Aus dem Institut für Pharmakologie
der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Der Einfluss von Palmitoleinsäure (C16:1) auf die PI3K/AKT/FOXO und ERK 1/2 (MAPK) Signalkaskaden im Kontext physiologischer
kardialer Hypertrophie
zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Sarah Julia Qaiyumi
Datum der Promotion: 03.12.2021
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... I Abbildungsverzeichnis ... IV Tabellenverzeichnis ... VI Abkürzungsverzeichnis ... VII Zusammenfassung ... X Abstract ... XI
1 Einleitung ... 1
1.1 Herzinsuffizienz ... 1
1.2 Pathologische und Physiologische kardiale Hypertrophie ... 4
1.2.1 Pathophysiologische Grundlagen kardialer Hypertrophie ... 4
1.2.2 Pathologische kardiale Hypertrophie ... 5
1.2.3 Physiologische kardiale Hypertrophie ... 7
1.3 Grundlagen des Lipidstoffwechsels im menschlichen Organismus ... 9
1.4 Fettsäuren im Kontext kardialer Hypertrophie ... 10
1.5 Palmitoleinsäure ... 12
1.5.1 Effekte von Palmitoleinsäure im metabolischen Kontext ... 14
1.5.2 Palmitoleinsäure im Kontext physiologischer kardialer Hypertrophie ... 16
1.6 Der IGF-1 Signalweg ... 21
1.6.1 Die PI3K-AKT Signaltransduktion ... 22
1.6.1.1 Die Proteinkinase AKT ... 23
1.6.2 Die FOXO-Transkriptionsfaktoren ... 24
1.6.2.1 Posttranslationale Regulation der FOXO-Transkriptionsfaktoren ... 25
1.7 Der MAPK-ERK Signalweg ... 27
2 Zielsetzung ... 29
3 Material ... 30
3.1 Verwendete Geräte... 30
3.2 Labormaterialien ... 31
3.3 Lösungen, Medien, Kits ... 32
3.4 Chemikalien und Substanzen ... 32
4 Methoden ... 38
4.1 Zellkulturtechniken ... 38
4.1.1 HL-1 Zelllinie ... 38
4.1.2 Kultivierung und Passagierung der HL-1 Zellen... 38
4.2 Stimulationsexperimente ... 39
4.2.1 Aussäen von HL-1 Zellen ... 39
4.2.2 Ansetzen von Fettsäuren und IGF-1 ... 40
4.2.3 Stimulation von HL-1 Zellen ... 40
4.2.4 Lyse der Zellen sowie Protein- und RNA- Isolation ... 41
4.3 Proteinbiochemische Methoden ... 41
4.3.1 Proteinisolation ... 41
4.3.2 Konzentrationsbestimmung der Proben ... 41
4.3.3 Herstellung der Gele... 43
4.3.4 Western Blotting ... 43
4.3.4.1 Vorbereitung der Proben ... 43
4.3.4.2 Gelelektrophorese ... 44
4.3.4.3 Transfer der Proteine... 44
4.3.4.4 Blocken der Membran ... 45
4.3.4.5 Auftragen des Erstantikörpers ... 45
4.3.4.6 Waschen der Membran und Auftragen des Zweitantikörpers ... 46
4.3.4.7 Dunkelkammerarbeit ... 46
4.3.4.8 Stripping der Membran ... 46
4.4 Immunfluoreszenz- Versuche ... 47
4.4.1 Durchführung des Immunfluoreszenz-Assays ... 47
4.4.2 Immunfluoreszenzmikroskopie ... 48
4.5 Real-Time PCR Versuche ... 48
4.5.1 RNA Präparation ... 49
4.5.2 cDNA Synthese ... 49
4.5.3 Durchführung der Real-Time PCR ... 50
4.5.4 Auswertung der Real-Time PCR ... 51
4.6 Statistische Berechnungen ... 53
5 Ergebnisse ... 54
5.1 Kontrollversuche p-AKT ... 54
5.2 Analyse der C16:1 vermittelten FOXO-Regulation auf Proteinebene ... 55
5.2.1 Screening auf die Beteiligung von FOXO am C16:1 Wirkmechanismus ... 55
5.2.1.1 p-FOXO1 Versuche ... 55
5.2.1.2 p-FOXO3a Versuche ... 57
5.2.2 Versuchsreihe zur Regulation der FOXO Stabilität ... 59
5.2.2.1 Gesamt FOXO1 ... 60
5.2.2.2 Gesamt FOXO3a ... 61
5.2.3 Zusammenfassung und Vergleich mit C16:0 und IGF-1 ... 62
5.3 FOXO Translokationsanalyse ... 64
5.4 Einfluss von C16:1 auf die FOXO-Zielgenexpression ... 65
5.4.1 Messung der MuRF1 und Atrogin-1 mRNA Expression ... 66
5.4.2 Messung der p21 mRNA-Menge ... 67
5.5 Einfluss von C16:1 auf die Regulation der ERK 1/2 Kinase ... 68
6 Diskussion ... 72
6.1 Palmitoleinsäure reguliert FOXO1 und FOXO3a an verschiedenen funktionellen Seitenketten mittels Phosphorylierung ... 72
6.1.1 Palmitoleinsäure bewirkt die funktionale Interaktion von AKT und FOXO im Kontext physiologischer kardialer Hypertrophie ... 75
6.2 Palmitoleinsäure steigert nach kurzfristigem Stimulationsintervall die zelluläre Gesamtproteinmenge an FOXO3a ... 76
6.3 Palmitoleinsäure reguliert die Stabilität von FOXO1 sowie FOXO3a ... 78
6.3.1 Vergleich des Effektes von IGF-1 und C16:1 auf die FOXO-Proteinstabilität ... 80
6.4 Palmitoleinsäure induziert die zytosolische Translokation von FOXO3a ... 81
6.5 Palmitoleinsäure hat keinerlei Einfluss auf die Genexpression der E3-Ubiquitin- Ligasen MuRF1 und Atrogin-1 (MAFbx) ... 83
6.6 Palmitoleinsäure induziert die Genexpression des FOXO3a-Zielgens p21 ... 85
6.7 Palmitoleinsäure reguliert den MAPK-Signalweg durch die Dephosphorylierung der ERK 1/2 Kinase ... 88
6.7.1 Interaktion des PI3K-AKT- mit dem MAPK-ERK Signalweg ... 89
6.7.2 Bedeutung der Dephosphorylierung von ERK 1/2 im Kontext kardialer Ischämie ... 90
6.7.3 C16:0 zeigt im Vergleich zu C16:1 keinerlei Auswirkung auf den Phosphorylierungsgrad der ERK 1/2 Kinase ... 91
6.8 Zusammenfassung und vorgeschlagener Wirkmechanismus ... 93
6.10 Medizinische Relevanz und Ausblick ... 96
7 Literaturverzeichnis... 99
8 Eidesstattliche Versicherung ... 121
9 Lebenslauf ... 123
10 Publikationen ... 125
11 Danksagung ... 126
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Entwicklung und Progression kardialer Hypertrophie bis zur dekompensierten
Herzinsuffizienz ... 4
Abbildung 2: Pathophysiologische Differenzierung physiologischer von pathologischer kardialer Hypertrophie ... 9
Abbildung 3: Strukturformel von cis-Palmitoleinsäure (C16:1n-7) ... 13
Abbildung 4: Strukturformel von trans-Palmitoleinsäure (C16:1 trans-9) ... 13
Abbildung 5: Nahrungsmittelquellen von C16:1 sowie C16:1-vermittelte vorteilhafte Auswirkungen im menschlichen Organismus ... 15
Abbildung 6: C16:1 als Mediator belastungsinduzierter kardialer Hypertrophie ... 17
Abbildung 7: Hypertrophe Effekte des Fettsäurenmixes (FFA) und Untersuchung des fetalen Genprogrammes in HL-1 Kardiomyozyten ... 19
Abbildung 8: Western Blot Analysen von p-AKT ... 20
Abbildung 9: Die IGF-1-vermittelte intrazelluläre Signaltransduktion im Hinblick auf zelluläre Hypertrophie- und Atrophiemechanismen ... 24
Abbildung 10: Mechanismus der AKT-vermittelten subzellulären FOXO Translokation im Hinblick auf die Aktivität der FOXO-Transkriptionsfaktoren ... 26
Abbildung 11: Funktionale Co-Aktivierung des MAPK-ERK sowie des IGF-1 Signalweges durch extrazelluläre Ligandenbindung ... 28
Abbildung 12: Eichgerade zur Erfassung der Western Blot-Proteinkonzentration ... 42
Abbildung 13: Schematischer Aufbau eines Blot Sandwiches ... 45
Abbildung 14: Saubere Schmelzkurve als Hinweis für eine adäquate Primerspezifität ... 52
Abbildung 15: Halblogarithmische Auftragung der Amplifikationskurve (Ct-Einstellung) ... 53
Abbildung 16: C16:1 induziert AKT-Phosphorylierung in HL-1 Zellen ... 54
Abbildung 17: C16:1 induziert FOXO1-Phosphorylierung (Ser256) in HL-1 Zellen ... 56
Abbildung 18: C16:1 induziert FOXO1-Phosphorylierung (Thr24) in HL-1 Zellen ... 57
Abbildung 19: C16:1 induziert FOXO3a-Phosphorylierung (Ser318/321) in HL-1 Zellen ... 58
