... 65
3.4.1.6 Histologie ... 65
3.4.1.7 Bestimmung der Anzahl an Leukozyten und Lymphozyten im Blut ... 66
3.4.2 Optimierung des Imiquimod-Modells ... 67
3.4.2.1 Versuch mit S1P im optimierten Imiquimod-Modell ... 67
3.4.3 Mouse-Tail-Assay... 68
7
3.5 Statistische Auswertung... 69
4 ERGEBNISSE... 70
4.1 Ergebnisse der In-vitro-Versuche... 70
4.1.1 Expression der S1P-Rezeptoren ... 70
4.1.2 Einfluss der Testsubstanzen auf die Zytokinproduktion dendritischer Zellen... 70
4.1.2.1 Einfluss von S1P, FTY720 und FTY720P auf die Sekretion von IL-12 und IL-23 ... 71
4.1.2.2 Einfluss von S1P, FTY720 und FTY720P auf die IL-27-Sekretion ... 74
4.1.3 Einfluss von S1PR-Agonist und Antagonisten auf die Zytokinproduktion ... 75
4.1.3.1 Einfluss von S1PR1-Agonist SEW2871 auf die Zytokinproduktion... 75
4.1.3.2 Einfluss von S1PR1-Antagonist W146 ... 76
4.1.3.3 Einfluss von S1PR2-Rezeptor Antagonist JTE-013 ... 76
4.1.4 Ergebnisse der Transwell-Versuche bei murinen Keratinozyten und dendritischen Zellen 77 4.1.4.1 Zytokinproduktion der murinen Keratinozyten nach Stimulation mit LPS und PGN ... 78
4.1.4.2 Einfluss auf die IL-12 und IL-23-Sekretion im Transwell-Versuch durch die Präinkubation der dendritischen Zellen mit S1P... 78
4.1.4.3 Einfluss auf die IL-6 und KC-Sekretion im Transwell-Versuch durch die Präinkubation der dendritischen Zellen mit S1P... 79
4.1.4.4 Einfluss auf die Zytokinbildung im Transwell-Versuch durch die Präinkubation der murinen Keratinozyten mit S1P ... 80
4.2 Ergebnisse der In-vivo-Versuche ... 82
4.2.1 Einfluss der Testsubstanzen auf das Imiquimod-induzierte Entzündungsmodell... 82
4.2.1.1 Ergebnis der Rückenbeurteilung ... 82
4.2.1.2 Ergebnis des Mouse-Ear-Swelling-Tests... 84
4.2.1.3 Ergebnisse der histologischen Auswertung der Ohren ... 85
4.2.1.3.1 Einfluss der Testsubstanzen nach Scoresystem ... 86
4.2.1.3.2 Einfluss der Testsubstanzen auf die gemessene Epidermisdicke... 88
4.2.1.4 Ergebnis der histologischen Auswertung des Rückens ... 90
4.2.1.4.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die Epidermisdicke ... 90
4.2.1.5 Ergebnis des Local-Lymph-Node-Assays... 92
4.2.1.6 Einfluss der Testsubstanzen auf die IL-17- und IL-23-Konzentration in der Haut .... 94
4.2.1.7 Einfluss der Testsubstanzen auf die Anzahl an Leukozyten und Lymphozyten im Blut………. ... 95
4.2.2 Ergebnis der Optimierung des Imiquimod-Modells ... 97
4.2.2.1 Wirkung von S1P im optimierten Imiquimod-Modell ... 98
8
4.3 Mouse-Tail-Assay... 98
4.4 Einfluss von S1P auf die Antigenaufnahme dendritischer Zellen... 100
5 DISKUSSION ... 103
5.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die Zytokinproduktion dendritischer Zellen... 104
5.2 Einfluss von S1PR-Agonisten und Antagonisten auf die Zytokinproduktion... 107
5.3 Einfluss von S1P auf die Interaktion von murinen Keratinozyten und dendritischen Zellen…... 108
5.4 Einfluss von S1P auf die Antigenaufnahme von Langerhanszellen in vivo/ex vivo... 110
5.5 Wirkung der Testsubstanzen im IMQ-induzierten Entzündungsmodell ... 111
5.6 Wirkung der Testsubstanzen im Mouse-Tail-Assay... 120
5.7 Schlussfolgerung und Ausblick ... 121
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 123
7 SUMMARY... 126
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 129
9 ANHANG... 164
9.1 In-vitro-Versuche ... 164
9.2 In-vivo-Versuche... 171
9 Abkürzungsverzeichnis
® Marke, Warenzeichen
± Plus/Minus
% Prozent
̊
C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikromol
AC Adenylatcyclase
Ag Antigen
ANOVA Analysis of variance
Aqua bidest Aqua bidestillata
BAX B-cell lymphoma-2-associated x protein
BPB Bromphenolblau
BSA Bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
ca. circa
cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat
CCR C-C Chemokin-Rezeptor
CD Cluster of differentiation
CLA Cutanous lymphozyte antigen
cm Zentimeter
CO2 Kohlendioxid
DC Dendritische Zelle(n)
DD Diflorason-Diacetat
d.h. das heißt
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
cDNA komplementäre DNA
E.coli Escherichia coli
10
EDG Endothel differentiation gene
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay
ERK Extracellular-regulate kinase
et al. et alii, und andere
FITC Fluorescein-Isothiocyanat
FKS Fetales Kälberserum
FTY720P FTY720-Phosphat
g Gramm
GAPDH Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase
GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor
h hora, Stunde
HDL High density protein
HE Hämatoxylin-Eosin
HLA Human Leukocyte Antigen
IDC Interstitiellen dendritischen Zellen
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
IMQ Imiquimod
JNK c-Jun N-terminal Kinase
K6, 16, 17 Keratin
K Kalium
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
KC murines IL-8 Homolog
KCL Kaliumchlorid
Ko Kontrolle
l Liter
lat. Latein
LC Langerhanszelle(n)
LLNA Local-Lymph-Node-Assay
11
Ln. Lymphonodus
LPS Lipopolysaccharid
MEST Mouse-Ear-Swelling-Test
MHC Major Histocompatibility Complex
mg Miligramm
ml Mililiter
mm Milimeter
MIP-3α Macrophage-Inflammatory-Protein-3-alpha
MoDC Monocyte derived dendritic cells
MSC Mesenchymal stem cells
MW Mittelwert
n Anzahl der Proben/Tiere
NaCl Natriumchlorid
NaHCO Natriumhydrogencarbonat
NH4CL Ammoniumchlorid
n.d. nicht detektiert
Nr. Nummer
OK Orthokeratose
PAMP Pathogen-associated molecular pattern
PASI Psoriasis area severity Index
PCR Polymerase Kettenreaktion
PBS Phosphate-buffered saline
PGN Peptidoglykan
PI3K Phosphoinositid-3-Kinase
PLC Phospholipase C
PRRs Pattern recognition receptors
RNA Ribonukleinsäure
mRNA messenger RNA
RT Reverse Transkriptase
S.D. Standard deviation/Standardabweichung
SDS Sodiumdodecylsulfat
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S1P Sphingosin-1-Phosphate
SphK Sphingosin-Kinase
S1PR Sphingosin-1-Phophate-Rezeptor
s.o. siehe oben
TBS Tris-buffered saline
TCR T-Zell-Rezeptor
TGF Transforming Growth Factor
TH T-Helfer-Zelle
TMB Tetramethylbenzidine
TLR Toll-like-Rezeptor
TNF Tumor-Nekrose-Faktor
WBC Weiße Blutkörperchen
z.B. zum Beispiel
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1 Einleitung
Dem körpereigenen Lipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) wird eine bedeutende Rolle als pleiotroper Mediator zugesprochen, der an der Modulation physiologischer Aktivitäten von epidermalen sowie von Entzündungszellen beteiligt ist. S1P entfaltet seine Wirkung dabei sowohl intrazellulär als second messenger, als auch über fünf G-Protein-gekoppelte Rezeptoren an der Zelloberfläche und beeinflusst damit zahlreiche zelluläre Prozesse, wie die Proliferation, Differenzierung, Migration und Morphogenese. Verschiedene experimentelle Studien bescheinigen dem S1P ein Potential in der Behandlung der Psoriasis (Schuppenflechte), einer chronisch entzündlichen und hyperproliferativen Hauterkrankung, die durch silbrig glänzende, schuppige Plaques charakterisiert ist. So zeigen neuere Untersuchungen, dass S1P über den S1P-Rezeptor 2 als ein potenter Inhibitor des Zellwachstums von humanen Keratinozyten fungiert (SCHUPPEL et al. 2008), dabei jedoch nicht zur Apoptose führt, sondern die Differenzierung der Zellen induziert (VOGLER et al. 2003). Neben seinem Einfluss auf epidermale Zellen moduliert S1P weiterhin die Chemotaxis bei einer Reihe von Immunzellen. Besonders dendritische Zellen (DC) spielen eine Schlüsselrolle im Immunsystem, da sie eine Brücke zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem bilden. DC besitzen als antigenpräsentierende Zellen die Fähigkeit in der Peripherie des Organismus Antigene aufzunehmen, zum drainierenden Lymphknoten zu migrieren und dort die Proliferation und Differenzierung naiver T-Zellen zu induzieren. Mehrere Studien konnten einen hemmenden Einfluss von S1P auf die Migration dendritischer Zellen beobachten (MATLOUBIAN et al. 2004; CZELOTH et al. 2005; REINES et al. 2009). Auch die DC-T-Zell-Interaktion konnte nachweislich durch S1P moduliert werden. Obgleich diese Eigenschaften vielversprechend sind, liegen bisher noch keine Arbeiten über den Einfluss von S1P in Tier-Modellen der Psoriasis vor und auch die Mechanismen der Zytokinmodulation durch S1P bei DC und Keratinozyten bedürfen weiterer Aufklärung.
