Genomweite Suche neuer Modulatoren der Signaltransduktion in kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz
Dissertation
zur Erlangung des mathematisch‐naturwissenschaftlichen Doktorgrades
“Doctor rerum naturalium“
an der Georg‐August‐Universität Göttingen
vorgelegt von Nadine Kramann aus Bergisch Gladbach
Göttingen 2010
Referent: Professor Dr. Wolfgang Brück Korreferent: Professor Dr. Uwe Groß Tag der mündlichen Prüfung: 18.01.2011
1 Einleitung ... 1
1.1 Das Krankheitsbild der kardialen Hypertrophie und Herzinsuffizienz ... 1
1.2 Zelluläre Mechanismen kardialer Hypertrophie ... 2
1.3 Die MAPK Signalkaskade ... 4
1.4 Die Rolle der MAPK Signalkaskade in kardialer Hypertrophie ... 6
1.5 Die RAF Proteinfamilie ... 7
1.6 Die Bedeutung von B‐RAF ... 10
1.7 Zielsetzung der Arbeit ... 11
2 Material und Methoden... 12
2.1 Chemikalien... 12
2.2 Enzyme ... 14
2.3 Gebrauchswaren ... 15
2.4 Geräte... 16
2.5 Gebrauchsfertige Reaktionssysteme ... 16
2.6 Sterilisation ... 17
2.7 Puffer und Stammlösungen ... 17
2.8 Nährmedien ... 21
2.8.1 Nährmedien für Escherichia Coli... 21
2.8.2 Nährmedien für eukaryotische Zellkultur ... 22
2.9 Biologisches Material ... 23
2.9.1 Bakterienstämme ... 23
2.9.2 Eukaryotische Zelllinien... 23
2.9.3 Adenoviren... 23
2.9.4 Antikörper ... 24
2.9.5 DNA‐Plasmide ... 25
2.9.6 DNA‐Konstrukte ... 25
2.9.7 Synthetische Oligonukleotide ... 26
2.9.8 Längenstandards ... 28
2.9.9 Versuchstiere ... 28
2.9.10 Herkunft des Patientenmaterials ... 29
2.9.11 cDNA‐Library ... 29
2.10 Datenbanken und Analyse‐Software ... 30
2.11 Zellbiologische Arbeitsmethoden ... 31
2.11.1 Kultur eukaryotischer Zellen ... 31
2.11.2 Kryokonservierung eukaryotischer Zellen... 31
2.11.3 Transfektion eukaryotischer Zellen mit FuGENE®6... 31
2.12 Primär‐Zellbiologische Arbeitsmethoden ... 32
2.12.1 Isolation ventrikulärer Kardiomyocyten adulter Ratten ... 32
2.12.2 Kultivierung von Kardiomyocyten adulter Ratten... 33
2.12.3 Isolation ventrikulärer Kardiomyocyten neonataler Ratten ... 34
2.12.4 Kultivierung von Kardiomyocyten neonataler Ratten... 35
2.12.5 Immuncytochemische Färbung und Planimetrie von Kardiomyocyten neonataler Ratten... 35
2.13 Adenoviraler Gentransfer ... 36
2.13.1 Herstellung eines Adenovirus ... 36
2.13.2 Adenoviraler Gentransfer in Kardiomyocyten der Ratte ... 38
2.14 Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren... 38
2.14.1 Minipräparation von DNA ... 38
2.14.2 Midipräparation von DNA ... 39
2.14.3 Ethanolfällung von DNA aus wässrigen Lösungen ... 39
2.14.4 Phenol‐Chloroform Aufreinigung von Nukleinsäuren... 40
2.14.5 Isolierung von Gesamt‐RNA aus Herzgeweben... 40
2.14.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren... 40
2.14.7 Agarosegelelektrophorese von DNA... 41
2.14.8 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen ... 42
2.14.9 Aufreinigung von DNA mittels PCR Purification... 42
2.15 Enzymatische Modifikation von DNA... 42
2.15.1 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen ... 42
2.15.2 Dephosphorylierung von Plasmid‐DNA... 43
2.15.3 Ligation von DNA‐Fragmenten... 43
2.15.4 Rekombination von DNA‐Fragmenten ... 44
2.15.5 Transformation elektrokompetenter Zellen mit Plasmid‐DNA... 45
2.15.6 Transformation hitzekompetenter Zellen mit Plasmid‐DNA ... 46
2.16 Amplifikation von Nukleinsäuren durch Polymerase‐Kettenreaktion ... 46
2.16.1 Polymerase‐Kettenreaktion an Plasmid‐DNA und cDNA ... 46
2.16.2 Reverse Transkription ... 48
2.16.3 Real‐Time Quantitative PCR ... 48
2.17 Proteinbiochemische Arbeitsmethoden ... 50
2.17.1 Proteinextraktion aus eukaryotischen Zellen ... 50
2.17.2 Proteinkonzentrationsbestimmung ... 50
2.17.3 SDS‐Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS‐PAGE)... 51
2.17.4 Proteintransfer auf Nitrozellulose mittels Western‐Blot... 52
2.17.5 Detektion von menbrangebundenen Proteinen mit Antikörpern ... 52
2.17.6 Immunpräzipitation und Koimmunpräzipitation ... 53
2.17.7 Ras‐Aktivierungs‐Assay ... 53
2.18 cDNA Library Screen... 54
2.18.1 Luciferase Reporterassay ... 54
2.18.2 Screen der Maus cDNA Library ... 56
2.18.3 Subselektion interessanter Maus cDNA Pools ... 57
2.19 Knockdown der Expression von Genen mit miR RNAi... 57
2.20 Ethik... 58
2.21 Statistische Auswertung... 58
3 Ergebnisse ... 59
3.1 Die Inhibition von B‐Raf verhindert die Phenylephrin induzierte Hypertrophie ... 59
3.2 Die Inhibition von B‐Raf führt zu verminderter Mek1/2 Phosphorylierung ... 61
3.3 Optimierung der Transfektion von COS‐7 Zellen ... 62
3.4 Validitätsprüfung der Fusionsproteine für den Luciferase Reporterassay ... 64
3.5 Screen der Maus cDNA‐Library nach neuen Modulatoren der B‐RAF/Mek1 Interaktion 67 3.6 Untersuchung identifizierter cDNA Klone auf Regulation im hypertrophen Myokard mittels Real‐Time PCR ... 71
3.7 Rcn1 wird signifikant reguliert im hypertrophen Myokard ... 75
3.8 Expression der Rcn1 mRNA in verschiedenen Organen der Maus ... 76
3.9 Die Überexpression von Rcn1 führt zu verminderter MEK1/2 Phosphorylierung... 77
3.10 Die Überexpression von Rcn1 verhindert die Phenylephrin induzierte Hypertrophie .... 79
3.11 Knockdown von Rcn1 in NIH3T3‐Zellen ... 81
3.12 Der Knockdown von Rcn1 führt zu einer Verstärkten B‐RAF/Mek1 Interaktion in NIH3T3‐ Zellen... 82
3.13 Der Knockdown von Rcn1 führt zu einer erhöhten Mek1/2 Phosphory‐lierung in Kardiomyocyten ... 83
3.14 Der Knockdown von Rcn1 führt zu kardialer Hypertrophie ... 84
3.15 Rcn1 wirkt unterhalb von Ras ... 86
3.16 Rcn1 inhibiert die C‐RAF Kinaseaktivität in Kardiomyocyten... 87