Abbildung 20: C16:1 induziert FOXO3a-Phosphorylierung (Thr32) in HL-1 Zellen ... 59 Abbildung 21: C16:1 bewirkt die Reduktion der FOXO1 Gesamtproteinmenge in HL-1 Zellen . 61 Abbildung 22: C16:1 bewirkt die Reduktion der FOXO3 Gesamtproteinmenge in HL-1 Zellen . 62 Abbildung 23: C16:0 induziert FOXO3a-Phosphorylierung (Ser318/321) während IGF-1 keine Auswirkung auf p-FOXO3a (Ser318/321) in HL-1 Zellen hat ... 63 Abbildung 24: C16:1 induziert die zytosolische Translokation von FOXO3a in HL-1 Zellen... 65 Abbildung 25: C16:1 bewirkt keine Regulation der FOXO3a-Zielgene MuRF1 und Atrogin-1 in HL-1 Zellen ... 66 Abbildung 26: C16:1 induziert die Genexpression des FOXO3a-Zielgens p21 in HL-1 Zellen 67 Abbildung 27: C16:1 induziert ERK 1/2-Dephosphorylierung nach 30 Minuten in HL-1 Zellen . 69 Abbildung 28: C16:1 induziert ERK 1/2-Dephosphorylierung nach 15 und 5 Minuten in HL-1 Zellen ... 70 Abbildung 29: C16:0 hat keinerlei Auswirkung auf den Phosphorylierungsgrad von ERK 1/2 in HL-1 Zellen ... 71 Abbildung 30: Potentieller Wirkmechanismus der C16:1-vermittelten kardialen Effekte ... 94
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Einteilung der Herzinsuffizienz nach Ejektionsfraktion ... 3
Tabelle 2: Verwendete Lösungen und Puffer ... 35
Tabelle 3: Verwendete Antikörper ... 36
Tabelle 4: Rezepte der Trenn- bzw. Sammelgel Herstellung ... 43
Tabelle 5: Exemplarische Darstellung der zu pipettierenden Volumina... 44
Tabelle 6: Protokoll der cDNA Synthese ... 50
Tabelle 7: Protokoll des Standard qRT-PCR Reaktionsansatzes ... 51
Abkürzungsverzeichnis
ACE Angiotensin Converting Enzyme
AFX FOXO4
AKT Proteinkinase B
ANF Atrialer natriuretischer Faktor ANP Atriales natriuretisches Peptid
ANOVA Analysis of variance = Varianzanalyse
APS Ammoniumpersulfat
AT-1 Angiotensin-1
ATGL Adipozyten-Triglycerid-Lipase
ATP Adenosintriphosphat
atATGL-KO Fettgewebe-Adipozyten-Triglycerid-Lipase-Knockout BCA Bicinchoninic Acid Assay
BNP Natriuretisches Peptid Typ B
ß-MHC ß-Myosin Heavy Chain
BSA Bovines Serumalbumin
C14:0 Myristinsäure
C16:0 Palmitinsäure
C16:1 Palmiteoleinsäure
C18:0 Stearinsäure
C18:1t11 trans-Vaccensäure
CDK Cyclin-dependent kinases; Cyclin-abhängige Kinase
cDNA Complementary RNA = Komplementäre Desoxyribonukleinsäure ChIP Chromatin-Immunopräzipitation
CK-1 Casein Kinase 1
C02 Kohlenstoffdioxid
CRP C-reaktives Protein
Ct-Wert Threshold Cycle-Wert
dH2O Destilled Water = Destilliertes Wasser DAKO Dako Fluorescence Mounting Medium
DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol, Fluoreszenzfarbstoff
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Nukleosidtriphosphat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EF Ejection Fraction = Ejektionsfraktion
EGF Epidermaler Wachstumsfaktor
ERK 1/2 Extracellular-signal regulated kinases 1 und 2 ESC European Society of Cardiology
ET-1 Endothelin-1
FFA Free Fatty Acid Mix = Freie Fettsäurenmixtur FBS Fetal Bovine Serum = Fetales Kälberserum FKHRL1 Forkhead Box Protein O3 (veraltet)
FOXO Forkhead-Box-Proteine
FVB Friend leukemia Virus B
GSK-3 Glykogensynthase-Kinase 3
H20 Wasser
HCl Salzsäure
HDL High Density Lipoprotein
HI Herzinsuffizienz
HRQoL Health-related quality of life
HSL hormonsensitive Lipase
HFmrEF Heart Failure with mid-range Ejection Fraction = Herzinsuffizienz mit mittelgradig reduzierter Ejektionsfraktion
HFpEF Heart Failure with preserved Ejection Fraction = Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion
HFrEF Heart Failure with reduced Ejection Fraction = Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion
HSL hormonsensitive Lipase
IGF-1 Insulin-like-Growth-Factor-1
IGF-1-R Insulin-like-Growth-Factor-1-Rezeptor iPS induzierte pluripotente Stammzellen IRS-1 Insulinrezeptorsubstrat-1
IVSd Interventrikuläre Septumdicke JVS Juvenile Viszerale Steatose
KHK Koronare Herzkrankheit
KO Knock Out
LDL Low-density Lipoprotein
LM Linksventrikuläre Masse
LV Linker Ventrikel
LVEF Links ventrikuläre Ejektionsfraktion
MAFbx Atrogin-1
MAPK Mitogen-activated-Proteinkinase MEK Mitogen-activated-Proteinkinase 2
MGL Monoacylglycerinlipase
mRNA Messenger RNA = Botenribunukleinsäure mTOR mammalian Target of Rapamycin
MuRF1 Muscle Ring Finger 1
n Anzahl technischer Replikate
N Anzahl der Versuchswiederholungen
NaOH Natriumhydroxid
NASH Nicht-alkoholischer Fettleber NFAT Nuclear factor of activated T-cells
NRVM Neonatal Rat Ventricular Cardiomyocytes NYHA New York Heart Association
p Signifikanzniveau
pAVK Periphere arterielle Verschlusskrankheit
PBS Phosphat Buffered Saline = Phosphatgepufferte Salzlösung
PCH Physiologic Cardiac Hypertrophy = Physiologische Kardiale Hypertrophie
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PDGF Platelet derived Growth Factor PI3K Phosphoinositid-3-Kinase
PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat PIP3 Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat
PP2a Proteinphosphatase 2a
PTEN Phosphatase and Tensin homolog PTM Posttranslationale Modifikation PVDF Polyvinylidenfluorid
PWd posteriore Wanddicke; linksventrikuläre Hinterwand qRT-PCR Quantitative Real-Time Polymerasekettenreaktion RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
RAF Mitogen-activated-Proteinkinase 3
RAS EGF-Rezeptor Typ I
RIPA Radioimmuno-precipitation assay buffer = Radioimmunpräzipitation Assay Puffer
RIPA-Puffer+ RIPA-Puffer mit Proteasen- und Phosphataseninhibitor RNA Ribonucleic Acid = Ribonukleinsäure
RNA-Seq RNA-Sequencing
RNAsin RNase-Inhibitor
rpm rounds per minute = Zentrifugengeschwindigkeit
RT Reverse Transkriptase
SCD1 Stearoyl-CoA-Desaturase
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis=
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
Ser Serin
T2DM Typ 2 Diabetes mellitus
TAC Transverse Aortic Constriction = Transverses Aortenkonstriktionsmodell
TAG Triacylgylercide
TBS Tris-buffered saline= Tris-gepufferte Kochsalzlösung
TBST Tris-buffered saline with Tween 20 = Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween TEMED Tetramethylethylendiamin
Thr Threonin
UPS Ubiquitin-Proteasom-System
UPW Ultra Pure Water
WHO World Health Organization
wt Wildtyp
Zusammenfassung
Palmitoleinsäure (C16:1) ist eine einfach ungesättigte Fettsäure, die kürzlich durch unsere Arbeitsgruppe als wichtiger Mediator physiologischer kardialer Hypertrophie (PCH) charakterisiert wurde. Da die molekulare Wirkweise jedoch weitgehend ungeklärt ist, war das Ziel dieser Arbeit den intrazellulären Wirkmechanismus von C16:1 zu entschlüsseln.
Das Hauptaugenmerk sollte hierbei auf der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)- Proteinkinase B (AKT)- Forkhead-Box-Protein (FOXO) Signalkaskade liegen.
Murine HL-1 Kardiomyozyten wurden entweder mit bovinem Serumalbumin als Vehikel, 40 mM C16:1, 130 mM Palmitinsäure (C16:0) oder 10 nM Insulin like Growth factor-1 (IGF-1) als Positivkontrolle stimuliert. Die Stimulationsintervalle variierten hierbei zwischen 5 min und 48 h. Im Anschluss wurden Gesamt-RNA und Proteine isoliert und mittels qRT-PCR und Western Blot analysiert. Darüber hinaus wurden Immunfluorenz-Assays durchgeführt.