Daher besteht das Ziel dieser Arbeit einerseits darin, den Einfluss von S1P auf das Zytokinprofil dendritischer Zellen näher zu untersuchen und ergänzend herauszufinden, welche Rezeptorsubtypen in dieser Regulation eine Rolle spielen.
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Weiterhin soll die Kommunikation zwischen Keratinozyten und DC hinsichtlich der Zytokinbildung näher evaluiert werden, da beiden Zelltypen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese und Aufrechterhaltung der Psoriasis zugesprochen werden (NESTLE et al. 2009). Für diesen In-vitro-Teil werden Zellkulturversuche mit DC, die aus murinem Knochenmark generiert werden sowie murinen Keratinozyten der Zelllinie MSC-P5 durchgeführt. Ebenfalls soll die antiinflammatorische und antiproliferative Wirkung von S1P, vergleichend zu FTY720, ein S1P-Anologon, in einem In-vivo-Modell getestet werden. Hierfür wurde das 2009 von VAN DER FITS et al. publizierte Imiquimod-induzierte Psoriasis-Modell der Maus gewählt. Daneben wird der Einfluss der Testsubstanzen auf die Differenzierung von Keratinozyten in vivo getestet, wofür der Mouse-Tail-Assay genutzt wird.
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2 Literaturübersicht
2.1 Die Haut
2.1.1 Aufbau und Funktion der Haut
Die Haut ist das Grenzorgan, das den Organismus zur Umwelt abschirmt, gleichzeitig aber auch eine große Kontaktfläche bietet. Der Haut kommen vielfältige Funktionen zu. So fungiert sie als Schutzorgan gegenüber mechanischen, chemischen, thermischen sowie biologischen Einflüssen, steuert die Thermoregulation und den Wasserhaushalt des Körpers, dient als Energiespeicher und als Sinnesorgan. Zudem besitzt die Haut auch einen wichtigen immunologischen Schutz, unter anderem durch die zahlreichen antigenpräsentierenden Zellen
(Langerhans-Zellen), die sich in der äußeren Hautschicht befinden.
Die Haut setzt sich aus 3 Schichten zusammen beginnend von außen mit der Epidermis (Oberhaut), Dermis (Lederhaut) und Hypodermis (Unterhaut) (LIEBICH et al. 1999) (siehe Abbildung 2-1).
Abbildung 2-1: Schematischer Aufbau der Haut (COGNIS DEUTSCHLAND GMBH & CO. KG 2003)
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Die Epidermis ist ein mehrschichtiges Plattenepithel, das neben Langerhanszellen, Merkelzellen und Melanozyten zu über 85% aus Keratinozyten besteht. Die Verbindung der Keratinozyten untereinander wird durch besondere Zellstrukturen, den Desmosomen sowie Adhärenzkontakten gewährleistet, während die Keratinozyten mit der Basalmembran über Hemidesmosomen verankert sind (FRITSCH 2004). Die Oberhaut ist in 4 Zellschichten eingeteilt (siehe Abbildung 2-2).
Aufliegend auf der Basalmembran befindet sich das Stratum basale. Diese einlagige Schicht besteht aus zylindrischen Zellen und ist für die Erneuerung der Keratinozyten zuständig. Darauf folgt das Stratum spinosom (Stachelzellschicht), welches aus überwiegend polygonalen Zellen mit runden Zellkernen besteht. Zum Stratum granulosom hin, dessen Zellen durch das Vorhandensein des basophilen Keratohyalins (die Vorstufe des Keratins) charakterisiert sind, flachen die Zellen ab.
Als äußerste Schicht schließt sich das Stratum corneum an, das aus kernlosen ausdifferenzierten Korneozyten besteht (LIEBICH et al. 1999).
Die Dermis stellt die bindegewebige Unterlage der Epidermis dar. Sie lässt sich in das der Epidermis anliegende Stratum papillare und der Hypodermis anliegende Stratum reticulare einteilen. Das Stratum papillare verdankt seinen Namen den fingerförmigen, papillenartigen Erhebungen, mit denen es zur Epidermis in Verbindung steht. Es besteht aus lockerem Bindegewebe und beherbergt Blutgefäße, Lymphbahnen und Nerven sowie zahlreiche Entzündungszellen. Das Stratum reticulare ist im Gegensatz dazu faserreich und zellarm und verleit der Haut durch die scherengitterartige Anordnung der Faserbündel eine hohe Zugfestigkeit.
Die Hypodermis besteht aus einem lockeren Bindegewebe, das die Haut verschieblich mit den Fascien und der Muskulatur verbindet. Hauptbestandteil der Hypodermis ist das in Läppchen liegende Fettgewebe. Das erklärt auch die Funktionen der Unterhaut als Wärmisolator, mechanisches Schutzpolster sowie als Energiereserve (LIEBICH et al. 1999; FRITSCH 2004).
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Abbildung 2-2: Aufbau der Epidermis nach Fritsch (FRITSCH 2004)
2.1.2 Differenzierung der Keratinozyten
Die Keratinozyten unterliegen einer ständigen Erneuerung, wobei Zellverlust und Gewinn einander die Waage halten. Nach ihrer Bildung durch mitotische Teilung im Stratum basale durchwandern die Zellen aktiv die Schichten der Epidermis, wo sie sich abschließend zu den Korneozyten ausdifferenzieren. Im Laufe dieses Prozesses, der physiologisch circa vier Wochen dauert, findet die Keratin- und Fillagrin-Synthese sowie die Bildung des „cornified-envelope“ und die Synthese der Barrierelipide statt. Die niedrigmolekularen „basalen“ Zytokeratine werden im Stratum granulosum in hochmolekulare umgewandelt. Diese verschmelzen dann mit dem histidinreichen Fillagrin, das sich aus dem phosphorylierten Profillagrin gebildet hat und werden über Disulfidbrücken zu einer festen Masse verbunden. Gleichzeitig entsteht der „cornified envelope“ aus den zystinreichen unlöslichen Protein Involukrin, das durch eine kalziumabhängige Transglutaminase quervernetzt wird.
Diese Zellhülle, die sich an der zytoplasmaseitigen Oberfläche der Zellmembran anlagert, führt zu einer starken Festigkeit der Hornzelle und dient weiterhin zum
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Schutz vor Keratolytika sowie organischen Lösungsmitteln. Die im Stratum spinosum synthetisierten Odland-Körperchen, bestehend aus Glukosylceramiden, Sterolestern, Phospholipiden und hydrolytischen Enzymen, sind kleine Zellorganellen, die am Übergang zum Stratum corneum über Exocytose in den Interzellularraum ausgestoßen werden. Diese Lipide werden in ein Gemisch aus Ceramiden, Cholesterin und freien Fettsäuren umgewandelt und bilden die Barrierelipide (LIEBICH et al. 1999; FRITSCH 2004).
2.2 Dendritische Zellen
Dendritische Zellen (DC) in der Haut wurden erstmals 1868 von dem damaligen Medizinstudenten Paul Langerhans entdeckt, der auch der Namensgeber eines epidermalen Subtyps der DC, der Langerhanszelle, ist (BANCHEREAU u.