3.17 Die Expression von RCN1 in humanem Myokard... 88
3.18 Test der im cDNA Library Screen Modulatoren auf C‐RAF/B‐RAF Spezifität ... 89
3.19 Luciferase Reporterassay in Kardiomyocyten... 91
4 Diskussion... 93
4.1 Zusammenfassung der Ergebnisse... 93
4.2 B‐RAF reguliert die kardiale Hypertrophie... 95
4.3 Die Modulatoren der B‐RAF/Mek1 Interaktion ... 97
4.3.1 Die Aktivatoren der B‐RAF/Mek1 Interaktion... 97
4.3.2 Aktivatoren der B‐RAF/Mek1 Interaktion und ihre Regulation im hypertrophen Myokard ... 99
4.3.3 Inhibitoren der B‐RAF/Mek1 Interaktion ... 101
4.4 Reticulocalbin ist ein Mitglied der CREC‐Proteinfamilie ... 103
4.4.1 Rcn1 – ein Überblick... 104
4.4.2 Rcn1 inhibiert B‐RAF und C‐RAF... 106
4.4.3 Rcn1 Expression im hypertrophen Myokard... 107
4.5 Die Regulation der MAPK Signalkaskade ... 108
4.6 Perspektiven... 110
5 Zusammenfassung ... 112
6 Literaturverzeichnis... 115
Danksagung... 136
A Ampere
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaar
BSA Rinderserumalbumin
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
cDNA komplementäre DNA
Cy3 Cyanin‐3
Da Dalton
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxynukleotidtriphosphate
DPBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DTT 1,4‐Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alteri (und andere)
FKS Fötales Kälberserum
g Gramm, Erdbeschleunigungskonstante
GDP Guanosindiphosphat
GTP Guanosintriphosphat
h Stunde
kb Kilobasenpaare
l Liter
LB Luria‐Bertani
µ mikro = 10‐6
m milli = 10‐3
M Molar
mA Milliampere
min Minute
mRNA messenger RNA = Boten‐RNA
n nano = 10‐9
OD Optische Dichte
p pico = 10‐12
PBS Phosphat‐gepufferte Kochsalzlösung
PCR Polymerase‐Kettenreaktion
pH Negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
RT Raumtemperatur; reverse Transkription
s Sekunde
SDS Natriumdodecylsulfat
SDS‐PAGE Natriumdodecylsulfat‐Polyacrylamid‐Gelelektrophorese
Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus
Tris Tris‐hydroxymethyl‐aminomethan U Unit = definierte Enzymeinheit
ü. N. über Nacht
UV ultraviolettes Licht
V Volt
v/v Volumen pro Volumen
Vol Volumen
w/v Gewicht pro Volumen
z.B. zum Beispiel
1 Einleitung
1.1 Das Krankheitsbild der kardialen Hypertrophie und Herzinsuffizienz
Erkrankungen des Herz‐Kreislaufsystems zählen zu den häufigsten Todesursachen in den westlichen Industrienationen. Laut Angaben des statistischen Bundesamtes Deutschland lag im Jahr 2008 bei 43% aller Verstorbenen eine solche Erkrankung vor. Besonders häufig sind Menschen über dem 65sten Lebensjahr betroffen. Bei Ihnen gelten Erkrankungen des Herz‐
Kreislaufsystems mit 91% als Haupttodesursache. Weltweit werden laut Schätzungen der WHO (world health organisation) bis 2015 etwa 20 Millionen Menschen an Herz‐Kreislauferkrankungen und ihren Folgen sterben. Durch die hohe Anzahl an Krankheitsfällen sind auch die wirtschaftlichen Folgen nicht zu unterschätzen. Herz‐Kreislauferkrankungen verursachen die höchsten Krankheitskosten. Für Prävention, Behandlung, Pflege und Rehabilitation von Patienten mit Herz‐Kreislauferkrankungen wurden alleine in Deutschland im Jahr 2006 rund 35 Milliarden Euro benötigt. Daher soll die grundlegende Erforschung dieser Krankheit bis in die molekularen Mechanismen neue Ansatzmöglichkeiten für das Verständnis der Entstehung und des Ablaufes von Herz‐Kreislauferkrankungen bieten
Bei der Herzinsuffizienz handelt es sich um eine Funktionsstörung der Pumpleistung des Herzens.
Blut kann nicht in ausreichender Menge weitergeleitet werden um die Versorgung des Körpers und seiner Organe mit adäquaten Mengen Sauerstoff zu gewährleisten. Organversagen kann Folge dieser Mangelversorgung sein. Die Herzinsuffizienz kann durch eine Vielzahl von Vorerkrankungen induziert werden. Typischerweise handelt es sich dabei um langjährige Hypertonie, Myokardinfarkt, Herzklappendefekte, Myokarditis, angeborene Herzfehler, familiäre hypertrophe Kardiomyopathie und diabetische Kardiomyopathie (Klein et al., 2003; Lips et al., 2003). Folge dieser Vielzahl von Stimuli ist in der Regel zunächst ein kompensatorischer Zustand.
In diesem wird durch physiologische Kompensationsprozesse wie einer kardialen Hypertrophie mit einem Wachstum der Myozyten die verminderte Pumpleistung des Herzens ausgeglichen (Seidman und Seidman 2001). Patienten in diesem Stadium zeigen kaum Symptome und sind weitgehend beschwerdefrei. Die Hypertrophie äußert sich typischerweise in einer Vergrößerung der Myozyten, einer veränderte Proteinbiosynthese und einem vermehrten Zusammenschluss kontraktiler Untereinheiten im Myokard (Seidman und Seidman 2001; Olson und Schneider 2003).
Die kardiale Hypertrophie ist mehr als eine globale Wachstumsreaktion der Myozyten. Sie führt auch zu intrinsischen Dysfunktionen als Folge einer Umprogrammierung des Transkriptionsapparates der Zelle. Diese Umprogrammierung geht mit einer Reaktivierung von
Genexpressions‐ und Proteinbiosynthesemustern einher, von denen viele normalerweise nur in der fetalen Entwicklungsperiode des Myokards vorkommen. So führt länger anhaltende Hypertrophie zu schwerer Herzinsuffizienz und plötzlichem Herztod (Song et al., 2006). In diesem späteren, dekompensierten Stadium leiden Patienten häufig unter Symptomen wie Ödemen, Herzrhythmusstörungen und schneller Ermüdung, was die Lebensqualität erheblich einschränkt.
Aus diesem Grund stellt die frühe Behandlung der Hypertrophie, ungeachtet der jeweiligen Ursache, ein wichtiges Therapiekonzept in der Behandlung von Herzinsuffizienz und plötzlichem Herztod dar.