Hierzu wurden die immungefärbten Zellen mit einem invertierten Fluoreszenz- Phasenkontrast-Mikroskop vergrößert und mit der BZ-II Analyser Software analysiert. Zuletzt wurde ebenfalls der Effekt von C16:1 auf den Mitogen-activated Protein Kinases (MAPK)- Extracellular-signal regulated Kinases (ERK) Signalweg betrachtet.
Die atrophieregulierenden FOXO-Transkriptionsfaktoren 1 und 3a zeigten sich nach einer 30-minütigen C16:1 Stimulation durch Phosphorylierung inaktiviert. Zudem beobachteten wir eine Reduktion der FOXO 1 und 3a Gesamtproteinmenge infolge 18-stündiger C16:1 Stimulation. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie konnte die C16-induzierte zytoplasmatische Translokation von FOXO3a nachgewiesen werden. Das Genexpressionslevel des FOXO3a-Zielgens p21 erwies sich nach 24-48 h C16:1 Stimulation signifikant hochreguliert. Ferner zeigte sich die wachstumsfördernde AKT-Kinase durch C16:1 aktiviert. Die Zellzyklus-regulierende Kinase ERK 1/2 präsentierte eine Inaktivierung mittels Dephosphorylierung infolge der C16:1 Stimulation.
Zusammenfassend konnten AKT, FOXO und ERK 1/2 als intrazelluläre Schlüsselmediatoren von C16:1 in Kardiomyozyten identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Aktivierung der wachstumsfördernden AKT-Kinase, sondern auch die Hemmung der atrophieregulierenden FOXO-Proteine bei der PCH eine zentrale Rolle spielt. Darüber hinaus scheint C16:1 durch die Inaktivierung von ERK 1/2, möglicherweise auch die Proliferation von Kardiomyozyten zu regulieren. Somit ist es naheliegend, dass die Effekte von C16:1 auf die kardiale Hypertrophie über die Beeinflussung von AKT/FOXO und ERK 1/2 vermittelt werden. Diese Studie liefert ein Hinweis darauf, dass die Fettsäure C16:1 molekulare kardioprotektive Effekte vermittelt, die zukünftig sowohl potentiell in der Prophylaxe als auch in der Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen von Bedeutung sein könnten.
Abstract
We have previously identified palmitoleic acid (C16:1) as a novel regulator of physiological cardiac hypertrophy. Since the underlying mechanisms of the C16:1-induced cardiac effects remain uncertain, we aimed to further investigate the molecular cell signaling pathways behind the C16:1-mediated cardiac responses. The primary focus of this study was set on examining the effects of C16:1 on the PI3K-AKT-FOXO signaling pathway, related to cardiac hypertrophy.
The murine HL-1 cardiomyocytes were stimulated with either vehicle, 40 mM C16:1, 130 mM C16:0 as well as 10 nM IGF-1 (positive control) between 5 mins to 48 h. Subsequently total- RNA and proteins were isolated and examined by performing qRT-PCR or Western Blot analysis. In addition, immunofluorescence staining was conducted. Furthermore, the impact of C16:1 on MAPK/ERK signaling was also examined.
The FOXO transcription factors 1 and 3a revealed to be phosphorylated and therefore inactivated by a 30 min C16:1 stimulation. Moreover, the cells total abundance of FOXO1 and FOXO3a was significantly diminished upon an 18 h C16:1 treatment. As demonstrated by immunofluorescence staining, C16:1 stimulation furthermore resulted in the cytosolic translocation of FOXO3a. The expression level of the FOXO3a target gene p21 proved to be significantly upregulated upon 24-48 h of C16:1 treatment. The growth-promoting AKT kinase was activated by C16:1 treatment, indicating yet another involvement of the AKT- FOXO signaling pathway in C16:1-induced cardiac responses. In addition, the cell cycle- regulating kinase ERK 1/2 demonstrated to be significantly decreased upon C16:1 stimulation.
In conclusion, we were able to identify the C16:1-mediated regulation of AKT, FOXO and ERK 1/2 in cardiomyocytes. As FOXO is known to promote protein degradation and cell atrophy, its inactivation may play a crucial role in mediating physiological cardiac hypertrophy. By activating the growth-promoting kinase AKT, C16:1 ultimately enables pro- hypertrophic cardiac effects. The inactivation of ERK 1/2, being a fundamental regulator of cell cycle progression, indicates that while cell hypertrophy is being promoted, C16:1 may inhibit cell proliferation. This study revealed several molecular targets within the AKT-FOXO as well as the MAPK- signaling pathways that seem to be involved in mediating the previously shown, C16:1-induced beneficial cardiac growth processes. Therefore, it is probable that the effects of C16:1 on cardiac hypertrophy are mediated by affecting the AKT/FOXO as well as the ERK 1/2 signaling pathway. As C16:1 induces physiological cardiac growth, our study may contribute to develop potential future lipid-based therapies for cardiac diseases such as cardiomyopathy or heart failure.
1 Einleitung
1.1 Herzinsuffizienz
Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen im heutigen Zeitalter die weltweit häufigste Todesursache dar [1].Gemäß der Weltgesundheitsorganisation (WHO) ließen sich allein im Jahr 2017 31 % der globalen Todesfälle auf Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems zurückführen [1]. Angesichts des demographischen Wandels und des verbesserten medizinischen Fortschritts steigen jährlich die Inzidenz und Prävalenz chronischer kardiovaskulärer Erkrankungen [2]. Darüber hinaus verursachen kardiovaskuläre Erkrankungen in der Bundesrepublik Deutschland jährlich ca. 46,4 Milliarden Euro Krankheitskosten, weitaus mehr als durch andere Krankheitsentitäten verursacht [3]. Herz- Kreislauf-Erkrankungen nehmen daher nicht nur eine zentrale Stellung in der Medizin ein, sondern sind darüber hinaus von enormer gesellschaftlicher und gesundheitsökonomischer Relevanz [4].
Neben der arteriellen Hypertonie und der koronaren Herzkrankheit (KHK) stellt die Herzinsuffizienz eines der häufigsten kardiologischen Krankheitsbilder dar [5]. Schätzungen gehen davon aus, dass in der Bundesrepublik Deutschland ca. 1,8 Millionen Menschen an Herzinsuffizienz leiden [6]. Laut Daten der CARLA-Studie steigt die Prävalenz der Herzinsuffizienz mit zunehmendem Alter auf bis zu 22 % bei den über 75-Jährigen an [7].
Seit 1995 hat sich die Erkrankungshäufigkeit der Herzinsuffizienz nahezu verdoppelt [8].
Zurzeit stellt die akute Dekompensation der Erkrankung deutschlandweit den häufigsten Hospitalisierungsgrund stationär behandelter Patienten dar [9]. Allein im Jahr 2016 bedingte das Krankheitsbild der Herzinsuffizienz bundesweit über 444.632 (2016) Krankenhausaufnahmen [8]. Trotz moderner Therapiemöglichkeiten, welche die Morbidität und Mortalität der Herzinsuffizienzpatienten signifikant reduzieren konnten, zeigten Levy et al., dass die Mortalität mit 45-59 % jedoch weiterhin enorm hoch bleibt [10]. Demzufolge ist die Herzinsuffizienz eine häufig lebensbedrohliche Erkrankung von großer sozioökonomischer Relevanz.
Pathophysiologische Grundlage der chronischen Herzinsuffizienz ist eine ineffiziente kardiale Pumpleistung, welche nicht genügt, um die Blutzirkulation und die
Sauerstoffversorgung des Organismus adäquat aufrecht zu erhalten. Aus klinischer Sicht wird das Krankheitsbild der Herzinsuffizienz als eine hochkomplexe Symptomkonstellation aus Ruhe- oder Belastungsdyspnoe, Ödembildung und Leistungsminderung definitiert [11].
Laut der „Europäischen Gesellschaft für Kardiologie“ (ESC) resultieren daraus weitere klinisch relevante Parameter wie ein venöser Rückstau mit erhöhtem Jugularvenendruck, gesteigertem hepatojugulären Reflux, pulmonalvenöser Stauung mit Lungenödem sowie bei der HFrEF (heart failure with reduced ejection fraction) eine echokardiographisch verminderte Ejektionsfraktion (LVEF) [12]. Die Patienten leiden an zahlreichen belastenden klinischen Symptomen, welche progredient im Verlauf der Erkrankung zunehmen. Laut Blindermann et al. zählen hierzu vor allem Fatigue und Abgeschlagenheit, Nykturie, Luftnot, Husten, Palpitationen, Brustschmerz, Schlaflosigkeit sowie diverse psychische Komorbiditäten[13]. Durch die progrediente Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit erfahren die Patienten eine ausgeprägte Abnahme der Lebensqualität (HRQOL)[14]. Der enorme Leidensdruck resultiert in einer ausgesprochen hohen Prävalenz von Angststörungen (43,7%) und Depressionen (42,7%) [13,15].