STEINMAN 1998). Jedoch hatte man zu diesem Zeitpunkt noch keine Ahnung von der Funktion dieses Zelltyps. Erst viele Jahre später, Anfang der 70er Jahre des 20.
Jahrhunderts, wurde die Bedeutung dieser Zelle als wichtiger Bestandteil des Immunsystems von STEINMANN und COHN (1973) beschrieben. Heute weiß man, dass die DC eine wichtige Schnittstelle zwischen angeborener und erworbener Immunität darstellen. So nehmen sie Antigene in der Peripherie des Organismus auf und präsentieren diese anschließend den T-Zellen in den Lymphknoten, wodurch deren Vermehrung und Differenzierung induziert wird. Die DC stellen somit einen entscheidenden Initiator für die adaptive Immunantwort, beziehungsweise Toleranz dar, weshalb sie auch als „Sentinel“, also Wächter des Immunsystems bezeichnet werden (BANCHEREAU u. STEINMAN 1998). Im Vergleich zu den Makrophagen und B-Lymphozyten, die ebenfalls zu den „professionell“ antigenpräsentierenden Zellen gezählt werden, ist die DC die Effektivste, da eine Zelle in der Lage ist bis zu 3000 T-Zellen zu aktivieren (TIZARD 2009). Ihren Namen verdankt die DC ihrer typischen Morphologie mit den langen fingerartigen Fortsätzen (lat. dendriticus = verzweigt) (siehe Abbildung 2-3).
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Abbildung 2-3: Dendritische Zelle (GITIG 2010)
2.2.1 Entstehung und Differenzierung dendritischer Zellen
Die DC stellen eine heterogene Familie von Zellen dar, die gleiche Charakteristika besitzen, sich aber in ihrer Morphologie und Funktion in vielerlei Hinsicht unterscheiden. Man kann die unreifen DC grob in vier Gruppen einteilen: die epidermalen, beziehungsweise Langerhanszellen, die interstitiellen dendritischen Zellen (IDC), die von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDC) sowie die plasmazytoiden dendritischen Zellen (CAUX et al. 2000). Allen Zellen gemeinsam ist jedoch ihr Ursprung, denn wie alle Blutzellen stammen die DC von den hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark ab. Ausgehend von der hämatopoetischen Stammzelle (CD34+; CD = cluster of differentiation) differenzieren sich die Zellen zu myeloiden und lymphoiden Vorläuferzellen weiter. Aus dem myeloiden Zweig entstehen die CD34+CLA+ (cutaneous lymphocyte antigen) als Vorläufer für die Langerhanszellen, die CD34+CLA- als Vorläufer für die interstitiellen DC sowie die MoDC. Die lymphoide Vorläuferzelle bringt die plasmazytoide Vorläuferzelle (CD11-CD13-DR+CD123++) hervor (SHORTMAN u. LIU 2002).
Entscheidend für den Weg der Entwicklung sind bestimmte endogene Faktoren, wie zum Beispiel der granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (PULENDRAN et al. 2001).
Diese unreifen oder auch immaturen DC gelangen über das Blut in die unterschiedlichen Körperregionen und sind dort je nach Subtyp großflächig im
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Gewebe verteilt. Durch verschiedene externe Stimuli, besonders durch mikrobielle und inflammatorische Produkte, wie Lipopolysaccharid (LPS) oder bestimmte Zytokine, wie dem Interleukin-1(IL-1), GM-CSF und TNFα wird die Reifung (Maturation) dieser Zellen ausgelöst. Mit der Maturation kommt es zu einer morphologischen sowie zu einer funktionellen Veränderung der Zellen. So werden bestimmte Oberflächenmarker, die für die T-Zell-Aktivierung essentiell sind, hochgefahren (CD40, CD54, CD80, CD86), während Rezeptoren, die für die Antigenaufnahme von Bedeutung sind, herunterreguliert werden. Weiterhin kommt es zu einer Hochregulation von major histocompatibility complex-II-Molekülen (MHC- II), die für die Antigenpräsentation im Lymphknoten wichtig sind (BANCHEREAU u.
STEINMAN 1998). Diesen aktivierten DC aller Subtypen ist es dann beispielsweise möglich eine CD4+- und/oder eine CD8+-T-Zell-Aktivierung mit entsprechender IL-12- Sekretion zu induzieren.
2.2.2 Charakterisierung einzelner Subtypen dendritischer Zellen in der Haut
In normaler Haut, sowohl von Menschen als auch von Mäusen, befinden sich zwei Hauptgruppen dendritischer Zellen: die epidermalen Langerhanszellen sowie die dermalen dendritischen Zellen (dDC), die zu den interstitiellen DC zählen. Die dermalen DC können bei Mäusen noch weiter unterteilt werden in die Langerin+- und Langerin--dDC. In humaner Haut konnte bisher noch keine Langerin+-dDC nachgewiesen werden (ROMANI et al. 2012). Als ein weiterer Subtyp cutaner DC zählen die plasmazytoiden DC mit lymphoiden Ursprung (GALY et al. 2000).
2.2.2.1 Langerhanszellen (LC)
Die LC sind in einem Netzwerk zwischen den Keratinozyten in der Epidermis lokalisiert und repräsentieren dort circa 2 - 4 % der Zellpopulation (VALLADEAU u.
SAELAND 2005). Noch bis vor Kurzem galt Langerin, ein Typ-II-lectin-Rezeptor als exklusiver Marker für LC. Neueste Studien mit Mäusen belegen jedoch, dass auch Subtypen dDC diesen Rezeptor exprimieren (BURSCH et al. 2007). Allerdings auch
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heute noch charakteristisch für die LC sind die sogenannten Birbeck Granula. Diese intrazytoplasmatischen Zellorganellen in Form eines Tennisschlägers entstehen durch die Bindung des Langerin-Rezeptors (VALLADEAU et al. 2000). Weitere Oberflächenmoleküle, die von LC exprimiert werden sowie die Unterschiede zwischen murinen und humanen und die Unterschiede zwischen epidermalen und dDC sind in Tabelle 2-1 dargestellt. Die Entwicklung einer LC aus hämatopoetischen Stammzellen hängt von bestimmten Mediatoren ab. Zu ihnen zählen der transforming growth factor-ß1 (TGFß1) sowie der nachfolgende Transkriptionsfaktor Id2. So konnten in TGFß -/- Mäusen keine LC in der Haut nachgewiesen werden (BORKOWSKI et al. 1996; HACKER et al. 2003). In entzündlichem Gewebe kommt es außerdem durch den macrophage colony stimulating factor (M-CSF) zur Rekrutierung und Differenzierung zirkulierender Monozyten zu LC (GINHOUX et al.
2006).
LC galten bezüglich der Induktion einer Immunantwort durch Stimulierung naiver T- Zellen lange Zeit als die „Hauptzelle“ in der Haut. Dieses Bild hat sich in den letzten Jahren stark verändert. Mittlerweile weiß man, dass es noch andere dendritische antigenpräsentierende Zellen in der Haut gibt. Außerdem mehren sich Studien, die der LC eine eher regulatorische Rolle im Immunsystem bescheinigen, als die bisher postulierte immunogene. So exprimieren LC Oberflächenmoleküle, wie den co- stimulatory molecule ligand (ICOS-L) oder das immunregulatorische Enzym Indoleamin 2,3-dioxygenase (IDO), die in der Inhibition von T-Zell-Aktivierung eine Rolle spielen (VON BUBNOFF et al. 2004). In einem murinen Kontakthypersensitivitäts-Modell (CHS) konnte gezeigt werden, dass LC durch Herunterregulation co-stimulatorischer Moleküle regulatorische T-Zellen induzierten (LOSER et al. 2006). Weitere Studien mit genetisch modifizierten Mäusen, die keine LC besaßen, zeigten in einem Diphteria-Toxin-Rezeptor-Modell eine unveränderte Ohrschwellung (KISSENPFENNIG et al. 2005), beziehungsweise in einem anderen Versuch sogar eine gesteigerte Schwellung (KAPLAN et al. 2005) trotz fehlender LC.
Erst kürzlich wurde die immun-hemmende Wirkung von LC in einem Mausmodell der kutanen Leishmanioseinfektion (KAUTZ-NEU et al. 2011) sowie in
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Hauttransplantationsmodellen unterstrichen (OBHRAI et al. 2008). In diesen Modellen wurde die Expansion regulatorischer T-Zellen durch LC induziert.