1.2 Zelluläre Mechanismen kardialer Hypertrophie
Adulte Kardiomyocyten sind terminal ausdifferenzierte Zellen, die den Zellzyklus seit der perinatalen Periode verlassen haben. Somit haben sie die Fähigkeit der Zellteilung verloren (Sugden und Clerk 1998). Daher scheidet Zellteilung als Reaktion auf die vermehrte Pumpleistung des Herzens aus. Bei einer Hypertrophie kommt es sowohl zu einer Volumenzunahme der Zellen aufgrund der gesteigerten Protein‐ und RNA‐Biosynthese (Sudgen und Clerk, 1998; Yamazaki et al., 1998) als auch zu einer Vermehrung der funktionellen Substanz des Myokards bei konstanter Zellzahl (Olson und Schneider 2003). Man unterscheidet zwei Formen der Hypertrophie, die konzentrische und exzentrische Hypertrophie. Bei erhöhter Druckbelastung führt die gesteigerte systolische Wandspannung zu einer Neubildung von Myofibrillen. Das führt zu einer starken Zunahme der Wanddicke des Ventrikels bei gleichbleibendem Innenvolumen, was als konzentrische Hypertrophie bezeichnet wird. Sie ist assoziiert mit einem vergrößerten Myozytendurchmesser relativ zur Zelllänge mit paralleler Deposition der Sarkomere (Smith und Bishop 1985; Campbell et al., 1989; Campbell et al., 1991; Gerdes et al., 1988).
Bei gesteigerter Volumenbelastung durch Herzklappeninsuffizienz oder andere Gegebenheiten, bei denen der kardiale Ausstoß vergrößert ist, kommt es zu einer Steigerung der initialen diastolischen Wandspannung. Die Ventrikelwand nimmt proportional zu Ventrikelvolumen und ‐ radius zu, und man spricht von einer exzentrischen Hypertrophie. Sie ist assoziiert mit einer Verlängerung des kontraktilen Apparats relativ zum Myozytendurchmesser durch die Synthese neuer Sarkomere (Gerdes et al., 1988).
Durch die hypertrophe Stimulation von Myozyten kommt es unverzüglich zu einer verstärkten Expression der Transkriptionsfaktoren Egr‐1, c‐fos, c‐jun und c‐Myc. Dabei wird vermutet, dass die Aktivierung dieser so genannten „early response genes“ eine unspezifische Antwort ausdifferenzierter Zellen ist auf die durch Wachstum induzierten Reize anzusprechen (Izumo et al., 1988; Kurabayashi et al., 1988; van Bilsen und Chien 1993). Eine weitere, spezifischere
Reaktion auf hypertrophe Stimuli folgt durch die Re‐Expression von Genen, die während der Embryonalentwicklung im Herzen exprimiert werden. Die Re‐Expression des atrial natriuretic factor (ANF) in den Myozyten ist sowohl in konzentrischer als auch exzentrischer Hypertrophie charakteristisch (Calderone et al., 1995). Andere fetale Gene, wie die Strukturproteine skeletal
muscle α‐actinin und β‐myosin heavy chain, scheinen eher in der konzentrischen Hypertrophie spezifisch höher exprimiert zu werden (Calderone et al., 1995). Analog zur Steigerung der ANF Expression kommt es zu einer Steigerung der Expression des mit ihm nahe verwandten brain natriuretic peptide (BNP) (Hanford et al., 1994). Die Sekretion der Peptid‐Hormone BNP und ANF stellen diagnostisch verwendete Marker der Herzinsuffizienz dar (Dao et al., 2001).
Die Zunahme des Proteingehalts in der Zelle wird vor allem durch den Anstieg der allgemeinen Proteinsynthese verursacht (Sugden und Fuller 1991), während die Proteindegradation weitgehend unverändert bleibt (McDermott und Morgan 1989). Notwendig dafür ist eine Zunahme der Ribosomen, da bereits im nicht hypertrophen Zustand 90% der Ribosomen ausgelastet sind (Morgan et al., 1992; Hannan und Rothblum 1995).
Auch der Zelltod spielt eine bedeutende Rolle in der Herzinsuffizienzentstehung. Kommt es zur Entwicklung einer pathologischen Herzinsuffizienz geht diese häufig mit dem progressiven Untergang von Kardiomyocyten einher. Diese werden teilweise durch Bindegewebe ersetzt, was zu einer Versteifung des Myokards und damit zu einer verminderten diastolischen Füllung und systolischen Pumpfunktion führt. Grundsätzlich unterscheidet man zwischen drei Arten des Zelltods: Apoptose, Autophagie und Nekrose. Die Apoptose wird über zwei zentrale Signalwege vermittelt und ist während der Evolution hoch konserviert. Der intrinsische Signalweg stimuliert die Bindung des Multiprotein Komplexes DISC (death inducing signaling complex), was zur Aktivierung von Procaspase‐8 führt. Die aktivierte Caspase‐8 induziert die proteolytische Spaltung der Procaspase‐3, die anschließend als Caspase‐3 den Zelltod einleitet. Der extrinsische Signalweg wird über die Bindung von Liganden an einen Zelloberflächenrezeptor initiiert, die über Proteine der Bcl‐2‐Familie zu den Mitochondrien transmittiert werden (Crow et al., 2004). Langlebige Proteine und Organellen werden mit Hilfe von Autophagie degradiert. Dieser Prozess ist primär abhängig von den Lysosomen und bewirkt durch den Abbau von Proteinen einen erhöhten Anteil von freien Aminosäuren und Fettsäuren in der Zelle (Dunn 1990). Bei vielen kardiovaskulären Erkrankungen tritt vermehrt Autophagie auf (Decker und Wildenthal, 1980; Shimomura et al., 2001). Ob diese zu direktem Zelltod führt oder eine eher protektive Wirkung auf die Zelle hat, ist noch unklar (Zhu et al., 2007; Hamacher‐Brady et al., 2006). Nekrose ist ein irreversibler Prozess, hervorgerufen durch oxidativen Stress oder toxische Substanzen. Zunächst kommt es zu einem typischen Anschwellen der Zelle. In der Folge stellen sich eine Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes und eine Rekrutierung von Makrophagen ein. Diese schütten entzündliche
Botenstoffe wie den Tumornekrosefaktor (TNF) aus, was zur Apoptose betreffender Zellen führt.
Nach einem Herzinfarkt wird der nekrotische Gewebeteil durch eine bindegewebsartige Narbe ersetzt, was zu entsprechenden Funktionseinschränkungen führt (Eichbaum 1975).
1.3 Die MAPK Signalkaskade
Der MAPK (mitogen‐activated protein kinase) Signalweg reguliert Wachstum, Proliferation, Überleben und Alterung der Zelle als Folge extrazellulärer Signale (Robins und Cobb 1997;
Wellenbrock et al., 2004) und spielt eine bedeutende Rolle bei der Entstehung kardialer Hypertrophie (Sugden und Clerk 1998; Lips et al., 2003; Bueno et al., 2000).