Zur funktionellen Einteilung des Schweregrades der Herzinsuffizienz übernahm die
„Deutsche Gesellschaft für Kardiologie“ die Kriterien der „New York Heart Association“
(NYHA) [16,17]. Die NYHA-Klassifikation orientiert sich maßgeblich an der Leistungsfähigkeit des Patienten und erfasst zudem Komplikationen im Rahmen kardialer Adaptationsmechanismen [12].
Die ESC hat entsprechend der linksventrikulären Auswurfleistung (Ejektionsfraktion ((EF)) folgendes Schema zur Einteilung der Herzinsuffizienz entwickelt, welches sich auf die echokardiographische Beurteilung der linksventrikulären EF bezieht (s. Tabelle 1). Laut der ESC wird die Herzinsuffizienz echokardiographisch in drei verschiedene Entitäten klassifiziert, wobei es ätiologisch wichtig ist, zwischen systolischer (HFrEF, HFmrEF) und diastolischer Herzinsuffizienz (HFpEF) zu unterscheiden [18,19].
LVEF ≥50% “Heart Failure with preserved EF” (HFpEF) diastolische HI mit normaler Ejektionsfraktion LVEF 40-49% “Heart Failure with mid-range EF” (HFmrEF)
systolische HI mit mittelgradig reduzierter Ejektionsfraktion LVEF <40% “Heart Failure with reduced EF” (HFrEF)
systolische HI mit reduzierter Ejektionsfraktion
Tabelle 1: Einteilung der Herzinsuffizienz nach Ejektionsfraktion (basierend auf der ESC Leitlinie 2016)
„Trotz [moderner Diagnostik, kontinuierlicher Aktualisierung der Leitlinien und] der Etablierung neuer, die Prognose verbessernder Therapiestrategien, bleibt die Lebenserwartung herzinsuffizienter Patienten weiterhin deutlich eingeschränkt“ [6]. Im fortgeschrittenen Krankheitsstadium (NYHA IV) beträgt die 1-Jahresletalität eines herzinsuffizienten Patienten ca. 50% und stellt damit eine noch ungünstigere Prognose als die diverser Tumorleiden dar [20]. Obwohl medikamentöse Behandlungsansätze mittels Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer (ACE-Hemmer) oder Angiotensin Typ 1 Rezeptorblocker (ARB), Beta-Blocker, Aldosteronantagonisten, Ivabradin und Neprilysin- Inhibitoren eine Prognoseverbesserung der systolischen Herzinsuffizienz (HFrEF) erzielen können, kann die Erkrankung bis heute nicht geheilt werden und nur zusätzlich symptomatisch mit Diuretika und Digitalisglykosiden behandelt werden [10,17,21,22]. Für die diastolische Herzinsuffizienz (HFpEF) hingegen gibt es, außer einer symptomatischen Diuretikatherapie, zurzeit noch keine prognoseverbessernde Therapiestrategie [18]. Als Ultima Ratio für Patienten im NYHA IV-Endstadium der Herzinsuffizienz verbleibt lediglich die Herztransplantation oder mechanische Ersatzverfahren.
In Anbetracht der exorbitant hohen Mortalitätsrate und der Tatsache, dass bis dato keine kausalen Therapiemöglichkeiten existieren, gewinnt die Implementierung von Herzinsuffizienz-Prophylaxe-Programmen zukünftig an großer Bedeutung. In diesem Kontext muss verdeutlicht werden, dass sich die ursächliche Entstehung einer Herzinsuffizienz stets auf eine strukturelle Myokardschädigung mit kontraktiler Dysfunktion, reduzierter LVEF oder verminderter diastolischer Dehnbarkeit zurückführen lässt [23–25].
Ätiologisch lassen sich die KHK, Kardiomyopathien, stenosierende Herzklappenvitien, Myokarditiden sowie vor allem die kardiale Hypertrophie als wichtigste Risikofaktoren für die Manifestation einer Herzinsuffizienz zusammenfassen[18]. Im Folgenden soll näher auf die Entstehung kardialer Hypertrophie eingegangen werden.
Abbildung 1: Entwicklung und Progression kardialer Hypertrophie bis zur dekompensierten Herzinsuffizienz am Beispiel ventrikulärer Druckbelastungen (Graphik orientiert an Dorn, 2007)
1.2 Pathologische und Physiologische kardiale Hypertrophie
1.2.1 Pathophysiologische Grundlagen kardialer Hypertrophie
Der Begriff „Hypertrophie“ lässt sich als zellulärer Adaptationsmechanismus definieren, welcher eine myozytäre Größenzunahme bewirkt und ferner in der ganzheitlichen Vergrößerung eines Gewebes resultiert. Hypertrophieentstehung am Herzen erfolgt als Kompensationsreaktion auf diverse kardiale Belastungsfaktoren [26,27]. Hierzu zählen die arterielle Hypertonie, Herzklappenvitien wie beispielsweise die Aortenklappenstenose sowie eine erhöhte hämodynamische Belastung im Rahmen von Ausdauersport [28,29]. Um eine erhöhte Belastung des linksventrikulären Auswurftraktes kompensieren zu können, finden am Herzen prohypertrophe Prozesse statt. Diese verursachen eine Größenzunahme der einzelnen Kardiomyozyten des Herzmuskels [30,31]. Diese Vergrößerung der Kardiomyozyten resultiert letztendlich in der ganzheitlichen Zunahme von Herzwanddicke
und Herzgewicht [32]. Kardiomyozyten sind postnatal bereits terminal differenzierte Zellen, wodurch sie unmittelbar nach der Geburt die Fähigkeit zur Hyperplasie, also zur Vermehrung der eigenen Zellzahl, verlieren [33]. Daher kann eine Größenzunahme des Herzens ausschließlich auf nicht-proliferierende Weise, durch Hypertrophie- anstatt Hyperplasie- Mechanismen, erfolgen [34,35].
Während die Hypertrophie der Skelettmuskulatur überwiegend positiv bewertet wird, stellt die Myokardhypertrophie einen negativen Prädiktor für die Gesundheit dar [36]. Die Hypertrophie des Myokards ist ätiologisch für gravierende Krankheitsbilder wie Herzinsuffizienz, Kardiomyopathien, Arrhythmien sowie plötzlichen Herztod verantwortlich [37,38]. Jedoch muss dabei zwischen zwei verschiedenen Formen der Myokardhypertrophie differenziert werden. Aufgrund ihrer Genese werden diese als pathologische und physiologische kardiale Hypertrophie klassifiziert. Beide Hypertrophieentitäten lassen sich anhand morphologischer sowie metabolischer Eigenschaften und zugrundeliegenden Signalkaskaden voneinander unterscheiden und werden im Folgenden diskutiert.
1.2.2 Pathologische kardiale Hypertrophie
Das Herz kompensiert eine chronisch erhöhte Arbeitsbelastung durch kardiale Hypertrophie [39]. Chronische ventrikuläre Druck- und Volumenbelastungen durch eine arterielle Hypertonie oder ein Herzklappenvitium führen zur Entwicklung einer pathologischen Herzmuskelhypertrophie [39,40].
Diese persistierend erhöhte ventrikuläre Arbeitsbelastung führt zur Freisetzung von Endothelin-1 aus Endothelzellen [41]. In Kombination mit der Ausschüttung von Katecholaminen und der neurohumoralen Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron- Systems (RAAS) werden intrazelluäre Signalkaskaden aktiviert und somit die Manifestation von pathologischer Hypertrophie am Herzen ermöglicht [42]. Charakterisiert wird die pathologische Hypertrophie durch eine deutliche Größenzunahme des Myokards, welche mit Apoptose, interstitieller Fibrose, Inflammation, kardialer Dysfunktion sowie einer erhöhten Mortalität assoziiert ist [43–46]. Aufgrund fibrotischer Umbauprozesse führt die pathologische Hypertrophie zu einer zunehmenden Steifheit des Herzmuskels, welche die Kontraktilität und Elastizität des Myokards stark einschränkt [45,47]. Echokardiographisch korreliert die maladaptive Myokardhypertrophie durch chronische Druckbelastungen in der
Regel mit dem Bild einer konzentrischen Hypertrophie [48]. Diese zeichnet sich durch die Zunahme von linksventrikulärer Wand- und Septumdicke bei deutlicher Reduktion des Ventrikellumens aus (s. Abbildung 1) [48,49]. Ferner korreliert die pathologische konzentrische Hypertrophie auf zellulärer Ebene mit der Zunahme von Proteinsynthese und Kardiomyozytendurchmesser bei gleichbleibender Kardiomyozytenlänge [50]. Hieraus ergibt sich die echokardiographisch darstellbare Verminderung des linksventrikulären Diameters.