Trotz der sich häufenden Hinweise für eine primär regulatorische Rolle der LC gibt es dennoch auch andere, neuere Studien, die belegen, dass LC ebenfalls in der Lage sind eine Kontakt-Hypersensitivitätsreaktion zu induzieren (HONDA et al. 2010;
NOORDEGRAAF et al. 2010). Eine weitere Studie unterstreicht diese immunogene Wirkung und zeigt, dass LC und nicht Langerin+-dDC für die Induzierung einer Th17- Anwort bei einer Pilzinfektion der Haut verantwortlich sind (IGYARTO et al. 2011).
Während LC in gesunder Haut die einzigen antigenpräsentierenden Zellen darstellen, konnte in entzündeter Haut beim Menschen ein weiterer Subtyp identifiziert werden, namentlich die inflammatory dendritic epidermal cells (IDEC). Die IDEC sind besonders in der Haut von Psoriasispatienten, vergleichend mit der Haut atopischer Patienten, in erhöhter Anzahl nachzuweisen (WOLLENBERG et al. 2002).
Charakteristisch für die IDEC ist die Mannose-Rezeptor-mediierte Endocytose, die Expression von FcŰRI sowie die Fähigkeit IgE zu binden. Im Gegensatz zu LC besitzen sie keine Birbeck Granula (WOLLENBERG et al. 1999).
2.2.2.2 Dermale dendritische Zellen
Während LC schon über Jahrzehnte von zahlreichen Wissenschaftlern erforscht werden, steht eine andere Gruppe dendritischer Zellen in der Haut, die dDC erst in den letzten Jahren im Fokus intensiver Untersuchungen. Die dDC halten sich, wie der Name schon sagt, in der Dermis auf und lassen sich bei der Maus in Langerin+- und Langerin--Subtypen einteilen. Langerin--dDC übernehmen mit 80 % den Großteil an dDC und lassen sich weiter anhand der Expression von dem Oberflächenmolekül CD11b unterteilen (KAPLAN 2010).
Langerin+-dDC haben mit 3 % nur einen kleinen Anteil an der Gesamtanzahl dDC, stellen aber circa die Hälfte der Zellpopulation an CD8-Langerin+-DC in den drainierenden Lymphknoten dar (BURSCH et al. 2007; TRIPP et al. 2009). Die Entwicklung dieser Zellen stellt im Vergleich zu den LC andere Anforderungen. So sind die Langerin+-dDC, vergleichend zu den LC, in der Lage sich in TGFß-
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defizienten Mäusen zu entwickeln, benötigen aber im Gegenzug FLT3L und GM-CSF (MERAD et al. 2008; GINHOUX et al. 2012). In Versuchen mit Kontakthypersensitivitäts-Modellen (CHS) konnte gezeigt werden, dass nicht LC, sondern Langerin+-dDC ausschlaggebend für die Entwicklung einer effizienten CHS- Antwort sind (KAPLAN 2010). Weitere Studien zeigten die Bedeutung dieses Subtyps für die Kreuzpräsentation von Antigenen in der Haut, vergleichend mit LC (HELFT et al. 2010).
Allerdings bleibt abzuwarten, ob und inwieweit diese Daten von Mausmodellen für den Menschen übertragbar sind, da Langerin+-dDC bisher noch nicht in humaner Haut beschrieben worden sind (ROMANI et al. 2012).
Tabelle 2-1:Populationen dendritischer Zellen in muriner und humaner Haut sowie in den abführenden Lymphknoten der Haut von Mäusen (MERAD et al. 2008)
+ geringe Expression, +++ sehr hohe Expression, - keine Expression, ↑ Hochregulation der Expression während der Maturation der Zelle, ND nicht definiert, §heterogene Expression, CCR CC-Chemokinrezeptor, EpCAM epithelial-cell-adhesion molecul
24 2.2.2.3 Plasmazytoide dendritische Zellen
Plasmazytoide DC sind lymphoiden Ursprungs und erhielten ihren Namen aufgrund ihrer morphologischen Ähnlichkeit zu Plasmazellen (GROUARD et al. 1996). Die plasmazytoiden DC (PDC) sind vor nicht langer Zeit als ein weiterer neuer Subtyp dendritischer Zellen erfasst worden und scheinen auf die Erkennung viraler Infektionen spezialisiert zu sein (GALY et al. 2000). Sie sind durch die Produktion von Interferon-α und -β charakterisiert. In normaler, nicht entzündlicher Haut sind PCD nicht nachzuweisen, derweil sie bei Erkrankungen wie der atopischen Dermatitis und der Kontaktdermatitis sowie in der Haut von Psoriasispatienten in erhöhter Anzahl detektiert werden konnten. Vergleichend mit der atopischen Dermatitis konnte sogar in psoriasiserkrankter Haut ein erhöhter Gehalt an PDC festgestellt werden, was als ein Unterscheidungsmerkmal in der Diagnosestellung der Erkrankungen dienen könnte (WOLLENBERG et al. 2002).
2.2.3 Langerhanszellen: Antigenaufnahme, -Präsentation und T-Zell- Differenzierung
Nach ihrer Entstehung aus Knochenmarkzellen und ihrer Differenzierung zu epidermalen DC gelangen die LC über die Blutbahn in die Epidermis, wo sie circa 2 - 4 % der Gesamtzellzahl ausmachen (VALLADEAU u. SAELAND 2005).
Entscheidend für ihren Bestimmungsort sind bestimmte chemotaktische Reize. So exprimieren die immaturen DC unter anderem den Chemokinrezeptor 6 (CCR6), der durch das macrophage-inflammatory-protein-3-alpa (MIP-3α), welches von Epithelzellen exprimiert wird, in das Epithelgewebe gelockt wird. Bei inflammatorischen Prozessen konnte gezeigt werden, dass es zu einer Hochregulation von MIP-3α sowie analog zu einer Hochregulation von CCR6 (HOMEY et al. 2000) kommt, was eine zentrale Rolle in der Rekrutierung von LC in der Haut spielen könnte. Die unreifen DC zeichnen sich besonders durch die Fähigkeit aus Antigene aufzunehmen. Dies geschieht entweder durch Phagozytose (INABA et al. 1993), Macropinozytose oder durch bestimmte Rezeptoren, wie dem Mannose-Rezeptor, dem Fcγ oder dem FcŰ, die die adsorbtive Endozytose
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mediieren (SALLUSTO u. LANZAVECCHIA 1994; SALLUSTO et al. 1995). Nach der Antigenaufnahme bewegt sich die DC zu den drainierenden Lymphknoten, wo die Präsentation des Antigens für die T-Zellen stattfindet. Auf diesem Weg findet die Reifung statt, wobei die Zelle morphologische und funktionelle Veränderungen durchläuft. Es kommt unter anderem zu einer Expression von co-stimulativen Molekülen, wie CD80, CD86 und CD40 sowie zu einer Hochregulation von MHC- Molekülen, welches entscheidende Faktoren für die Interaktion mit den T-Zellen darstellen. Weiterhin wird der Chemokinrezeptor 7 exprimiert, der für die Rekrutierung der DC aus dem Gewebe und die Migration zu den T-Zellregionen im Lymphknoten eine entscheidende Rolle spielt (VILLABLANCA u. MORA 2008). Im Lymphknoten folgt dann der Kontakt zwischen T-Zelle und DC. Das Schicksal einer naiven T-Zelle hängt hierbei von drei Signalen ab. Das erste Signal ist die Verbindung zwischen dem T-cell-receptor (TCR) und dem pathogenen Peptid, präsentiert durch die MHC-II-Moleküle der DC. Weiterhin notwendig sind die co- stimulatorischen Moleküle, ohne die die T-Zellen in Anergie verfallen würden, was ihnen die Möglichkeit nimmt andere Immunzellen zu aktivieren (KAPSENBERG 2003). Zu ihnen zählen die auf den DC exprimierten B7-Molekülen (CD80 und CD86) sowie das CD40 und komplementär dazu die Liganden auf den T-Zellen, das CD28 und der CD40-Ligand. Für die Polarisation der T-Zelle ist das dritte Signal, die Expression von Zytokinen erforderlich (KALINSKI et al. 1999). So sind das IL-12 und das Typ-1-Interferon (IFN) (MAGRAM et al. 1996; KADOWAKI et al. 2000;
TRINCHIERI et al. 2003) entscheidend für die Entwicklung einer TH1-Antwort, während die TH2-Polarisation durch das monocytic chemotactic protein 1 (MCP1), den OX40 Ligand (OHSHIMA et al. 1998) und das Zytokin IL-10 beeinflusst wird (HSIEH et al. 1992; JANEWAY 2002). Der Kontakt zwischen DC und T-Zelle ist in der Abbildung 2-4 schematisch dargestellt.