Dieser Signalweg beginnt mit Ras (Rat sarcoma), das an der inneren Plasmamembran lokalisiert ist. Ras ist ein Guanin‐Nukleotid‐bindendes Protein, welches stimulationsabhängig zwischen einem aktiven GTP‐gebundenen und einem inaktiven GDP‐gebundenen Zustand wechselt (Downward, 1996). Die Ras‐Proteinfamilie von Säugern umfasst die vier Proteine H‐Ras, N‐Ras, K‐
(A)Ras und K‐(B)Ras (Barbacid, 1987). Wahrscheinlich kodieren diese Gene Proteine mit nicht redundanten Funktionen. Einen Hinweis darauf liefern die unterschiedlichen Expressionsmuster der Ras Proteine in den verschiedenen Organen und während der Entwicklung. H‐Ras zeigt die höchste Expression in Gehirn, Haut und Muskel, während K‐Ras am höchsten in Darm, Lunge und Thymus, und NRas hauptsächlich in Testis und Thymus exprimiert wird (Leon et al., 1987). Zudem zeigen verschiedene Knockout Studien, dass k‐ras eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung spielen muss (Johnson et al., 1997; Koera et al., 1997), da k‐ras defiziente Mäuse am Entwicklungstag 12.5 sterben, während weder h‐ras noch n‐ras für die Embryonalentwicklung essentiell zu sein scheinen. Auch das gleichzeitige Fehlen von h‐ras und n‐
ras führt weder zu Entwicklungsdefekten noch zu einem postnatalen Phänotyp (Esteban et al., 2001).
Ras ist der übergeordnete Regulator der RAF‐Proteine (rat fibrosarcoma) (Robbins et al., 1994).
Die Bindung von extrazellulären Liganden wie Wachstumsfaktoren, Cytokinen und Hormonen an Zelloberflächenrezeptoren aktiviert Ras. Aktiviertes Ras transloziert RAF zur Plasmamembran, um den Signalweg, der die Änderung des Phosphorylierungsstatus und die Bindung an andere Enzyme und Scaffold Proteine beinhaltet, zu starten (Kolch 2000). Darauf folgend phosphoryliert RAF die dual‐spezifischen Proteinkinasen MEK1/2 (mitogen activated protein kinase) und diese wiederum die Proteine ERK1/2 (extracellular signal regulated kinase). Die Komplexität dieses Signalwegs spiegelt sich in der Vielzahl seiner Komponenten wieder. Es gibt neben den vier beschriebenen Ras‐Genen drei RAF‐Gene (A‐RAF, B‐RAF, C‐RAF), sowie zwei MEK‐ (MEK1, MEK2) und ERK‐ (ERK1 und ERK2) Gene, die Proteine mit nicht redundanten Funktionen kodieren. Desweiteren ist der
Signalweg nicht linear. Durch die Heterodimerisierung von B‐RAF mit C‐RAF ist B‐RAF in der Lage, C‐RAF auf Ras‐unabhängige Weise zu aktivieren (Garnett et al., 2005), (Abb.1.3). Außerdem unterscheiden sich die RAF‐Isoformen unter anderem in ihrer Fähigkeit, MEK zu aktivieren (Marais et al., 1997). B‐RAF besitzt die höchste MEK‐Kinaseaktivität, gefolgt von C‐RAF und A‐RAF (Pritchard et al., 1995). Abhängig vom zellulären Kontext steuert dieser Signalweg diverse biologische Funktionen wie Zellwachstum, Apoptose und Differenzierung überwiegend durch die Regulation von Transkription, Metabolismus und Cytoskelettreorganisation.
Abbildung 1.3 Vereinfachte Darstellung der MAPK Signalkaskade. Durch die Bindung von Wachstumsfaktoren, Cytokinen und Hormonen aktiviert der G‐Protein gekoppelte Rezeptor Ras. Ras aktiviert und phosphoryliert anschließend RAF. Durch die Bildung von Heterodimeren ist aktives B‐RAF in der Lage C‐RAF zu aktivieren. RAF phosphoryliert die dual‐spezifischen Proteinkinasen MEK1/2 und diese wiederum die Proteine ERK1/2. Aktiviertes ERK1/2 transloziert in den Zellkern und bewirkt dort eine Änderung der Genexpression. Abhängig vom Startstimulus steuert dieser Signalweg wichtige Funktionen wie Zellwachstum, Apoptose und Differenzierung der Zelle.
1.4 Die Rolle der MAPK Signalkaskade in kardialer Hypertrophie
Zahlreiche in vitro und in vivo Studien belegen die Bedeutung der MAPK Signalkaskade in der kardialen Hypertrophie.
Ras spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung der kardialen Hypertrophie. Durch Mikroinjektion von aktiviertem Ras Protein in kultivierte Kardiomyocyten kommt es zu einer gesteigerten ANF‐Expression und einer Veränderung der Struktur der Myofibrillen (Thorburn et al., 1993). Beides sind charakteristische Anzeichen einer kardialen Hypertrophie. Dieses Ergebnis wird durch eine herzspezifische Überexpression von konstitutiv aktivem H‐Ras in transgenen Mäusen bestätigt. Sie führt zu kardialer Hypertrophie und diastolischer Dysfunktion des Herzens (Hunter et al. 1995).
Der herzspezifische c‐raf Knockout führt in Mäusen zu Herzdilatationen und Dysfunktion des linken Ventrikels. Weiterhin kann ein erhöhter Anteil apoptotischer Zellen festgestellt werden.
Allerdings entwickeln diese Mäuse keine Hypertrophie und keine erhöhte Letalität. Die Expressionsmuster von Mek und Erk sind unverändert, was darauf hinweist, dass es einen weiteren Aktivator von Mek und Erk geben muss, der den Ausfall von C‐Raf kompensieren kann (Yamaguchi et al., 2004).
Eine herzspezifische Überexpression von Mek1 führt in transgenen Mäusen zu einer kompensierten konzentrischen Hypertrophie. Da die Herzen eine erhöhte Pumpleistung aufweisen, handelt es sich bei diesem Phänotyp um einen kompensierten Zustand der Hypertrophie, der sich nicht zu einer Herzinsuffizienz weiterentwickelt (Bueno et al., 2000).
Die Aktivierung von ERK1/2 kann zahlreiche Vorgänge wie Zellwachstum, Differenzierung und Apoptose auslösen (Reddy et al., 2003). Die Funktion von ERK wird hauptsächlich durch die intrazelluläre Lokalisation bestimmt. Abhängig vom Stimulus wechselt ERK zwischen Zellkern und Zytoplasma. Durch eine mitogene Stimulation akkumuliert aktiviertes ERK für einige Minuten im Zellkern (Pouyssegur et al., 2002), wo es weitere Transkriptionsfaktoren wie beispielsweise Elk‐1 aktiviert (Sharrocks 2001). Ein neu entdeckter Mechanismus, der ERK1/2 involviert, führt ebenfalls zu kardialer Hypertrophie. Über einen komplizierten Prozess autophosphoryliert ERK1/2 an Thr188. Das aktivierte ERK1/2 wandert anschließend in den Zellkern, um dort seine Zielproteine zu aktivieren (Lorenz et al., 2009). Die ERK1/2 Substrate Elk1, Msk1 und c‐Myc, sind an der Entstehung der kardialen Hypertrophie beteiligt (Bueno und Molkentin 2002; Zhong et al., 2006;
Markou et al., 2004).