Die Veränderung des zellulären Phänotyps durch Hypertrophie induziert auf Genexpressionsebene die Hochregulation bestimmter Hypertrophiemarker, welche auch als
„Fetal Gene Program“ bezeichnet werden [51,52]. Hierzu zählen unter anderem folgende Gene: ANF (Atrialer natriuretischer Faktor), ß-MHC (ß-Myosin Heavy Chain) sowie BNP (Brain natriuretic Peptide), das zudem einen hohen Stellenwert im Rahmen der Herzinsuffizienz-Diagnostik besitzt [51–54]. Die Induktion des fetalen Genprogrammes im Rahmen pathologischer Hypertrophie geht mit einem Switch in der Versorgung des myokardialen Energiemetabolismus einher. Zur ATP-Produktion utilisiert gesundes Herzgewebe zu 70-90 % die ß-Oxidation von Fettsäuren [55,56]. Der Abbau von Glucose stellt unter physiologischen Bedingungen maximal 30% der kardialen ATP-Gewinnung dar [57]. Unter pathologischen Konditionen bedient sich das Herz jedoch vorwiegend der Glykolyse von Kohlenhydraten anstatt der ß-Oxidation von Fettsäuren, um den eigenen Energiebedarf zu decken [58]. Während das Herz unter physiologischen Bedingungen normalerweise ein Gewicht von ca. 300 g aufweist, überschreitet der pathologisch hypertrophierte Herzmuskel häufig das kritische Herzgewicht von 500 g [59]. Ab jenem Herzgewicht kann bei gleichbleibender Kapillarisierung aufgrund einer zu hohen Diffusionsstrecke zwischen Kapillarbett und Herzmuskel keine ausreichende Sauerstoffstoffversorgung des Myokards mehr gewährleistet werden [60].
Die Progression von pathologischer Hypertrophie stellt eine der Hauptursachen für die Manifestation von Herzinsuffizienz und kardialer Dekompensation dar [61,62]. Da Herzinsuffizienz, wie in Abschnitt 1.1 erwähnt, zu den führenden internistischen Krankheitsbildern und den häufigsten kardiovaskulären Todesursachen gehört, gilt die pathologische Myokardhypertrophie als prognostisch schlechtes Zeichen [37]. In der Framingham-Kohortenstudie wurden enorm hohe Prävalenzzahlen von linksventrikulärer Hypertrophie bei Patienten ab dem 70. Lebensjahr evident [63]. Diese betrugen 33 % aller
männlichen Probanden sowie 49 % der Frauen [43]. Darüber hinaus weisen 44 % der an arterieller Hypertonie erkrankten Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bereits eine kardiale Hypertrophie auf [64,65]. Nach der Framingham-Studie gilt die LV-Masse als zentraler Prädiktor für Herzinsuffizienz bedingte Morbidität und Mortalität [38]. Laut Levy et al. korreliert eine LV-Masse von >140 g/m2 mit einem hochsignifikant gesteigerten Mortalitätsrisiko bei Herzinsuffizienzpatienten [38]. Linksventrikuläre Hypertrophie gilt somit als hochrelevanter kardialer Risikofaktor.
Im Vergleich zu der im Folgenden beschriebenen physiologischen Hypertrophie, ist keinerlei Regression des pathologisch hypertrophierten Myokards möglich [66]. Jedoch kann die pathologische Hypertrophie durch gezielte pharmakologische Interventionen in ihrer Progression verlangsamt werden. Die pathologische, maladaptive Hypertrophie des Herzens stellt somit einen irreversiblen Prozess dar. Demzufolge ist es von eminenter sozioökonomischer Bedeutung, möglichst frühzeitig der Entwicklung einer pathologischen kardialen Hypertrophie entgegenzuwirken.
1.2.3 Physiologische kardiale Hypertrophie
Physiologische kardiale Hypertrophie wurde erstmalig im Jahre 1899 von dem schwedischen Arzt Eberhard Henschen beschrieben [67]. Mittels Perkussion stellte Henschen eine Herzvergrößerung bei skandinavischen Skilangläufern fest, welche er als
„Sportherz“ betitelte[67]. Die Entdeckung des Sportherzens löste zunächst Bedenken und Skepsis hinsichtlich potentieller gesundheitlicher Risiken aus [68]. Durch eine wegweisende Publikation Herbert Reindells fand die Debatte um das Risikoprofil sportbedingter Herzhypertrophie jedoch im Jahre 1960 ein Ende. Reindell, der damalige Präsident des Deutschen Sportärztebundes, stellte durch umfangreiche röntgenologische Untersuchungen fest, dass das Sportherz besonders leistungsfähig sei [68,69].
Auf pathophysiologischer Ebene erfolgt die Entwicklung von physiologischer kardialer Hypertrophie als kompensatorische Anpassungsreaktion auf einen erhöhten peripheren Sauerstoffbedarf, welcher beispielsweise unter leistungssportlichen Bedingungen entsteht [70]. Neben intensivem Ausdauersport, induziert Schwangerschaft sowie postnatales Wachstum ebenfalls eine physiologische Größenzunahme des Herzens [71]. Im Vergleich zu anderen Hypertrophieentitäten, überschreitet das kardiale Remodeling im Rahmen
physiologischer Hypertrophie in der Regel nicht das kritische Herzgewicht von 500 g [72].
Rein morphologisch entspricht physiologische kardiale Hypertrophie dem Bild eines exzentrisch hypertrophierten, harmonisch vergrößerten Herzens mit Dilatation aller vier Herzhöhlen [73,74]. Dieses zeichnet sich echokardiographisch durch eine Zunahme der linksventrikulären Wanddicke sowie durch die Erhöhung des linksventrikulären Diameters aus, was eine gesteigerte kardiale Auswurfsleistung und eine Senkung der Herzfrequenz ermöglicht. Durch diese positiv inotrope und negativ chronotrope Wirkung wird die Effektivität des Herzmuskels gesteigert [75]. Physiologische kardiale Hypertrophie hat demzufolge im Vergleich zur pathologischen Hypertrophie einen überwiegend positiven Effekt auf die kardiovaskuläre Gesundheit.
Auf zellulärer Ebene korreliert die physiologische Myokardhypertrophie mit der gleichmäßigen Vergrößerung von Kardiomyozytendicke und Kardiomyozytenlänge [76]. Als Stimulus für das Zustandekommen prohypertropher Wachstumsprozesse im Rahmen physiologischer kardialer Hypertrophie, dient die Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden.
Hierbei erscheint die Insulinrezeptor-vermittelte Signaltransduktion, inklusive der nachgeschalteten PI3K-AKT-mTOR (mammalian target of Rapamycin) Signalkaskade eine entscheidende Rolle zu spielen [77,78]. Laut aktuellem wissenschaftlichen Stand scheint ferner der MAPK-ERK Signalweg bei der Entstehung physiologischer Hypertrophie beteiligt zu sein [79]. Im Vergleich zum Zustand der pathologischen Hypertrophie lässt sich im physiologisch vergrößerten Herzen eine verstärkte Angiogenese feststellen [80]. Darüber hinaus finden bei der physiologischen kardialen Hypertrophie weder fibrotische Umbauprozesse, noch Apoptose von Kardiomyozyten statt [81,82].
Das Herz verbraucht mehr Energie als jedes andere Organ. Wie in 1.2.2 beschrieben, stellt die ß-Oxidation freier Fettsäuren die primäre ATP-Quelle zur Energieversorgung des Myokards dar [55,57]. Trotz der Aktivierung diverser intrazellulärer Signalwege und des genannten strukturellen Remodelings, bedient sich das physiologisch hypertrophierte Herz weiterhin der mitochondralen ß-Oxidation von Fettsäuren als primäres Substrat, um den eigenen Energiebedarf zu decken [51,67]. Darüber hinaus bildet sich die physiologische Herzhypertrophie bei Sistieren der auslösenden Stimuli, beispielweise bei Trainingsabbruch oder auch postnatal, wieder zurück [83,84]. Die vollständige Reversibilität sowie die konservierte kardiale Auswurfsleistung stellen die wichtigsten Charakteristika
physiologischer Herzhypertrophie dar [40]. Jene Eigenschaften begründen daher, weshalb die physiologische Hypertrophie im Vergleich zur maladaptiven, pathologischen Hypertrophie weder Herzinsuffizienz, noch kardiale Dekompensation induziert. Des Weiteren deuten laut Literatur diverse Studien darauf hin, dass die Manifestation von physiologischer Herzhypertrophie die erhöhte Lebenserwartung von Ausdauersportlern im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung erklärt [85,86].Somit grenzt sich die gesundheitlich eher vorteilhafte physiologische Myokardhypertrophie deutlich von der in 1.2.2 beschriebenen pathologischen Herzmuskelhypertrophie ab (s. Abbildung 2).
Abbildung 2: Pathophysiologische, funktionale Differenzierung physiologischer von pathologischer kardialer Hypertrophie (basierend auf Dorn, 2007).
