Inhaltsverzeichnis
Vorveröffentlichungen der Dissertation...
Danksagung...
Widmung...
Inhaltsverzeichnis... I Tabellenverzeichnis... XI Abbildungsverzeichnis...VIII Abkürzungsverzeichnis ... X
I. Einleitung... 1
1.1 Der Kulturapfel (Malus x domestica)... 1
1.1.1 Die Kernobstgewächse (Malinae)... 1
1.1.2 Phylogenie und Bedeutung des Apfels...2
1.2 Pathogene des Apfels...3
1.2.1 Feuerbrand...3
1.2.2 Weitere Apfelkrankheiten... 6
1.3 Pflanzliche Pathogenabwehr... 7
1.3.1 Primäre Verteidigung durch Phytoanticipine... 7
1.3.2 Sekundäre Verteidigung durch Phytoalexine...8
1.3.3 Phytoalexine der Malinae...9
I. 4 Biosynthese der Phytoalexine in Malinae... 10
I.5 Zielsetzung... 12
II. Material... 13
11.1 Biologisches Material... 13
II. 1.1 Bakterienstämme... 13
11.1.2 Pflanzliches Material... 13
11.2 Chemikalien und Reagenzien... 14
11.3 Lösungen, Puffer und Nährmedien... 18
11.3.1 Lösungen und Puffer... 18
11.3.2 Nährmedien... 23
II. 4 Molekularbiologisches Material...26
11.4.1 Enzyme...26
11.4.2 Plasmide...27
11.4.3 Primer... 28
11.4.4 Kits... 29
II. 5 Geräte...29
II. 6 Software, Online-Tools und Datenbanken...32
III Methoden 34
II 1.1 Kultivierungsmethoden... ... 34
III.1.1 Kultivierung und Lagerung von Bakterienkulturen... 34
III. 1.1.1 Kultivierung von Escherichia coli...34
111.1.1.2 Kultivierung von Agrobakterien... 34
111.1.1.3 Kultivierung von und Inokulation mit Erwinia amylovora... 34
111.1.1.4 Herstellung von Glycerolkulturen... 35
111.1.2 Kultivierung von Pflanzenmaterial... 35
111.1.2.1 Kultivierung von Kalluskulturen... 35
111.1.2.2 Kultivierung von Zellsuspensionskulturen...35
111.1.2.3 Kultivierung von in wfro-Sprosskulturen...35
111.1.2.4 Kultivierung von sterilen Sämlingen...36
111.1.2.5 Kultivierung von Apfelpflanzen ex vitro...36
III.1.2.6 Kultivierung von Nicotiana benthamiana... 36
III.2 Molekularbiologische Methode...37
III.2.1 GUS-Färbung...37
III.2.2 Isolation von Nukleinsäuren...37
111.2.2.1 Plasmidisolation aus E. coli... 37
111.2.2.2 Isolation von Gesamt-DNA aus Agrobakterien...38
111.2.2.3 Isolation von RNA aus pflanzlichem Gewebe...39
111.2.2.4 Isolation von genomischer DNA aus pflanzlichem Gewebe....39
111.2.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren... 40
111.2.4 Reverse Transkription... 40
111.2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)...41
111.2.6 RT-PCR für Expressionsanalysen... 44
111.2.7 Extraktion von DNA aus Agarosegelen...44
111.2.8 DNA-Agarosegelelektrophorese...45
111.2.9 Klonieren... 45
111.2.9.1 Klonieren über Restriktion und Ligation... 45
111.2.9.2 Klonieren mit dem Gateway™-System...47
II 1.2.10 Sequenzierung von DNA-Sequenzen... 49
II 1.2.11 Transformation von Bakterien... 49
111.2.11.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli... 49
111.2.11.2 Transformation chemisch kompetenter E. c o li... 50
111.2.11.3 Herstellung elektrokompetenter Agrobakterien... 50
II 1.2.11.4 Transformation elektrokompetenter Agrobakterien... 50
111.2.12 Transformation von Pflanzen...51
111.2.12.1 Transformation über Agrobakterieninfiltration...51
II 1.2.12.2 Transfonmation mittels Partikelkanone... 52
II 1.2.13 Überexpression rekombinanter Proteine aus E. coli... 54
111.2.14 Isolation von Protein aus Pflanzenmaterial... 54
111.2.15 Proteinkonzentrationsbestimmung... 55
Hl.2.15.1 BCA-Assay...55