1.5 Die RAF Proteinfamilie
Alle RAF Proteine zeigen eine ähnliche Architektur mit drei konservierten Regionen (CRs). Zwei davon (CR1 und CR2) befinden sich am N‐Terminus, die dritte (CR3), welche die Kinasedomäne kodiert, befindet sich am C‐Terminus (Abb. 1.5). RAF Proteine unterliegen einer komplexen Regulation, die sich in einer Vielzahl von Phosphorylierungsstellen widerspiegelt. Diese verteilen sich über das gesamte Protein. Ras bindet direkt an die N‐terminale Regulierungsdomäne der RAF Proteine (Wittinghofer und Nassar 1996), wenn es selbst in der aktiven, GTP gebundenen Form vorliegt. Die Bindung von Ras erfolgt an die sogenannte Ras binding domain (RBD). Diese formt anschließend eine sekundäre Interaktion mit der Cystein‐reichen Domäne (CRD) aus, die sich ebenfalls in CR1 befindet. Die vier bekannten Ras Proteine (HRas, NRas, K(A)Ras, K(B)Ras) binden mit unterschiedlicher Affinität an die RBD der individuellen RAF Proteine (Weber et al., 2000).
Auch wenn die Bedeutung dieser Unterschiede noch nicht klar ist, weist dies auf eine unterschiedliche Regulation der RAF Isoformen hin. Die Fähigkeit von Ras an RAF zu binden, wird durch weitere Signalmoleküle wie 14‐3‐3 gesteuert. Dieses dimere Adaptorprotein bindet eine Vielzahl von Proteinen abhängig von deren Phosphorylierungsstatus (Tzivion und Avruch 2002). Es bindet an die CR2‐Domäne von C‐RAF, wenn dieses an S259 phosphoryliert ist. Diese Bindung von 14‐3‐3 vermittelt die Bindung an Ras (Dhillon et al., 2002; Light et al., 2002) und B‐RAF (Avruch et al., 2001). Ras‐GTP ist in der Lage die Bindung von 14‐3‐3 an die CR2 Domäne in vitro wieder zu zerstören (Clark et al., 1997; Rommel et al., 1996). RBD und CRD sind hoch konserviert in allen RAF Isoformen.
Abbildung 1.5 Struktur der RAF Proteine. Die RAF Isoformen A‐RAF, B‐RAF und C‐RAF haben 3 konservierte Regionen gemeinsam: CR1 (gelb), CR2 (orange) und CR3 (rot). CR1 enthält die Ras Bindungsdomäne (RBD) und die Cystein‐reiche Domäne (CRD), die beide für die Rekrutierung zur Membran benötigt werden. CR2 enthält die 14‐3‐3 Bindungsdomäne. CR3 enthält die katalytische Domäne mit dem Aktivierungssegment.
Die sogenannte negative charged regulatory region oder N‐Region liegt vor der CR3 Region und ist in allen RAF Isoformen konserviert.
A‐RAF ist mit 69 kDa die kleinste der drei Isoformen. C‐RAF ist 72‐74 kDa groß und B‐RAF unterliegt alternativem spleißen was zu verschiedenen Proteinen führt, deren Größe zwischen 75‐
100 kDa variiert (Barnier et al., 1995; Storm et al., 1990). RAF mRNA wird ubiquitär exprimiert, wobei A‐RAF sowohl in embryonalem und adultem Mausgewebe exprimiert wird (Luckett et al., 2000). B‐RAF wird ebenfalls in allen Mausgeweben hoch exprimiert, allerdings in den meisten Geweben niedriger als in neuronalen Geweben.
Genetische Studien an Mäusen haben gezeigt, dass RAF Proteine während der Entwicklung nicht redundante Funktionen steuern. A‐raf defiziente Knockout Mäuse überleben zwar die Geburt, sterben aber 7‐21 Tage danach an neurologischen und gastrointestinalen Defekten (Pritchard et al., 1996). Dagegen sterben b‐raf und c‐raf defiziente Mausembryonen in utero zwischen Tag 10.5 und 12.5 der Embryonalentwicklung (Wojonowski et al., 1997; Hüser et al., 2001; Mikula et al., 2001). Die b‐raf defizienten Embryonen zeigen Wachstumsverzögerungen und vaskuläre sowie neuronale Defekte. C‐raf defiziente Embryonen sterben offenbar an massiver Apoptose in der Leber. Die fehlende Kompensation der RAF Proteine in der Maus untereinander scheint nicht die Folge von unterschiedlichen Expressionsmustern zu sein, was impliziert, dass den Isoformen individuelle Funktionen zufallen.
Die Phosphorylierung spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung der RAF Proteine. Der Fokus der Untersuchungen lag bis jetzt auf C‐RAF, daher ist das Verständnis der Aktivierung von C‐RAF nahezu vollständig. Einige Phosphorylierungsstellen inhibieren die C‐RAF Aktivität (Dumaz et al., 2001). Diese Stellen werden durch die Protein Kinase A (PKA) angesprochen (Dumaz und Marais 2003) einer Cyclin‐abhängigen Kinase (Mischak et al., 1996). Steigt der cAMP Spiegel in der Zelle werden drei Phosphorylierungsstellen aktiviert: S43, S233 und S259 (Dhillon et al., 2002; Wu et al., 1993; Sidovar et al., 2000; Dumaz et al., 2001; Dumaz und Marais 2003). Die Phosphorylierung von S43 scheint die Bindung des N‐Terminus von C‐RAF an Ras sterisch zu hindern (Wu et al., 1993). Fünf Phosphorylierungsseiten innerhalb und in unmittelbarer Nähe der Kinasedomäne stimulieren die C‐RAF Aktivität. Zwei wichtige Phosphorylierungsstellen, S338 und Y341, liegen in der N‐terminalen CR3 Region (King et al., 1998; Marais et al., 1995; Fabian et al., 1993, Mason et al., 1999). Dort liegen sie in einer Subdomäne, der N‐Region. Die negative Ladung innerhalb dieser N‐Region ist essentiell für die C‐RAF Kinaseaktivität (Mason et al., 1999). Eine Phosphorylierung beider Reste hebt die inhibierende Funktion der N‐Region auf die Kinasedomäne auf (Avruch et al., 2001; Wellenbrock et al., 2004). SRC (sarcoma) Kinasen sind in der Lage Y341 in vitro und in Zellkultur zu phosphorylieren (Marais et al., 1995; Marais et al., 1997; Fabian et al., 1993, Chow et al., 1995; King et al., 2001; Tilbrook et al., 2001). Zwei weitere Phosphorylierungsstellen T491 und S494 liegen innerhalb der Kinasedomäne in dem sogenannten Aktivierungssegment. Mutationen in diesem Bereich lassen die Kinaseaktivität vollständig zum erliegen kommen (Chong et al.,
2001). Analog zu B‐RAF wird vermutet, dass die Phosphorylierung von T491 die Aktivierung durch die Trennung der Interaktion von Glycin‐reichem Loop und Aktivierungssegment sterisch begünstigt (Wan et al., 2004). Abschließend ermöglicht die Phosphorylierung von S621 im C‐
Terminus von C‐RAF die Bindung des 14‐3‐3 Adaptorproteins (Light et al., 2002; Jaumot und Hancock 2001; Tzivion et al., 1998; Yip‐Schneider et al., 2000). Dieser Schritt ist ebenfalls für die Aktivierung von C‐RAF notwendig (Avruch et al., 2001; Wellenbrock et al., 2004). Die Bindung von 14‐3‐3 an diese konservierte Region scheint die Formation eines C‐RAF/B‐RAF Heterodimers herbeizuführen (Weber et al., 2000). In B‐RAF ist diese konservierte Region im C‐Terminus verantwortlich für die Kupplung der Signale zu MEK (MacNicol et al., 2000). Die Bindung von 14‐3‐
3 an diese Region der RAF Isoformen scheint unterschiedlich und dynamisch reguliert (Hekman et al., 2004). Kinasen die für diese Phosphorylierungsstelle zuständig sein könnten, wurden bis jetzt noch nicht entdeckt.