1.3 Grundlagen des Lipidstoffwechsels im menschlichen Organismus
Fettstoffwechselstörungen wie Hypercholesterinämie, Hypertrigylceridämie oder Hyperlipoproteinämie werden als zentrale Dispositionsfaktoren für die Ausbildung metabolischer und kardiovaskulärer Erkrankungen angesehen [87]. Die sogenannten
„Dyslipidämien“ werden nicht nur mit erhöhter Inflammation, Insulinresistenz und Adipositas assoziiert, sondern korrelieren mit einer deutlich erhöhten Prävalenz für die Ausbildung von
Diabetes Mellitus Typ 2, metabolischem Syndrom, Atherosklerose und Gefäßerkrankungen wie KHK und der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK) [87–92]. Laut der aktuellen ESC Dyslipidämie Leitlinie wird die Senkung des LDL-Cholesterins als bedeutende bevölkerungsbezogene Präventionsmaßnahme chronisch kardiovaskulärer Erkrankungen hervorgehoben [89]. Ein intakter Fettsäurenstoffwechsel ist daher von enormer medizinischer Relevanz und repräsentiert einen wichtigen Protektionsfaktor gegen diverse kardiovaskuläre Krankheitsbilder.
Bei normalgewichtigen Personen macht das Fettgewebe zwischen 10 und 15 % des Körpergewichtes aus [93]. Obwohl der menschliche Körper einen großen Anteil der lebenswichtigen Fettsäuren endogen synthetisieren kann, stellen Nahrungsfette die wichtigste Quelle der menschlichen Lipidspeicher dar. Nahrungsfette bestehen zu 90 % aus Triacylglycerinen (TAG), welche sich aus Glycerin und langkettigen Fettsäuren zusammensetzen [94]. Im menschlichen Körper sind TAG von enormer Wichtigkeit, da sie die Speicherform von Fettsäuren darstellen. TAG sind demzufolge der größte und effizienteste Energiespeicher des menschlichen Organismus. Obwohl TAG in zahlreichen Körpergeweben präsent sind, sind sie mengenmäßig vor allem im Fettgewebe gespeichert, woraus sie bei Nahrungskarenz rasch mobilisierbar sind [93].
Fettsäuren sind langkettige Monocarbonsäuren mit unverzweigter Kohlenstoffkette, welche wichtige Funktionen im Körper erfüllen. Aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften sind Fettsäuren nicht wasserlöslich und werden daher im Blut entweder an Serumalbumin oder an sogenannte Lipoproteine gebunden transportiert [94]. Fettsäuren sind nicht nur das Substrat für Energiebereitstellung mittels mitochondrialer ß-Oxidation, sondern sie sind maßgeblich an Zellmembranarchitektur und der Synthese intrazellulärer Botenstoffe, wie beispielweise der Prostaglandine, beteiligt [95]. Je nach Bedarf des Organismus werden Fettsäuren durch einen Prozess namens Lipolyse aus TAG mobilisiert und dem Körper zur ß-Oxidation zur Verfügung gestellt [94].
1.4 Fettsäuren im Kontext kardialer Hypertrophie
Das Herz ist ein hochadaptives Organ, was auf diverse physiologische und pathologische Stimuli mit einem bemerkenswerten zellulären Remodeling reagiert [96]. Laut aktuellem wissenschaftlichen Stand können Fettsäuren und Lipide als Signalmoleküle betrachtet
werden, welche eine Inter-Organ-Kommunikation zwischen multiplen Organen wie beispielsweise dem Herzen und der Leber ermöglichen [97,98].
Riquelme et al. stellten sich 2011 die Frage, ob ein Zusammenhang zwischen bestimmten Fettsäuren und der Entstehung physiologischer kardialer Hypertrophie bestünde[96]. Diese Fragestellung thematisierten sie mithilfe eines Reptilien-Modells, für welches die burmesische Tigerpython (Python molurus) herangezogen wurde[96]. Die Tigerpython gilt als exzellentes Modell extremer metabolischer Regulation und physiologischer kardialer Hypertrophie, da sie zwar nur gelegentlich und nach langen Intervallen speist, jedoch nach Nahrungsaufnahme einer exorbitant großen Mahlzeit (ca. 25-65 % der eigenen Körpermasse) eine 40 %ige Zunahme linksventrikulärer Masse präsentiert [99–102]. Diese extreme postprandiale metabolische Anpassungsleistung wird durch eine plötzliche 16- fache Erhöhung des eigenen Sauerstoffbedarfs, einem massiv erhöhten Nährstofftransport sowie einer 4,5-fachen Steigerung der kardialen Auswurfleistung verursacht [101–103]. Dem postprandialen kardialen Remodeling der Tigerpython kommt eine besondere Bedeutung zu, da vergleichbare Säugetier-Modelle deutlich geringere Hypertrophie-Antworten demonstrieren konnten. Belastungsinduzierte physiologische Hypertrophie überschreitet zudem bei Säugetieren meist keine 10-20 %-ige Erhöhung LVM [96,99]. Obwohl die substanziellen kardialen Adaptationsvorgänge der Tigerpython mehrfach beschrieben wurden, blieben die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen weitgehend ungeklärt [104].
Riquelme et. al identifizierten frei zirkulierende Fettsäuren, die Myristinsäure (C14:0), Palmitinsäure (C16:0) sowie Palmitoleinsäure (C16:1), die postprandial im Plasma der Python signifikant erhöht waren. Um einen möglichen Zusammenhang dieser im Plasma gemessenen Fettsäurekonzentrationen mit der Manifestation von physiologischer kardialer Hypertrophie erkennen zu können, wurde das identifizierte Fettsäurenprofil näher untersucht. Hierzu wurden in-vitro Experimente mit kultivierten NRVM Kardiomyozyten (Neonatal Rat Ventricular Myocytes) sowie ein in-vivo Mausmodell durchgeführt. Sowohl die NRVM Kardiomyozyten als auch die Mäuse des Tierversuches demonstrierten unter Applikation des Fettsäurenmixes aus C14:0, C16:0 und C16:1 erhebliche prohypertrophe kardiale Effekte. Während die NRVM auf die Fettsäurenstimulation mit erheblicher Zunahme der zellulären Größe reagierten, wurde im Mausmodell eine signifikante Erhöhung
linksventrikulärer Masse deutlich. Ferner ließen sich im murinen Myokard keine Anzeichen von kardialer Fibrose oder pathologischer Lipidablagerung feststellen. Auf Genexpressionsebene induzierte die Supplementation des Fettsäurenmixes keinerlei Aktivierung des pathologischen fetalen Genprogrammes. Demzufolge gab es keinen Anhalt für eine mögliche pathologische Komponente der dargestellten kardialen Hypertrophie.
Vielmehr implizieren diese Resultate, dass die beobachteten kardialen Wachstumsprozesse der Tigerpython alleinig physiologischer Genese sein könnten[96].
Die von Riquelme et al. publizierten Daten suggerieren somit, dass der im Pythonplasma identifizierte Fettsäurenmix auch im Säugetier als Mediator physiologischer kardialer Hypertrophie wirken könnte [96]. Die beschriebene Kombination aus Myristinsäure, Palmitinsäure und Palmitoleinsäure könnte daher als biologisch aktive, prohypertroph wirkende Lipidspezies betrachtet werden.
1.5 Palmitoleinsäure
Aus dem von Riquelme et al. beschriebenen prohypertroph wirkenden Fettsäuremix kommt der Fettsäure Palmitoleinsäure (C16:1) besondere Bedeutung zu. Im Kontext medizinisch- metabolischer Forschung, wurde die Palimitoleinsäure (C16:1) kürzlich von Cao et al. als Lipokin mit hormonartiger Wirkung charakterisiert, das Insulinsensitivität systemisch moduliert und Hepatosteatosis unterbinden kann [97]. Cao et al. haben somit erstmalig den Begriff des „Lipokins“ etabliert. Ein Lipokin, entspricht laut Cao et al., ähnlich wie ein Adipokin, einem vom Fettgewebe sezerniertem Lipid mit hormonartiger Signalmolekül- Wirkung [97]. Vor jenem Hintergrund stellt sich die Frage nach der Bedeutung von Palmitoleinsäure als potentieller lipokinartiger, prohypertroph wirkender Mediator für die Entstehung von physiologischer kardialer Hypertrophie.
Palmitoleinsäure, chemisch auch bekannt als cis-Hexadec-9-ensäure, ist eine einfach ungesättigte Fettsäure mit 16 Kohlenstoffatomen. Aufgrund der Doppelbindungs- Lokalisation am 7ten Kohlenstoffatom, zählt Palmitoleinsäure (C16:1n7) zu den Omega-7- Fettsäuren. Im menschlichen Körper existiert sowohl die cis- als auch die trans-Isoform der Palmitoleinsäure [105].