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Abbildung 2-4: T-Zell-Stimulation durch eine dendritische Zelle (KAPSENBERG 2003)
Diese Polarisation der T-Zellen ist bedeutend für die Art der weiterführenden Immunantwort. Bei vorherrschender TH-1-Antwort kommt es zu einer zellvermittelten Immunität, charakterisiert durch das Rekrutieren zytotoxischer T-Zellen (CD8+) und Makrophagen, während eine dominierende TH-2-Antwort zu einer humoralen Immunität führt, gekennzeichnet durch das Vorhandensein antikörperproduzierender B-Zellen (MURAKAMI et al. 2004). Ebenfalls kann es zu einer Induzierung von regulatorischen TH-Zellen kommen, hervorgerufen durch die Zytokine IL-10 und dem TGF-ß (transforming-growth factor-ß) (ZELLER et al. 1999; CHEN et al. 2003).
Dieser Zelltyp spielt eine wichtige Rolle in der immunologischen Toleranz. Eine erst kürzlich entdeckte neue Form der T-Helferzelle ist die TH17-Zelle (HARRINGTON et al. 2005; PARK et al. 2005). Ihre Polarisation wird durch IL-6 und IL-23 beeinflusst (CUA u. TATO 2010). Die TH-17 Zelle ist charakterisiert durch die Produktion von IL- 17 und IL-22 und wird mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen, wie zum Beispiel der Psoriasis, in Verbindung gebracht (LOWES et al. 2008). Entscheidender Auslöser für die Richtung der Polarisation der TH-Zellen ist bereits die Aktivierung der DC in der Haut. Hier spielt das infektiöse Agens sowie die Reaktion des umliegenden Gewebes, hinsichtlich Chemokin- und Zytokinproduktion, eine entscheidende Rolle.
Über bestimmte Rezeptoren, den sogenannten pattern recognition receptors (PRRs) werden Pathogen-assoziierte Moleküle, die pathogen associated molecular patterns
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(PAMP) erkannt. Die Toll-like-Rezeptoren (TLR) sind eine wichtige Gruppe dieser PRRs und lösen je nach Art und Menge des Pathogens unterschiedliche Signalkaskaden aus, die unter anderem zu einer Komplement-Aktivierung, zur Apoptoseinduktion oder zu einer Aktivierung inflammatorischer Signalwege führen können. So induziert die Bindung von bakteriellem LPS an den TLR4 die Produktion von IL-12 und unterstützt damit die Entwicklung von einer TH-1 gerichteten Immunantwort (KAPSENBERG 2003). Hingegen lösen Proteoglykane bei humanen MoDC eine Aktivierung von TLR2 aus und führen so zu hohen Leveln an IL-10 (RE u. STROMINGER 2001). Der TLR7 wird von Imiquimod, einer Verbindung der Imidazoquinolin-Familie, gebunden und unterstützt die Entwicklung einer TH1-Antwort über die Produktion von IL-12 und IFNα (HEMMI et al. 2002; ITO et al. 2002).
2.3
Sphingosin-1-Phosphat
Das körpereigene Lipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) verdankt diesen Namen seinem Entdecker Tuchidum, der es aufgrund seiner rätselhaften Struktur nach der Sphinx, einer griechischen mythologisches Kreatur benannt hat (THUCHIDUM 1884). Gut hundert Jahre später, mit der Entdeckung, dass S1P als eigenständiger Mediator fungiert und das Zellwachstum beeinflussen kann (ZHANG et al. 1991), stieg das Interesse an diesem Lipid schlagartig an. Heute ist bekannt, dass S1P sowohl als intrazellulärer Mediator, als auch über fünf G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) seine Wirkung entfaltet und zahlreiche zelluläre Prozesse, wie zum Beispiel die Proliferation, Differenzierung, Migration und Morphogenese beeinflussen kann.
2.3.1 Biosynthese und Abbau von S1P
Den Ausgangspunkt für die Synthese von S1P markiert das Ceramid. Ceramide entstehen zum einen durch die Hydrolyse von Shingomyelin, eines Membran-Lipids und zum anderen durch die De-novo-Biosythese im endoplasmatischen Retikulum.
Eingeleitet wird die De-novo-Sythese durch die Kondensation von Serin und Palmitoyl-CoA zu Ketosphinganin über das Enzym Serin-Palmitoyl-Transferase
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(HANNUN et al. 2001). Nach weiteren drei Reaktionsschritten über Sphinganin und Dyhydroceramid ensteht dann das Ceramid. Der andere und weitaus häufigere Syntheseweg ist die Hydrolyse von Sphingomyelin zum Ceramid. Dies wird durch die Sphingomyelinase katalysiert, welche durch zahlreiche Faktoren, wie zum Beispiel Strahlung, proinflammatorische Zytokine und Wachstumsfaktoren aktiviert werden kann (KOLESNICK u. HANNUN 1999). Aktuell sind fünf verschiedene Sphingosinmyelinasen identifiziert, welche basierend auf ihrem pH-Optimum, der zellulären Lokalisation und der Kationenabhängigkeit voneinander unterschieden werden (LEVADE u. JAFFREZOU 1999). Die gebildeten Ceramide, denen neben ihren strukturellen Funktionen auch eine wichtige Rolle in Differenzierungsprozessen, wie die Hemmung des Zellwachstums und die Induktion zur Apoptose nachgewiesen werden konnten (HANNUN et al. 2001), können anschließend über die Ceramidase zu Sphingosin weiter synthetisiert werden. Sphingosin bildet das Grundgerüst für das S1P. Über die Sphingosinkinase (SphK) von der zwei Isophormen bekannt sind (LIU et al. 2002), wird das Sphingosin zu S1P phosphoryliert. Sphingosinkinasen sind ubiquitär im Organismus vorhanden, wobei die SphK1 gehäuft in Lunge, Milz und Leber auftritt, währen die SphK2 überwiegend in Leber und Herz exprimiert ist (LE STUNFF et al. 2004). Die Degradierung von S1P kann über zwei verschiedene Reaktionsschritte verlaufen: Entweder über die reversible Dephosphorylierung durch die S1P-Phophatase zurück zum Sphingosin oder weitaus häufiger über die irreversible Spaltung an der C2-C3 Bindung durch die S1P-Lyase, wodurch Hexadecanal und Phosphoethanolamin entstehen (siehe Abbildung 2-5) (SPIEGEL u. MILSTIEN 2003). Die S1P-Lyase wird bis auf eine Ausnahme ebenfalls überall im Organismus exprimiert. Thrombozyten enthalten dieses Enzym nicht und weisen deshalb auch einen erhöhten Gehalt an S1P auf (YATOMI et al. 1997). Das Wechselspiel zwischen Sphingosinkinasen und der S1P-Lyase sorgen für die Regulation des S1P Haushalts im Organismus.
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Abbildung 2-5: Synthese und Degradation von Sphingosin-1-Phosphat (S1P) (SPIEGEL u.
MILSTIEN 2003)
Aufgrund der weiten Verteilung der katalysierenden Enzyme ist auch das S1P ubiquitär im Organismus vorhanden, wobei die jeweiligen Konzentrationen in den unterschiedlichen Körperkompartimenten um den Faktor 100 variieren. So befindet sich im Blut die höchste Konzentration von S1P in micromolaren Bereichen, überwiegend gebunden an high-density-lipoprotein (HDL) und Albumin (RUWISCH et al. 2001). In den Lymphgefäßen beträgt die Konzentration lediglich ¼ der im Blut vorhandenen Konzentration und im Gewebe werden nur noch Konzentrationen in nanomolarer Größenordnung erreicht (HLA et al. 2008). Dieser Konzentrationsgradient ist für den Ablauf von immunologischen Prozessen von entscheidender Bedeutung, da S1P unter anderem chemotaktisch auf die Emigration von Lymphozyten aus dem Lymphknoten wirkt (MATLOUBIAN et al. 2004).
Hauptspeicher im Blut bilden die hämatopoetischen Stammzellen, wobei die Thrombozyten das höchste Vorkommen an S1P besitzen, was durch die bereits erwähnte fehlende S1P-Lyase zu erklären ist (YANG et al. 1999).