Bei der Phosphorylierung zeigen sich deutliche Unterschiede zwischen den RAF Isoformen. Die fünf Phosphorylierungsstellen, die für die vollständige C‐RAF Aktivität benötigt werden, sind auch in A‐RAF konserviert. Daher wird vermutet, dass A‐RAF durch einen ähnlichen Mechanismus aktiviert wird wie C‐RAF (Marais et al., 1997). B‐RAF weist dagegen deutliche Unterschiede auf.
Zum einem sind nur vier der fünf aktivierenden Phosphorylierungsstellen konserviert und nur drei von ihnen scheinen über eine ähnliche Funktion zu verfügen. S728 aus B‐RAF entspricht S621 in C‐
RAF und vermittelt ebenfalls die Bindung des Adaptorproteins 14‐3‐3 an den C‐Terminus von B‐
RAF. Wie in C‐RAF sind die Phosphorylierungsstellen des Aktivierungssegments T598 und S601 in B‐RAF notwendig für die Aktivierung (Zhang und Guan, 2000). Der deutlichste Unterschied von B‐
RAF zu den anderen beiden RAF Isoformen befindet sich in der N‐Region. B‐RAF fehlt eine Phosphorylierungsstelle äquivalent zu Y341 aus C‐RAF. Das Äquivalent zu der zweiten Phosphorylierungsstelle S338 ist konserviert in B‐RAF (S445) aber konstitutiv phosphoryliert (Mason et al., 1999). Während die N‐Region von A‐RAF und C‐RAF phosphoryliert werden muss um eine negative Ladung zu erhalten, die für die vollständige Aktivität beider Isoformen notwendig ist trägt die N‐Region von B‐RAF durch die konstitutive Phosphorylierung eine konstante negative Ladung. Somit besitzt B‐RAF eine starke basale Kinaseaktivität im Gegensatz zu C‐RAF (Mason et al., 1999). B‐RAF benötigt zusätzlich nur die Ras vermittelte Aktivierung während C‐RAF und A‐RAF auf weitere Signale von Tyrosin Kinasen wie z.B. SRC und anderen unbekannten Kinasen angewiesen sind. Wahrscheinlich ist genau diese konstitutive Phosphorylierung in der N‐Region und die damit verbundene starke basale Aktivität dafür verantwortlich, dass B‐RAF in vielen Krebsarten mutiert ist während Mutationen in A‐RAF und C‐
RAF extrem selten sind (Emuss et al., 2005).
1.6 Die Bedeutung von B‐RAF
In den letzten Jahren rückte B‐RAF weiter in den Fokus des Interesses, allerdings blieben viele Fragen bislang ungeklärt. B‐RAF könnte eine weitaus wichtigere Rolle spielen, als bislang angenommen. Eine Vielzahl von Studien deutet darauf hin, dass B‐RAF der Hauptaktivator von MEK1/2 in Zellen sein könnte (Jaiswal et al., 1994; Catling et al., 1994; Wojnowski et al., 2000;
Pritchard et al., 2004).
B‐RAF ist in der Lage C‐RAF im Cytosol auf Ras unabhängige weise zu aktivieren. Dafür benötigt C‐
RAF die Phosphorylierung des Aktivierungssegments (T491, S494) und die Bindung des Adaptorproteins 14‐3‐3. Unter basalen Bedingungen besitzt B‐RAF eine geschlossene Konformation, wodurch die Bindung an C‐RAF sterisch verhindert wird. Die intramolekulare Interaktion eines Glycin‐reichen Loops mit dem Aktivierungssegment von B‐RAF hält es in einer inaktiven Konformation (Wan et al., 2004). Durch eine Phosphorylierung im Aktivierungssegment von B‐RAF nimmt es seine offene Konformation an und die 14‐3‐3 abhängige Bindung an C‐RAF wird ermöglicht. Die benötigte Phosphorylierung des Aktivierungssegments von C‐RAF ist abhängig von der B‐RAF Kinaseaktivität. Daher wird vermutet, dass B‐RAF die Phosphorylierung des Aktivierungssegments von C‐RAF entweder direkt oder indirekt durch die Rekrutierung weiterer Kinasen steuert (Avruch et al., 2001). Anders als bei einer Aktivierung durch Ras scheint die N‐Region nicht wichtig für die Aktivierung von C‐RAF durch B‐RAF (Garnett et al., 2004).
Obwohl alle drei RAF Isoformen in der Lage sind MEK1/2 in vitro zu aktivieren (Marais et al., 1997), bindet und phosphoryliert B‐RAF MEK1/2 effizienter als A‐RAF und C‐RAF (Marais et al., 1997; Papin et al., 1996). Eine induzierbare Form von B‐RAF stimuliert außerdem zuverlässiger und konstanter die ERK Phosphorylierung als gleiche C‐RAF und A‐RAF Konstrukte (Pritchard et al., 1995). Eine Studie von Zellfraktionen zeigt, dass B‐RAF und nicht C‐RAF die hauptsächliche MEK Kinase in Zellen ist (Jaiswal et al., 1994; Catling et al., 1994). Der Abbau von B‐RAF in Hirnlysaten führt zu einem 96%igen Verlust von Ras assoziierter MEK Aktivierung (Jaiswal et al., 1994).
Zusätzlich weisen embryonale b‐raf‐/‐ Mausfibroblasten eine stark reduzierte ERK Aktivität auf (Wojnowski et al., 2000), während die ERK Aktivität in c‐raf‐/‐ und a‐raf‐/‐ Fibroblasten weitgehend normal bleibt (Hüser et al., 2001; Mikula et al., 2001, Mercer et al., 2002). Die ERK Aktivierung durch Wachstumsfaktoren ist in b‐raf defizienten Fibroblasten der Maus stark eingeschränkt (Pritchard et al., 2004). Dies weist darauf hin, dass B‐RAF diejenige RAF Isoform ist, die hauptsächlich die Signale in der Zelle an ERK weiterleitet.
1.7 Zielsetzung der Arbeit
In über 25 Jahren Forschung auf dem Gebiet der MAPK Signalkaskade und der RAF Proteine wurde der primäre Fokus bis jetzt auf C‐RAF gelegt. Aber es ist wichtig zu erkennen, dass alle drei RAF‐Isoformen wichtige Vermittler der zellulären Antwort auf extrazelluläre Signale sind, da ihnen nicht redundante Aufgaben zufallen. Lange Zeit wurde angenommen, dass das Signal von Ras sowohl an B‐RAF und C‐RAF weitergeleitet wird, und diese unabhängig voneinander MEK1/2 aktivieren. Mittlerweile zeigen neue Ergebnisse das B‐RAF eine weitaus wichtigere Rolle spielen könnte als bislang angenommen. Daher ist die genauere Untersuchung der Rolle von B‐RAF in der Entstehung kardialer Hypertrophie sehr interessant und kann neue Ansatzpunkte für das Verständnis und die Therapie von Herz‐Kreislauferkrankungen liefern.