Abbildung 3: Strukturformel von cis-Palmitoleinsäure (C16:1n-7)
Abbildung 4: Strukturformel von trans-Palmitoleinsäure (C16:1 trans-9)
Palmitoleinsäure ist eine nicht-essentielle Fettsäure, welche dem Körper entweder diätetisch zugeführt wird oder endogen synthetisiert werden kann. Die Rolle von Palmitoleinsäure im menschlichen Organismus wurde erstmalig in den 1960er Jahren beschrieben[106]. Bereits 1962 stellten McLaren et al. im Rahmen einer Kompositionsanalyse des menschlichen Fettgewebes fest, dass die Verteilung von Palmitoleinsäure im adipösen Gewebe je nach Lokalisation differiert [107]. Obwohl Palmitoleinsäure im menschlichen Körper zu den fünf geläufigsten Fettsäuren zählt, entspricht C16:1 lediglich 2,51 % der durch die Nahrung aufgenommen Fette [108,109]. Das ubiquitär im Serum, in Zellmembranen und Phospholipiden sowie in den meisten Organen des Körpers vorkommende C16:1 entstammt daher hauptsächlich endogener de novo Synthese [110]. Die humane C16:1 Biosynthese findet primär in der Leber sowie im Fettgewebe statt [110]. Enzymatisch wird die C16:1 Lipogenese durch die Stearoyl-CoA Desaturase (SCD1) reguliert, einem Schlüsselenzym für die Synthese einfach ungesättigter Fettsäuren [111]. Die endogene C16:1 Synthese mittels SCD1 produziert ausschließlich die cis-Isoform [110]. Nach abgeschlossener Synthese wird cis-Palmitoleinsäure vor allem in Cholesterolestern, TAG sowie in die Membranphospholipide inkorporiert [110]. Trans-Palmitoleat kann ebenfalls vom Körper gebildet werden, dies geschieht allerdings SCD1-unabhängig [112]. Die Produktion von trans-Palmitoleinsäure ereignet sich durch endogene Verkürzung der diätetisch aufgenommen trans-Vaccensäure (C18:1t11) [112]. Trans-Palmitoleat wird im Vergleich zu cis-Palmitoleat hauptsächlich exogen über die Nahrung akquiriert und vom Körper in nur äußerst geringen Mengen hergestellt [113]. Wie die meisten Transfette ist trans-Palmitoleat vor allem in industriell hergestellten Lebensmitteln, Frittieröl, sowie in Milchprodukten enthalten[114]. Im Vergleich zu trans-Palmitoleat ist cis-Palmitoleinsäure in nur wenigen
Lebensmitteln zu mehr als 5 % vorhanden [115]. Nahrungsmittel mit einem ausgesprochen hohen C16:1(cis)-Gehalt sind unter anderem Lachs (6 %), Lebertran (7 %) sowie Macadamiaöl (17 %) [116]. Die höchste bekannte C16:1 Konzentration findet sich jedoch mit 32-42 % in der Sanddornbeere [117].
1.5.1 Effekte von Palmitoleinsäure im metabolischen Kontext
Die als Lipokin beschriebene Palmitoleinsäure, welche vom Fettgewebe sezerniert wird, besitzt auto- sowie endokrine Eigenschaften im Körper und übt auf diverse Organe hormonartigen Einfluss aus [110]. Zu diesen zählt insbesondere die Skelettmuskulatur, das Pankreas, die Leber, das kardiovaskuläre System sowie das Fettgewebe. Der von Cao et al. mithilfe eines Mausmodells erstmalig dargestellte Zusammenhang zwischen C16:1 und einer verbesserten systemischen Insulinsensitivität, ließ sich durch mehrere klinische Studien validieren [118,119]. In einer prospektiven Kohortenstudie zeigten Mozaffarian et al.
2011 eine deutlich verringerte Insulinresistenz sowie eine signifikante Reduktion der Diabetes Mellitus Typ 2 Inzidenz bei Probanden mit erhöhten C16:1 Plasmaspiegeln [105].
Ferner wurde auf zellulärer Ebene festgestellt, dass C16:1 eine ausgeprägte Proliferation sowie eine erhöhte Sekretion der Insulin-produzierenden ß-Zellen des Pankreas bewirkt [120]. Durch diesen Mechanismus lässt sich die durch C16:1 optimierte periphere Insulinsensitivität der quergestreiften Skelettmuskulatur erklären [97].
Im Leberparenchym wirkt C16:1 nachgewiesener Weise antiinflammatorisch und korreliert zudem mit einer verringerten Inzidenz hepatischer Lipidakkumulation und Hepatosteatosis [97,121]. Des Weiteren resultiert die diätetische Supplementation von C16:1 laut Yang et al.
in einer deutlichen Reduktion der hepatischen Lipogenese [122]. Jedoch existieren auch Daten, welche C16:1 als negativen Prädiktor für die Manifestation einer nichtalkoholischen Fettleber (NASH) interpretieren [123]. In der 2009 durchgeführten prospektiven Kohortenstudie von Puri et al. wurde ein signifikant erhöhter C16:1 Spiegel in den Blutserumproben NASH-erkrankter Patienten deutlich [124]. Da die Bedeutung von Palmitoleinsäure für die Leberverfettung bzw. das Krankheitsbild der NASH trotz mehrerer Studien derzeit noch kontrovers und unvollständig ist, bedarf dieser Zusammenhang noch weiterer Abklärung.
Darüber hinaus zeigt C16:1 eine günstige Auswirkung auf die Lipidzusammensetzung des Blutes [125]. Bereits 2003 wurde in einer epidemiologischen Studie von Garg et al.
festgestellt, dass der Konsum von Macadamianüssen ein verbessertes Serumlipidprofil bei hypercholesterinämen Patienten bewirkt [126]. Laut Garg et al. führt ein gesteigerter Macadamianusskonsum zu einer Reduktion von LDL- und Gesamtcholesterinwerten sowie zu einer Erhöhung des protektiven HDL-Cholesterins [126]. Interessanterweise gilt jene Beobachtung jedoch lediglich für die cis- und nicht für die trans-Isomere der Palmitoleinsäure. Auch Palmitinsäure (C16:0), eine vollgesättigte, der C16:1 strukturell beinahe identische Fettsäure, zeigt keinerlei positive Auswirkung auf das humane Serumlipidprofil [127]. Tatsächlich scheint C16:0 sich eher ungünstig auf das Lipidmuster des menschlichen Blutes auszuwirken, da eine Assoziation zwischen erhöhten C16:0- Serumspiegeln und der koronaren Herzkrankheit (KHK) besteht [128,129].
Da Palmitoleinsäure nachweislich eine vorteilhafte Modifikation des Serumlipidprofils bewirkt, wurde C16:1 bereits in den USA zur Behandlung des metabolischen Syndroms zugelassen. Summa Summarum ergeben sich immer mehr Evidenzen dafür, dass die durch Lipolyse ins Blut freigesetzte cis-Palmitoleinsäure einen positiven Effekt auf diverse metabolische sowie kardiovaskuläre Krankheitsbilder ausübt [110]. Ferner implizieren die bereits publizierten Daten, dass C16:1 vermutlich sogar als direkter molekularer Signalvermittler im Körper agieren könnte (s. Abbildung 5).
Abbildung 5: Nahrungsmittelquellen von C16:1 sowie C16:1-vermittelte vorteilhafte Auswirkungen im menschlichen Organismus
1.5.2 Palmitoleinsäure im Kontext physiologischer kardialer Hypertrophie
Um den molekularen Mechanismus der in 1.4 beschriebenen Fettsäure-induzierten PCH näher erfassen zu können, führte unsere Arbeitsgruppe (Foryst-Ludwig et al.) weiterführende Experimente durch. Mittels cre/loxP-Technologie wurden ATGL-Knockout Mäuse generiert, welche eine für das weiße Fettgewebe (at) spezifische, defekte Lipolyse aufwiesen (atATGL-KO Mäuse) [130]. Die Lipolyse des Fettgewebes wird maßgeblich durch die enzymatische Aktivität dreier Lipasen reguliert [93]. Da die ATGL den geschwindigkeitsbestimmenden Reaktionsschritt der Lipolyse katalysiert, führt eine Inhibition dieses Enzyms zu einer stark verminderten lipolytischen Fettsäure-Freisetzung ins Serum. Im Rahmen eines atATGL-Knockouts sollte demzufolge eine deutliche Reduktion frei zirkulierender Fettsäuren konstatiert werden[131].
In der Arbeit von Foryst-Ludwig et al. wurden atATGL-defiziente Mäuse gemeinsam mit einer Wildtyp-Kontrollgruppe (wt) einem täglichen Ausdauerlauftraining exponiert. Dieses sollte als Stimulus für die Entwicklung einer adaptiven physiologischen kardialen Hypertrophie dienen. Aufgrund der Inhibition des ATGL-Enzyms war die trainingsinduzierte Lipolyse der Knockout-Tiere eminent gestört, welches sich anhand einer signifikant reduzierten Fettsäure-Freisetzung im Serum der Knockout-Mäuse verdeutlichte. Hingegen demonstrierten die Wildtypmäuse einen starken Anstieg frei zirkulierender Fettsäuren nach Beendigung des Laufbandtrainings. Nach abgeschlossenem 7-wöchigen Ausdauertraining wurden die Tiere beider Gruppen echokardiographisch untersucht. Die wt-Tiere, welche Ausdauertraining absolvierten, zeigten einen signifikanten Anstieg linksventrikulärer Masse, welche morphologisch einer belastungsinduzierten physiologischen Hypertrophie entsprach.