111.2.15.2 Bradford-Assay... 55
111.2.16 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)... 56
111.2.17 Western-Blot... 57
111.2.17.1 Blotten mit dem Tankblot... 57
111.2.17.2 Antikörperbehandlung und Detektion...57
111.2.17.3 Dot-Blot... 58
111.2.18 Immunfluoreszenz... 58
Hl.2.18.1 Immunfluoreszenz in Zellkulturen... 58
111.2.18.2 Immunfluoreszenz in pflanzlichem Gewebe... 59
111.2.19 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie... 60
III. 3 Analytische Methoden...61
III. 3.1 Extraktion von Phytoalexinen aus pflanzlichem Material... 61
111.3.1.1 Extraktion von Phytoalexinen aus Zellsuspensionskulturen. 61 111.3.1.2 Extraktion von Phytoalexinen aus Apfelwurzeln... 61
111.3.1.3 Extraktion von Phytoalexinen aus Apfelstämmen... 62
111.3.2 Biofraktionierung über Kieselgelsäule... 63
111.3.3 HPLC... 63
Ml.3.3.1 Analytische HPLC... 64
111.3.3.2 Semipräparative HPLC... 65
111.3.4 LC/MS-MS... 65
111.3.5 GC/MS-MS...66
111.3.6 Dünnschichtchromatographie...67
111.3.7 FPLC...68
IV Ergebnisse...70
IV. 1 Expressionsanalysen... 70
IV. 1.1 Expressionsanalysen RNA-Ebene... 70
IV. 1.1.1 Optimierung der Primerspezifität...70
IV. 1.1.2 Expressionsanalyse im Kultivar 'Holsteiner Cox'... 71
IV.1.1.3 Expressionsanalyse im Kultivar 'Golden Delicious'...72
IV. 1.1.4 Expressionsanalyse im Kultivar 'Schöner aus Boskoop'... 72
IV. 1.2 Expressionsanalysen infizierter Apfelpflanzen auf Protein-Ebene... 73
IV.2 Lokalisation... 74
IV.2.1 Immunfluoreszenz... 74
IV.2.1.1 Herstellung eines Antikörpers gegen die OMT1... 74
IV.2.1.2 Immunfluoreszenz in infizierten Apfelstämmen... 76
IV.2.1.3 Immunfluoreszenz in Zellsuspensionskulturen... 76
IV.2.2 Reporter Studien... 78
IV.2.2.1 Klonierung der Reporterkonstrukte... 79
IV.2.2.2 Lokalisation über Agrobakterieninfiltration... 79
IV.2.2.3 Transformation mittels Partikelkanone...81
IV.2.3 Promoterstudien... 90
IV.2.3.1 Untersuchung stabil transformierter Apfelpflanzen... 90
IV.2.3.2 Klonierung des Promoterkonstrukts... 91
IV.3 Identifikation eines Apfelbakterizids... 92
IV.3.1 Biofraktionierung... 93
IV.3.2 Fraktionierung über Kieselgelsäule...96
IV.3.2.1 Ermittlung der mobilen Phase über DC... 96
IV.3.2.2 Fraktionierung der fraktion 8+9...97
IV.3.3 Fraktionierung der Fraktion 34 über semipräparative HPLC... 98
IV.3.4 Untersuchungen zur Identifikation der aktiven Substanz...99
IV.3.4.1 Untersuchungen über LC/MS-MS... 99
IV.3.4.2 Untersuchungen über hochauflösende MS...101
IV.4 Phytochemische Analysen...101
IV.4.1 Analyse von Elicitor-behandelten Zellkulturen... 101
IV.4.2 Analysen von mit Feuerbrand infizierten Apfelpflanzen... 102
IV.4.2.1 Phytoalexinbildung in infizierten Apfelreisern... 102
IV.4.2.2 Phytoalexinbildung in einem infizierten Apfelbaum 'GD'...103
IV.4.3 Phytochemische Analyse von Wurzeln aus apfelmüden Boden... 103
IV.4.3.1 Analyse von hitzegetrockneten Wurzeln... 103
IV.4.3.2 Analyse von gefriergetrockneten Wurzeln...105
IV.4.3.3 Analyse der Kinetik der Phytoalexinbildung... 108
V Diskussion... 111
V.1 Phytoalexinbiosynthese im Zusammenhang mit Pathogenresistenz... 111
V.2 Lokalisation der Phytoalexinbiosynthese... 113
V.3 Bakterizide Inhaltsstoffe in Blattextrakten aus Apfel... 117
V. 4 Phytoalexinmuster in Wurzeln aus apfelmüden Böden... 119
VI Zusammenfassung... 122
Literaturverzeichnis... 124
Lebenslauf ...131