1. Bisher ist die Bedeutung von B‐RAF in Kardiomyocyten nahezu nicht untersucht. Daher galt zu beweisen, dass B‐RAF ein essentieller MEK1/2 Aktivator in Kardiomyocyten ist und dass B‐RAF eine wichtige Rolle in der Entstehung kardialer Hypertrophie spielt.
2. Mit Hilfe eines genomweiten cDNA Library Screen können neue Modulatoren der B‐
RAF/MEK Interaktion ermittelt werden. Diese sollen anschließend auf ihre Relevanz in der kardialen Hypertrophie untersucht werden.
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien
Chemikalie Bezugsquelle
Aceton Sigma‐Aldrich, München
Agar Agar Carl Roth, Karlsruhe
Agarose, low melting GQT Severn Biotech, Kidderminster, UK Agarose Sea Plaque® GTG Biozym Scientific, Oldendorf
Albumin Fraktion V Sigma‐Aldrich, München
Ammoniumpersulfat Sigma‐Aldrich, München
Antibiotic/Mycotic‐Solution Invitrogen, Karlsruhe
Aprotinin Roche, Mannheim
Bacto‐Trypton Carl Roth, Karlsruhe
Bromphenolblau‐Natriumsalz AppliChem, Darmstadt
Carbenicillin Carl Roth, Karlsruhe
Carnitin Hydrochlorid Sigma‐Aldrich, München
Cäsiumchlorid Carl Roth, Karlsruhe
Cytosine β‐D‐arabinoturanoside hydrochloride Sigma‐Aldrich, München
Chloroform Merck, Darmstadt
Chloramphenicol Sigma‐Aldrich, München
Creatin anhydrous Sigma‐Aldrich, München
Cytosin‐‐D‐arabinofuranosid Hydrochlorid Sigma‐Aldrich, München Diethylpyrocarbonat (DEPC) Carl Roth, Karlsruhe
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt
Dithiothreitol (DTT) Merck, Darmstadt
dNTPs (100 mM) Invitrogen, Karlsruhe
DPBS Invitrogen, Karlsruhe
Essigsäure Merck, Darmstadt
Ethanol Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Sigma‐Aldrich, München
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Serva, Heidelberg Ethylenglycoltetraessigsäure (EGTA) Sigma‐Aldrich, München
Chemikalie Bezugsquelle
Fetales Kälberserum (FCS) Biochrom, Berlin
Formalin Merck, Darmstadt
FuGENE®6 Transfection Reagent Roche, Mannheim
Gelantine Sigma‐Aldrich, München
Glukose (Dextrose) AppliChem, Darmstadt
Glutaminsäure D‐ ,L‐ Sigma‐Aldrich, München
Glutaraldehyd Sigma‐Aldrich, München
Glycerol Merck, Darmstadt
β‐Glycerolphosphat Sigma‐Aldrich, München
Hefeextrakt Carl Roth, Karlsruhe
Heparin‐Natrium Ratiopharm, Ulm
IGEPAL CA‐630 Sigma‐Aldrich, München
Isopropanol Sigma‐Aldrich, München
Isopropyl‐β‐D‐thiogalactopyranosid Biomol, Hamburg
Kaliumchlorid Sigma‐Aldrich, München
Kanamycin Sigma‐Aldrich, München
Kalziumchlorid Sigma‐Aldrich, München
Kollagenase CLS‐2 Biochrom, Berlin
Laminin Sigma‐Aldrich, München
Leupeptin Biomol, Hamburg
β‐Mercaptoethanol Sigma‐Aldrich, München
Methanol Merck, Darmstadt
Natriumcarbonat Sigma‐Aldrich, München
Natriumchlorid Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat (SDS) AppliChem, Darmstadt
Natriumfluorid Sigma‐Aldrich, München
Natriumhydrogencarbonat Sigma‐Aldrich, München
Natriumhydroxid Merck, Darmstadt
Natriumorthovanadat Sigma‐Aldrich, München
Natriumpyrophosphat Sigma‐Aldrich, München
Paraformaldehyd Sigma‐Aldrich, München
Penicillin/Streptomycin Sigma‐Aldrich, München
Pepstatin Biomol, Hamburg
Phenol Invitrogen, Karlsruhe
Chemikalie Bezugsquelle
Phenylephrine hydrochloride Sigma‐Aldrich, München Phenylmethylsulfonylfluorid Sigma‐Aldrich, München Polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween20) Bio‐Rad Laboratories, München
Ponceau‐Lösung Sigma‐Aldrich, München
Rinderserumalbumin Sigma‐Aldrich, München
Röntgen Superfix Tetenal AG, Norderstedt
Roti®‐Blue Carl Roth, Karlsruhe
Rotiphorese® Gel 30 Carl Roth, Karlsruhe
Salzsäure Carl Roth, Karlsruhe
SuperFect®Transfection Reagent Qiagen, Hilden
Taurin Sigma‐Aldrich, München
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma‐Aldrich, München Trishydroxymethyl‐aminoethan (Tris‐Base) Carl Roth, Karlsruhe
Triton X‐100 Merck, Darmstadt
Trypsin Biochrom, Berlin
Vecta Shield ohne DAPI VectorLab, Burlingame, USA
XRay‐Developer LX24 Kodak, Darmstadt
Xylenxyanol FF Sigma‐Aldrich, München
Xylol Sigma‐Aldrich, München
2.2 Enzyme
Enzym Bezugsquelle
Alkaline Phosphatase Claf Intestinal (CIAP) Promega, Mannheim
Collagenase Typ II Worthington, Lakewood, USA
DNase, RNase‐free Qiagen, Hilden
Fast‐LinkTM DNA‐Ligase Biozym Scientific, Oldendorf Gateway®BP ClonaseTM Enzyme Mixtures Invitrogen, Karlsruhe Gateway®LR ClonaseTM Enzyme Mixtures Invitrogen, Karlsruhe iScriptTM Reverse Transkriptase Biozym Scientific, Oldendorf Mango Taq DNA‐Polymerase Bioline, Luckenwalde
PfuUltra Hotstart DNA‐Polymerase Agilent Technologies, Santa Clara, USA
Enzym Bezugsquelle
Proteinase K Invitrogen, Karlsruhe
Restriktionsenzyme Promega, Mannheim
RNase A Roche, Mannheim
Shrimp Alkaline Phosphatase Promega, Mannheim
2.3 Gebrauchswaren
Gebrauchsware Bezugsquelle
2 well Lab‐TekTM Chamber Slides PermanoxTM Nunc, Wiesbaden
6 well Zellkulturschalen Greiner Bio‐One, Frickenhausen 24 well Zellkulturschalen Nunc, Wiesbaden
96 well RealTime‐PCR‐Platten Bio‐Rad Laboratories, München
96 well twin.tec PCR Platten Eppendorf, Hamburg
96 well Microtiterplatten, klar Nunc, Wiesbaden
96 well Kollektionsplatten 5prime, Hamburg 96 well deepwell Kulturplatten 5prime, Hamburg