2.3.2 S1P-Rezeptoren
Neben seinen intrazellulären Funktionen als second messenger, bei denen S1P einen Einfluss auf die Kalzium-Homeostase (MEYER ZU HERINGDORF et al. 1999) sowie antiapoptotische Effekte zeigen kann (CUVILLIER et al. 1996), wirkt S1P über
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G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von denen bis heute fünf identifiziert werden konnten, namentlich S1PR1/EDG1, S1PR2/EDG5, S1PR3/EDG3, S1PR4/EDG4, S1PR5/EDG8.
Erstmals kloniert wurde der EDG1 aus Endothelzellen der Nabelschnur. Die ursprüngliche Nomenklatur der Rezeptoren leitet sich von der damals entdeckten Wirkung des Rezeptors auf Differenzierungsprozesse von Endothelzellen ab (endothelial differentiation gene) (HLA u. MACIAG 1990). Zur Zeit ihrer Entdeckung wusste man jedoch noch nichts über die Agonisten dieser Rezeptoren. 1998 konnten LEE et al. erstmals nachweisen, dass S1P mit hoher Affinität an den EDG1 Rezeptor bindet, woraufhin die Nomenklatur angepasst wurde.
Während der S1PR4 nur in Lymphknoten, Milz, Thymus sowie der Lunge exprimiert ist und der S1PR5 in Gehirn, Haut und Milz nachzuweisen ist, sind die Rezeptoren S1PR1, S1PR2 und S1PR3 ubiquitär im Organismus verteilt (ANLIKER u. CHUN 2004).
Die pleiotropen Effekte der Rezeptoren sind neben ihrem Verteilungsmuster auch durch die unterschiedlichen Signalkaskaden nach ihrer Aktivierung zu erklären (siehe Abbildung 2-6).
Abbildung 2-6: Signalkaskaden der S1P-Rezeptoren (SANCHEZ u. HLA 2004)
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So führt der S1PR1 zu einer Aktivierung der extrazellulären Signal- Regulationskinase (ERK), der Phospholipase C (PLC) und zu einer Inhibition der Adenylatcyclase (AC) über den Pertussintoxin sensitiven Gi. Ebenfalls kommt es zu einer Phosphorylierung der Proteinkinase Akt, was wiederum nachgeschaltet zu einer Rac-Aktivierung führt. Rac und Rho sind Unterfamilien der Rho-GTPasen und leiten ausgehend von den Rezeptoren Signale zu den Effektoren weiter und können so verschiedene Zellfunktionen, wie beispielsweise die Organisation des Zytoskeletts, Zelladhäsion und Zellmigration beeinflussen (JAFFE u. HALL 2005).
Der S1PR2 ebenso wie der S1PR3 agieren neben dem Gi und G12/13 auch über den Pertussintoxin insensitiven Gq, wobei der S1PR2 stärker über G12/13 wirkt und der S1PR3 eine höhere Stimulation auf den Gq ausübt. Bei S1PR2 kommt es zu einer Aktivierung von ERK und PLC und beim S1PR3 noch zusätzlich zu einer Inhibition der AC.
Bei allen drei Rezeptoren kommt es neben der Aktivierung von Rho, über die Aktivierung der Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) auch zu einer Aktivierung von Rac.
Allerdings konnte auch gezeigt werden, dass der S1PR2 zu einer Blockade von Rac führt und dadurch die Zellmotilität gehemmt werden kann (OKAMOTO et al. 2000).
Eine wichtige Rolle des S1PR1 für die vaskuläre Entwicklung konnte mithilfe von Knockout Mäusen gezeigt werden. So führte das Ausschalten des S1PR1 zu starken Blutungen, was den intrauterinen Tod der Embryonen zwischen Tag 12,5 und 14,5 zur Folge hatte. Grund der Blutungen war die gestörte Migration der glatten Muskelzellen zu den Gefäßwänden (LIU et al. 2000).
S1PR2- und S1PR3-Knockout Mäuse zeigten keine Defekte und entwickelten sich normal (ISHII et al. 2001; ISHII et al. 2002). Jedoch führte die gleichzeitige Ausschaltung beider Rezeptoren zu einer deutlichen Verkleinerung der Wurfgröße im Vergleich zu Kontrolltieren. Weiterhin zeigten die Tiere eine geringere Überlebensrate, obwohl die Tiere, die überlebt haben, keine phänotypischen Veränderungen aufwiesen (ISHII et al. 2002).
Der S1PR4 aktiviert ERK, PLC und AC über einen Pertussin Toxin sensitiven Weg.
Außerdem kommt es zu einer Aktivierung von Cdc42, welches ebenfalls ein Mitglied
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der Rho-GTPasen Familie ist. Diese Aktivierung führt nachfolgend zu einer Beeinflussung der Zellmotilität (KOHNO et al. 2003).
Der S1PR5 führt über Gi und G12/13 zu einer Inhibition der AC und ERK und zu einer Aktivierung von c-jun N-terminal kinase (JNK). Über diese Signalwege konnte eine Inhibition der Akkumulation von cAMP sowie ein antiproliferativer Effekt auf CHO- Zellen (Chinese hamster ovary cells) nachgewiesen werden (MALEK et al. 2001).
2.3.3 Effekte von S1P auf epidermale Zellen
Neuere Erkenntnisse zeigen, dass S1P eine essentielle Rolle als bioaktives Molekül in der Modulation von epidermalen Zellen zukommt. So ist S1P ein potenter Inhibitor von Zellwachstum in humanen Keratinozyten. Jedoch führt S1P nicht zur Apoptose der Keratinozyten (MANGGAU et al. 2001), sondern induziert ihre Differenzierung (VOGLER et al. 2003). So kommt es durch S1P über den S1PR3 zu einem Kalziumanstieg in der Zelle (LICHTE et al. 2008). Außerdem wurde die Proteinkinase Akt als ein wichtiger Signalweg identifiziert. Akt ist eine Serin-Threonin-Kinase, die zahlreiche zelluläre Signalwege, wie die Proliferation, Apoptose oder Steuerung der Transkription reguliert. S1P ist in der Lage über die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) und einer daraus folgenden Dephosphorylierung von Akt, die Proliferation humaner Kertinozyten zu hemmen (SCHUPPEL et al. 2008). Humane Keratinozyten exprimieren alle fünf S1P-Rezeptoren (VOGLER et al. 2003), jedoch wird die Akt Dephosphorylierung durch S1P nur über den S1PR2 vermittelt, was zu der Annahme führt, dass dieser Rezeptorsubtyp für die Modulation des Zellwachstums von humanen Keratinozyten verantwortlich ist (SCHUPPEL et al. 2008). Diese Daten wurden von einer anderen Studie unterstrichen, die in einem hyperproliferativen In- vivo-Modell ebenfalls eine antiproliferative Wirkung von topisch verabreichten S1P nachweisen konnte (HONG et al. 2008).
2.3.4 Effekte von S1P auf Immunzellen
Abgesehen vom Einfluss von S1P auf die Proliferation gibt es verschiedene Studien, die sich mit direkten Effekten von S1P und S1P-Agonisten bei Entzündung und
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Immunmodulation beschäftigen (RIVERA et al. 2008). Eine wichtige Rolle spielt hierbei das gerichtete Wanderverhalten von Zellen. So hat S1P einen großen Einfluss auf das Homing und die Ausschleusung von T-Lymphozyten aus dem Lymphknoten (YOPP et al. 2005; SCHWAB u. CYSTER 2007). Da die Konzentration von S1P im Lymphknoten deutlich geringer ist als in den abführenden Lymphgefäßen besteht ein Konzentrationsgradient zugunsten der Lymphe. Über den S1PR1, der auf den T-Lymphozyten exprimiert ist, kommt es daraufhin zu einer chemotaktischen Ausschleusung der Zellen aus dem Lymphknoten. Die Rolle des S1PR1 wurde ebenfalls durch eine Untersuchung an Knockout-Mäusen deutlich, bei denen der S1PR1 auf den haematopoetischen Zellen fehlte. Bei diesen Mäusen konnten keine T-Zellen in der Peripherie nachgewiesen werden, weil die reifen T-Zellen nicht in der Lage waren aus dem Thymus zu emigrieren (MATLOUBIAN et al. 2004). Kommt es nun zu einem Anstieg der S1P-Konzentration im Lymphknoten, zum Beispiel hervorgerufen durch eine Inhibition der S1P-Lyase oder durch Vorhandensein eines S1P1R-Analogons wie FTY720, kann der T-Zell-Austritt aus dem Lymphknoten durch unterschiedliche Mechanismen blockiert sein. Eine Erklärung ist die Auflösung des S1P-Gradienten, ein anderer Grund kann die Internalisierung des Rezeptors sein (RIVERA et al. 2008).