Jene kardiale Veränderung konnte jedoch nicht bei den atATGL-KO Tieren beobachtet werden. Hieraus ließ sich schließen, dass die belastungsinduzierte Fettsäuren-Mobilisation aus dem weißen Fettgewebe womöglich einen erheblichen Einfluss auf das Zustandekommen physiologischer Hypertrophie einnimmt. In histologischen Untersuchungen wurde ferner deutlich, dass die kardiale linksventrikuläre Hypertrophie der wt-Mäuse weder mit Fibroseentwicklung noch mit inflammatorischen Prozessen korrelierte, weshalb eine pathologische Genese der Hypertrophie unwahrscheinlich erschien[131].
Um zu identifizieren, welche Fettsäure letztendlich als prohypertroph wirkender Schlüsselmediator des beobachteten kardialen Remodelings einzuschätzen ist, wurden die
Serumlipidprofile der Versuchstiere genauer betrachtet. Es wurde nach einer Fettsäure gesucht, welche im Plasma der wt-Tiere, jedoch nicht in dem der atATGL-KO Tiere signifikant gesteigert war. Interessanterweise erschien in diesem Kontext lediglich C16:1 plausibel. Um die prohypertrophe Wirkung von C16:1 zu verifizieren, wurden die atATGL- KO Tiere in einem zweiten Versuch im Laufe des Ausdauertrainings mit C16:1 supplementiert. Die C16:1 Applikation resultierte interessanterweise darin, dass die atATGL- KO Tiere analog zu den wt-Tieren eine hypertrophe Antwort des Herzmuskels auf die sportliche Belastung hin präsentierten. Folglich konnte angenommen werden, dass frei zirkulierendes C16:1 womöglich eine herausragende Rolle bei der Entstehung physiologischer kardialer Hypertrophie einnimmt (s. Abbildung 6) [131].
Abbildung 6: Hinweise auf C16:1 als Mediator belastungsinduzierter kardialer Hypertrophie (bereits publizierte in-vivo Daten von Foryst-Ludwig et al.)
A Belastungsinduzierte kardiale Hypertrophie der wt-Mäuse anhand prozentualer Zunahme LVM. * p<0,05 wt versus atATGL-KO Mäuse (n = 9; unpaired t-test). B C16:1n7 Supplementation in vivo. Kardiale Adaptation von wt/atATGL-KO Mäusen, die während der Ausdauertrainingsperiode mit C16:1n7 oder C18:1 supplementiert wurden. Die kardialen Adaptationsvorgänge werden verdeutlicht anhand prozentualer Zunahme LVM (n=4-5; * p<0,05 atATGL-KO versus wt, unpaired t-test). C Serumlipid-Analysen von wt/atATGL- KO Mäusen, welche Ausdauertraining absolvierten (run) im Vergleich zu den sitzenden Kontrollgruppen (sed).
*** p< 0.001 C16:1n7 wt (run) versus wt (sed) (n=5). Analysiert mittels rapid resolution HPLC/tandem MS.
Der prohypertrophe Effekt von C16:1 wurde mithilfe eines in-vitro Modells auf zellulärer Ebene bestätigt. Hierzu verwendeten Foryst-Ludwig et al. die murine HL-1 Kardiomyozyten Zelllinie. Die HL-1 Kardiomyozyten wurden mit dem von Riquelme et al. beschriebenen Fettsäuremix (FFA) aus C14:0, C16:0 und C16:1 stimuliert [96]. Analysiert wurde hierbei zelluläre Hypertrophie, indem die Fläche der Zellen immunfluoreszenzmikroskopisch ausgewertet wurde. Deutlich wurde, dass die Fettsäurenmixtur eine zelluläre Hypertrophie der HL-1 Kardiomyozyten herbeiführte. Interessanterweise resultierte ein Mangel von C16:1 in dem Fettsäuregemisch in einem Ausbleiben der beobachteten prohypertrophen Effekte.
Dies validierte die Annahme, dass C16:1 womöglich als Mediator PCH betrachtet werden könnte [131]. Um zwischen pathologischer und physiologischer Ätiologie der C16:1- induzierten zellulären Hypertrophie differenzieren zu können, wurden die HL-1 Kardiomyozyten mit C16:1 sowie mit Endothelin-1 (Et-1) stimuliert. Ausgewertet wurde in diesem Versuchsansatz die Expression pathologischer Hypertrophiemarker, welche dem fetalen Genprogramm zugehörig sind (s. Abbildung 7). Et-1 diente in diesem Kontext als Positivkontrolle für die Induktion pathologischer Hypertrophie. Die Behandlung mit Et-1 induzierte auf Genexpressionsebene eine signifikant gesteigerte Expression der pathologischen Hypertrophiemarker ANF und ß-MHCH. Hingegen konnte keinerlei Hochregulation von ANF und ß-MHCH durch C16:1 Stimulation in den HL-1 Zellen hervorgerufen werden. Die fehlende Aktivierung des fetalen Genprogrammes durch C16:1 suggeriert daher, dass die C16:1-induzierte HL-1-Zell-Hypertrophie einem physiologischen Entstehungs-mechanismus zuzuordnen ist (s. Abbildung 7) [131].
Abbildung 7: Hypertrophe Effekte des Fettsäurenmixes (FFA) und Untersuchung des fetalen Genprogrammes in HL-1 Kardiomyozyten (bereits publizierte Daten Foryst-Ludwig et al.) A Hypertrophe Antwort muriner HL-1 Kardiomyozyten auf FFA; repräsentative Immunfluoreszenz Bilder von HL-1 Zellen, welche 6h lang mit 100 nm Endotheli-1 (Et-1) (B), Fettsäuremix (FFA= C14:0, C16:0, C16:1) (D) oder Vehikelkontrolle (A,C) behandelt wurden. B Die Fläche der Zellen wurde mittels BZ-II Analyzer Software und Dynamic Cell Count Tool (Keyence) berechnet. Daten werden präsentiert als x-fache Änderung im Vergleich zur Vehikelkontrolle; *** p< 0.001 vs. Kontrolle, one-way ANOVA (Bonferroni post-test) oder unpaired t-test. C,D qRT-PCR Analyse des fetalen Genprogrammes anhand ANF und ß-MHCH Expression. HL-1 Zellen wurden 6h lang mit 100 nm Et-1, C16:1n7 low/high sowie den zugehörigen Vehikelkontrollen behandelt. ANF, Atrial Natriuretic Factor; ß-MHCH, ß-cardiac Myosin Heavy Chain Isogene. * p <0.05 vs. Kontrolle (n=3; one- way ANOVA, Bonferroni post-test).
Nachdem evaluiert wurde, welcher Genese die C16:1 bedingten zellulären Wachstumsprozesse zuzuordnen sind, sollten die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen näher analysiert werden. Die Proteinkinase AKT ist laut Literatur als molekulare Grundlage der PCH bekannt [132]. Laut DeBosch et al. aktivieren physiologische kardiale Wachstumstimuli stets die Proteinkinase AKT mittels Phosphorylierung, weshalb die AKT-Kinase für unsere Arbeitsgruppe zum Gegenstand weiterer Untersuchungen wurde [132]. Hierzu wurden weitere in-vitro Versuche durchgeführt, in denen HL-1 Zellen sowie primäre humane Kardiomyozyten mit C16:1 stimuliert wurden, um daraufhin proteinbiochemische Untersuchungen von AKT durchzuführen. Nach kurzfristiger 30-
minütiger C16:1 Applikation wurde sowohl in den HL-1 Zellen als auch in den humanen Kardiomyozyten eine signifikante Hochregulation des Phosphorylierungsstatus von AKT deutlich (s. Abbildung 8). Diese Beobachtung ist ein erster Hinweis auf die molekulare Wirkweise der C16:1 vermittelten physiologischen Hypertrophie und suggeriert darüber hinaus, dass diese womöglich AKT-abhängig abläuft[131].
Abbildung 8: Western Blot Analysen von p-AKT (bereits publizierte Daten Foryst-Ludwig et al.) A WB Analyse von p-AKT sowie AKT als Proteinladungskontrolle. HL-1 Kardiomyozyten wurden 30 min lang mit C16:1n7 stimuliert. C WB Analyse von p-AKT und AKT. Primäre humane Kardiomyozyten wurden 30 min lang mit C16:1n7 stimuliert. B,D Densitometrische Analysen der in A,C dargestellten WB mittels Image J Software. n=3-4, * p < 0.05 vs. Kontrolle; *** p <0.01 vs. Kontrolle, unpaired t-test.
Um die Ergebnisse von Foryst-Ludwig et al. auf den menschlichen Organismus translatieren zu können, wurden in Kooperation mit der Abteilung für Sportmedizin der Charité 25 männliche Ausdauerathleten der deutschen Biathlon-Nationalmannschaft untersucht. Das Lebensalter der untersuchten Kohorte betrug 18 bis 28 Jahre. Es wurden sowohl Nüchtern- Serumlipidanalysen als auch echokardiographische bildgebende Untersuchungen der Biathlonathleten durchgeführt. Die Ausdauersportler präsentierten bildmorphologisch allesamt das echokardiographische Korrelat einer linksventrikulären Hypertrophie mit erhöhter linksventrikulärer Masse (LVM), einer erhöhten diastolischen interventrikulären