Auch auf die Migration von DC hat S1P einen Einfluss. So konnte in In-vitro- Versuchen gezeigt werden, dass S1P einen chemotaktischen Einfluss auf humane sowie murine DC aufweist (RENKL et al. 2004) und dass dieser Einfluss über die Rezeptorsubtypen 1 und 3 vermittelt wird (CZELOTH et al. 2005; REINES et al.
2009; SCHRODER et al. 2011). In-vivo-Daten eines Mausmodells der allergischen Dermatitis konnten dieses Ergebnis bestätigen, da hier eine Behandlung mit S1P zu einer signifikanten Inhibition der Migration der Langerhanszellen von der Epidermis zum Lymphknoten führte (REINES et al. 2009).
Zusätzlich zu der chemotaktischen Wirkung haben S1PR-Agonisten auch einen Einfluss auf das Zytokinprofil von Immunzellen. Werden humane DC während ihrer Entwicklung durch LPS mit S1P behandelt, werden proinflammatorische Zytokine, wie das IL-12 gehemmt, während es gleichzeitig zu einer Erhöhung des antiinflammatorischen IL-10 kommt. Dadurch wird die Initiation einer T-Helfer 1 (TH1)-
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Antwort verhindert und eine TH2-Antwort von naiven CD4+-Zellen gefördert (IDZKO et al. 2002). Weiterhin reduzieren S1P-Agonisten die Homeostase, ebenso wie die T- Zell-Rezeptor-vermittelte Proliferation und Zytokinproduktion (DORSAM et al. 2003).
So moduliert S1P über den S1PR4 direkt die Zytokinsekretion von T-Zellen. Es kommt zu einer Herunterregulation der proinflammatorischen Zytokine IL-2, IL-4 und IFN-y sowie zu einer Hochregulation von IL-10 (WANG et al. 2005). Außerdem hat eine langfristige Applikation von FTY720 zumindest zum Teil für die Induktion von FoxP3 in naiven T-Zellen geführt, wodurch T-Zellen mit einem regulatorischen Phänotyp induziert wurden (DANIEL et al. 2007). Dem widerspricht allerdings eine 2009 publizierte Studie, in welcher FTY720 die Regulation der T- Helferzellproliferation gehemmt hat (WOLF et al. 2009). Zusätzlich können S1P- Agonisten unter bestimmten Umständen zu einem TH17 Phänotyp führen (LIAO et al.
2007). Diese teils widersprüchlichen Daten bezüglich der pro- und antiinflammatorischen Wirkung von S1P könnten in den unterschiedlichen Versuchsdesigns begründet liegen, die hinsichtlich Modell und Dauer des Versuches sowie Zytokinmilieu divergieren.
Auch bei Makrophagen, welche die Rezeptoren S1PR1 und S1PR2 exprimieren, zeigt S1P einen vorwiegend antiinflammatorischen Effekt durch merklich verminderte Produktion der proinflammatorischen Zytokine TNFα, IL-6, IL-12 und CCL2 nach ihrer Aktivierung durch beispielsweise LPS (NOFER et al. 2007; HUGHES et al.
2008).
Weiterhin übt S1P einen antiapoptotischen Effekt auf Lymphozyten aus, indem es die Expression des proapoptotischen mitochondialen protein BAX (B cell lymphoma-2- associated X protein) und bestimmte Kaspasen inhibiert (CUVILLIER et al. 1996;
GOETZL et al. 1999).
In der Tabelle 2-2 sind die nachgewiesenen dominanten Effekte der S1P-Rezeptoren auf verschiedene Immunzellen noch einmal zusammengefasst dargestellt.
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Tabelle 2-2: Expression der S1P-Rezeptoren und ihre nachgewiesenen dominanten Effekte auf Immunzellen (VON WENCKSTERN et al. 2006)
Rezeptor T-Zellen B-Zellen DC Makrophagen Mastzellen
S1PR1 +
Chemotaxis ↑
+ Chemotaxis ↑
+ Chemotaxis ↑
+ Chemotaxis ↑
+ Chemotaxis ↑
S1PR2 - - +
Chemotaxis ↓ +
+ Chemotaxis↓
Degranulation
↑
S1PR3 - (+) +
Chemotaxis ↑ + -
S1PR4
+ IL-10 ↑
IL-2↓, IL-4↓, INFy↓
+ + + -
S1PR5 - - - - -
+ exprimiert, - nicht exprimiert, (+) auf bestimmten Subtypen exprimiert
2.3.5 S1P-Strukturanalogon FTY720
FTY720 (2-amino-2-(2-[4-octylphenyl]ethyl)-1,3-propanediol) wurde erstmals 1994 durch die Modifikation der natürlichen Substanz Myriocin synthetisch hergestellt (FUJITA et al. 1994). Die immunsuppressive Wirkung von Myriocin, ein Metabolit des Schlauchpilzes (Asomyceten) Isaria sinclarii, wurde bei einem Screening biologischer Substanzen erkannt (FUJITA et al. 1996). Jedoch beeinflusst FTY720 im Gegensatz zum Myriocin nicht die T-Zell-Proliferation und T-Zell-Aktivierung, sondern hemmt den Austritt von Lymphozyten aus den lymphatischen Organen (BRINKMANN et al.
2000). Mit der Entdeckung, dass FTY720 über die S1P-Rezeptoren seine Wirkung entfaltet, wurde überhaupt erst die Bedeutung von S1P in der Immunzellregulation erkannt (VON WENCKSTERN et al. 2006). FTY720, das dem S1P strukturell sehr ähnlich ist (siehe Abbildung 2-7), wird in vivo über den Sphingosin-Kreislauf zu FTY720-Phosphat phosphoryliert.
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Abbildung 2-7: Strukturformeln von Sphingosin, S1P, FTY720 und FTY720P (BRINKMANN u.
LYNCH 2002)
Dies geschieht über die Sphingosinkinasen 1 und 2, wobei der SphK2 eine bedeutendere Rolle zugesprochen wird (BILLICH et al. 2003). Die phosphorylierte Form agiert dann als Agonist für vier der fünf G-Protein-gekoppelten S1P- Rezeptoren (S1PR1, S1PR3, S1PR4, S1PR5) (BRINKMANN u. LYNCH 2002).
Dabei führt FTY720 am S1PR1 zu einer lang anhaltenden Internalisierung (GRALER u. GOETZL 2004), wobei es zu einer funktionell antagonistischen Wirkungsweise kommt. Den Grund für die Diskrepanz zu der Wirkung von S1P könnte in dem unterschiedlichen Abbau der beiden Substanzen begründet liegen. So wird FTY720P ausschließlich über die S1P-Phosphatase degradiert und nicht wie S1P auch über die S1P-Lyase (BANDHUVULA et al. 2005). Die andauernde Internalisierung des Rezeptors löst eine Lymphopenie aus, die in einer reversiblen Umverteilung der Lymphozyten resultiert. So werden die Lymphozyten nach Antigenpräsentation der DC am Austritt aus dem Lymphknoten heraus, der durch S1P-Signale vermittelt wird, gehindert (MATLOUBIAN et al. 2004). Jedoch kommt es nicht, wie bei vielen anderen Immunsuppressiva zu einer generalisierten Immunsuppression (BRINKMANN et al. 2000), weshalb FTY720 eine vielversprechende Option zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen darstellt. So konnte im Modell der autoimmunen Encephalitis der Multiplen Sklerose ein reduziertes Fortschreiten der
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akuten sowie chronisch-rezidiven Form beobachtet werden (BRINKMANN u. LYNCH 2002). Nach klinischen Studien zur Behandlung der Multiplen Sklerose (KILLESTEIN et al. 2011) befindet sich FTY720 mit dem Handelsnamen Gylenia für dieses Indikationsgebiet seit März 2011 auf dem Arzneimittelmarkt. Zusätzlich zu dem Effekt auf die Lymphozytenmigration zeigt FTY720 auch auf die Interaktion von T-Zellen und DC einen Einfluss. Eine Behandlung mit FTY720 bei humanen DC resultiert in einer reduzierten IL-12-Produktion sowie im Gegenzug zu einer gesteigerten IL-10- Sekretion, was zur Induzierung einer verstärkten TH2-Zellantwort führen könnte (MULLER et al. 2005; RADEKE et al. 2005).
2.4 Psoriasis vulgaris
Die Psoriasis ist eine chronisch entzündliche Hautkrankheit, die circa 2 % der Bevölkerung betrifft (CHRISTOPHERS 2001). Man unterscheidet verschiedene Formen der Psoriasis aufgrund der unterschiedlichen Morphologie und Verteilung der Einzelefflorenszenzen, der Dynamik des Auftretens beziehungsweise ihrer Persistenz (GOLLNICK u. BONNEKOH 2001). Die mit Abstand am häufigsten vorkommende Form mit circa 90 % ist die Psoriasis vulgaris oder auch Schuppenflechte (GRIFFITHS u. BARKER 2007). Diese Unterform der Psoriasis lässt sich wiederum in zwei Typen einteilen. Mit einer Häufigkeit von ungefähr 75 % kommt es zum Typ 1, der sich bei Personen unter 40 Jahren manifestiert und dem eine familiäre Häufung nachgewiesen werden konnte. So weisen die Träger der Allele bestimmter Human Leukocytes Antigens (HLA) (HLA-B13, -B57, -Cw6 und - DR7) auf eine deutliche erhöhte Assoziation für das Auftreten der psoriatischen Erkrankung hin (BARKER 2001). Der Typ 2, welcher sich bei Personen über 40 Jahren zum ersten Mal zeigt, ist klinisch schwächer ausgeprägt, tritt mit einer Häufigkeit von circa 25 % auf und zeigt keine genetische Disposition.
2.4.1 Histopathologische Charakteristika der Psoriasis vulgaris
Klinisch charakteristisch für die Psoriasis vulgaris sind die erythematösen, schuppigen, teils silbrig glänzenden Plaques, die über den gesamten Körper verteilt
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sein können, jedoch häufig in Bereichen der Ellenbogen und Knie vorkommen.
Grund für dieses klinische Bild ist eine Hyperproliferation und Fehldifferenzierung der Keratinozyten. Durch die stark gesteigerte Mitoserate findet die physiologischerweise vier Wochen andauernde Differenzierung der Hautzellen vom Stratum basale zum Stratum corneum in nur wenigen Tagen statt und ist somit um einen Faktor von ungefähr 7 beschleunigt. Dabei kommt es unter anderem zu einer Retention des Zellkerns im Stratum corneum mit Verlust des Stratum granulosoms (Parakeratose), zu einer Reduktion von Fillagrin und zu einer Überexpression der Proliferationskeratine K6, K16 und K17 (GOLLNICK u. BONNEKOH 2001). Des Weiteren histologisch in der Haut nachzuweisen sind die verlängerten Reteleiste, eine fokale Spongiose und eine erhöhte Anzahl von Entzündungszellen, hauptsächlich bestehend aus T-Zellen, DC, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten (siehe Abbildung 2-8). Letztere können sich zu sogenannten Munro- Mikroabzessen zusammenschließen. Die Röte der Läsionen kann durch eine gesteigerte Anzahl an Kapillaren erklärt werden (LOWES et al. 2007; NESTLE et al.
2009).
Abbildung 2-8: Histologischer Schnitt eines Plaques in psoriatischer Haut
Zu sehen ist eine epidermale Hyperplasie mit Bereichen von Parakeratose (Pfeil), leichter Spongiosis und eine lymphozytäre Infiltration mit vaskulärer Ektasie (MURPHY et al. 2007)
39 2.4.2 Ätiopathogenese
Bis zum heutigen Tage nicht vollständig geklärt ist die Ätiopathogenese der Psoriasis. Unumstritten ist, dass es sich bei dieser Erkrankung um ein multifaktorielles Geschehen handelt, bei dem ein genetischer Zusammenhang nachgewiesen werden konnte. Diskutiert wird aber bis heute, was initial zum Ausbruch der Erkrankung führt. Während erste Standpunkte davon ausgegangen sind, dass epidermale Keratinozyten als Primärzellen in der Entstehung der Erkrankung eine ausschlaggebende Rolle spielen, so sind sich gegenwärtig viele Wissenschaftler einig, dass es sich um eine T-Zell-vermittelte, autoimmunologische Hautkrankheit handelt (NICKOLOFF et al. 2007; NESTLE et al. 2009). Unterstrichen wird diese Hypothese durch die positiven Therapieerfolge von immunsupressiv modulierenden Medikamenten wie das Cyclosporin oder Biologica (GRIFFITHS u.
VOORHEES 1990; HODULIK u. HADI 2006). Neueste Ansätze einer Therapiemöglichkeit stellen Antikörper gegen IL-12 und IL-23 dar (LEONARDI et al.
2008).
Prädisponierende Faktoren für die Entstehung der Erkrankung sind neben der nachgewiesenen genetischen Disposition auch Faktoren wie Stress, Medikamente, Traumata (Köbner Phänomen) und Mikroorganismen. So konnte ein Bezug zwischen beta-hämolysierenden Streptokokken der Gruppe A und der Psoriasis guttata nachgewiesen werden, bei der es durch die Wirkung eines Superantigens zu einer T- Zell-Aktivierung mit nachgeschalteter Expansion kommt (LEUNG et al. 1995). Eine andere Theorie befasst sich mit der Rolle von Autoantigenen. So wurde bereits vor über 20 Jahren die Expression von Keratin K17 als eine Besonderheit in psoriatischen Plaques erkannt (DE JONG et al. 1991), welches als Epitop als eine mögliche Hauptzielstruktur autoreaktiver T-Lymphozyten beschrieben wurde (GUDMUNDSDOTTIR et al. 1999). Auch das körpereigene antimikrobielle Peptid LL37, was in der Haut von Psoriasispatienten überexprimiert ist, soll ein potenter Trigger von plasmazytoiden DC sein. Diese reagieren wiederum mit der Bildung des proinflammatorischen Zytokins IFN-α (TONEL u. CONRAD 2009).
Weitere Zytokine, die die Proliferation und Differenzierung von T-Zellen und damit die Entzündungsreaktion beeinflussen, sind das IL-12 und das IL-23 (GOLLNICK u.
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BONNEKOH 2001), wobei insbesondere dem IL-23 eine tragende Rolle in der Pathogenese der Psoriasis zugeschrieben wird (IWAKURA u. ISHIGAME 2006;
WILSON et al. 2007). Diese Zytokine werden in hoher Konzentration von dermalen DC sezerniert, denen eine Schlüsselrolle im entzündlichen Prozess der Psoriasis zugesprochen wird (NESTLE et al. 2009). An dieser Stelle kann auch eine Interaktion zwischen den DC und Keratinozyten beobachtet werden, da die Keratinozyten durch Sekretion proinflammatorischer Zytokine (wie z.B. IL-6, IL-8, TNFα) auch einen direkten Einfluss auf die Maturation von DC haben können (ARMSTRONG et al.
2011). Durch den Stimulus dieser entzündungsfördernden Zytokine kommt es überwiegend zu einer TH1-, beziehungsweise TH17-gerichteten Zellantwort. Ein besonderes Augenmerk ist hier auf die TH17-Zellen zu legen, die nach neuesten Erkenntnissen eine bedeutende Rolle bei chronischen Entzündungskrankheiten spielen und in der Haut bei Psoriasispatienten in erhöhter Anzahl vorzufinden sind (LOWES et al. 2008; L. STEINMAN 2008). Diese Zellen sezernieren ihrerseits proinflammatorische Zytokine, wie das IL-17 und das IL-22, welche wiederum eine gesteigerte Keratinozytenproliferation, Zytokin- und Chemokinproduktion induzieren (TEUNISSEN et al. 1998; ZHENG et al. 2007).
2.4.3 Tiermodelle der Psoriasis
Da Psoriasis eine Erkrankung des Menschen ist, gestaltet es sich trotz intensiver Forschung gegenwärtig noch immer als schwierig, ein passendes Tiermodell zu finden, mit dem man die Pathogenese der Erkrankung näher untersuchen kann und um potentiell wirksame Medikamente zu testen. Grundsätzlich kann man die bisher etablierten In-vivo-Modelle in drei Gruppen einteilen: Spontane Mutationen, gentechnisch veränderte Mäuse und Xenottransplantation (NESTLE et al. 2009).
Das erste beschriebene Modell basiert auf einer spontanen Mutation in Mäusen, die mit einem mehr oder weniger psoriatischen Phänotyp assoziiert ist (GATES u.
KARASEK 1965). Bei den gentechnisch veränderten Mäusen werden unterschiedliche Zytokine, wie zum Beispiel IL-12 und IL-23, Chemokine, Wachstumsfaktoren wie TGF-α und weitere Mediatoren hinsichtlich ihrer Rolle bei der Pathogenese hyperproliferativer Hautentzündungen untersucht (VASSAR u.