Blottingpapier GB 003 Schleicher & Schüll, Dassel Elektroporationsküvetten Biozym Scientific, Oldendorf
Filterplatte A 5prime, Hamburg
Filterplatte DB 5prime, Hamburg
Nitrozellulose Transfer Membran Whatman, Dassel
Petrischalen Greiner Bio‐One, Frickenhausen
Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht
Küvetten, UVette Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg
Röntgenfilme, Super RX Fujifilm GmbH, Düsseldorf
Sterilfilter Millipore Corporate, Billerica, USA
Zellkulturflaschen Greiner Bio‐One, Frickenhausen
Zellkulturplatten Sarstedt, Nümbrecht
Zellschaber Sarstedt, Nümbrecht
2.4 Geräte
Geräte Bezugsquelle
BioPhotometer Eppendorf, Hamburg
Centrifuge 5415 R Eppendorf, Hamburg
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Hamburg
Easyjec T Elektroporationsgerät Wolf Laboratories Limited, York, England Evolution RC Superspeed Centrifuge Sorvall, Newtown, USA
epMotion 5075 Eppendorf, Hamburg
Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200 Carl Zeiss, Hamburg
Gelelektrophoresekammer SDS‐PAGE Bio‐Rad Laboratories, München
iQ5TM Multicolor Real‐Time PCR Detection System Bio‐Rad Laboratories, München
L‐70 Ultracentrifuge Beckman Coulter, Brea, USA
Lichtmikroskop Carl Zeiss, Hamburg
Mithras LB 940 Multimode Reader Berthold Technologies, Bad Wildbad Multi Image Light Cabinet AlphaInnotech Inc., San Leandro, USA µQuant Universal Microplate‐Spektralphotometer Bio‐Tek Instruments Inc., Winooski, USA
2.5 Gebrauchsfertige Reaktionssysteme
Reaktionssystem Bezugsquelle
BCATM Protein Assay Kit Pierce Biotechnology, Rockfort, USA B‐Raf Kinase Assay Kit Millipore Corporate, Billerica, USA BLOCK iTTMPol II miR RNAi Expression Vector Kit Invitrogen, Karlsruhe
Check‐MateTM Mammalian Two Hybrid System Promega, Mannheim Dual Luciferase® Reporter Assay System Promega, Mannheim HiSpeed® Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden
iQTM SYBR Green Supermix Bio‐Rad Laboratories, München
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden
Quick change II XL Mutagenesis Kit Agilent Technologies, Santa Clara, USA
Reaktionssystem Bezugsquelle
Ras Activation Assay Kit Upstate, Lake Placid, USA Perfectprep® Plasmid 96 Vac Direct Bind Kit 5prime, Hamburg
RNeasy® Fibrous Tissue Mini Kit Qiagen, Hilden
RNeasy® Mini Kit Qiagen, Hilden
SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Pierce Biotechnology, Rockford, USA
Substrate
ImmobilonTM Western Chemiluminescent Millipore Corporate, Billerica, USA Substrate
2.6 Sterilisation
Die Sterilisation von Lösungen und Kulturmedien erfolgte im Dampfdruckautoklaven bei 121°C und 1,5 Bar. Gebrauchswaren wurden autoklaviert oder über Nacht bei 220°C hitzesterilisiert.
Hitzeempfindliche Lösungen wurden steril‐filtriert (Porengröße 0,2 µm).
2.7 Puffer und Stammlösungen
Puffer und Stammlösungen Zusammensetzung
Carbenicillin‐Stammlösung 100 mg Carbenicillin/ml in H2O
Chloramphenicol‐Stammlösung 30 mg Chloramphenicol/ml in Methanol
DEPC‐H2O 0,1% (v/v) Diethylpyrocarbonat
Inkubation für 24 Stunden unter Rühren mit anschließender Dampfdrucksterilisation
Kanamycin‐Stammlösung 50 mg Kanamycin in H2O
Kollagenaselösung 60 mM Taurin
8 mM D‐, L‐Glutaminsäure
2 mM D‐, L‐Carnitin
Puffer und Stammlösungen Zusammensetzung
1,3 mg/ml Collagenase II
26 µg/ml Protease XIV
0,025 mM CaCl2
in 1x Thyrodepuffer ohne Ca2+
pH 7,54
Ladepuffer für PCR‐Produkte 40% Sucrose
1 mM EDTA
0,05% Bromphenolblau
0,05% Xylenxyanol FF
Lämmli‐Ladepuffer 312,5 mM Tris/HCL pH 6,8
50% Glycerol
10% SDS
150 mM DTT
5 mM EDTA
0,05% Bromphenolblau
Lysepuffer für Zellen/Gewebe 1% (v/v) NP 40
10% (v/v) Glycerol
137 mM NaCl
20 mM Tris pH 7,4
10 mM EDTA pH 8,0
1 mM EGTA pH 7,0
20 mM NaF
1 mM Natrium‐Orthovanadat
1 mM Natrium‐Pyrophosphat
50 mM ‐Glycerophosphat
4 µg/ml Aprotinin
4 µg/ml Leupeptin
4 µg/ml Pepstatin A
1 mM PMSF
Puffer und Stammlösungen Zusammensetzung
NP40‐Lysepuffer 100 mM Tris pH 7,4
150 mM NaCl
1% (v/v) NP‐40
20 mM NaF
50 mM β‐Glycerolphosphat
5 µg/ml Aprotinin
5 µg/ml Leupeptin
5x SDS‐PAGE‐Laufpuffer 125 mM Tris Base
96 mM Glycin
0,5% (w/v) SDS
Ras‐Aktivierungs‐Assay‐Lysepuffer 125 mM HEPES pH 7,5
750 mM NaCl
5% IGEPAL
10% Glycerol
50 mM MgCl2
5 mM EDTA
4 µg/ml Aprotinin
4 µg/ml Leupeptin
20 mM NaF
1 mM Natrium‐Orthovanadat
Sammelgelpuffer 0,5 M Tris/HCl pH 6,8
0,4% (w/v) SDS
Sucrosepuffer 10 mM Tris
2 mM MgCl2
4% (w/v) Sucrose pH 8,0
5x TBE‐Puffer 445 mM Tris/HCl pH 8,0
445 mM Borsäure
10 mM EDTA
Puffer und Stammlösungen Zusammensetzung
10x TBS 0,2 M Tris
2 M NaCl
pH 7,5
1x TE‐Puffer 10 mM Tris‐HCl pH 8,0
1 mM EDTA
1x Transferpuffer 25 mM Tris
150 mM Glycin
20% (v/v) Methanol
pH 8,3
10x Thyrodepuffer 137 mM NaCl
5,4 mM KCl
1,2 mM MgSO4
1,2 mM Na2HPO4
20 mM HEPES
1x Thyrodepuffer ohne Kalzium 10% 10x Thyrodepuffer
2,7 g/l Glukose
1% 100x Penicillin/Streptomycin
1x Thyrodepuffer mit Kalzium 1 M CaCl2 in Thyrodepuffer ohne Ca2+
1x Transferpuffer (Western‐Blot) 25 mM Tris
150 mM Glycin
20% (v/v) Methanol
pH 8,3
Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl pH 8,8
0,4% (w/v) SDS
2.8 Nährmedien
2.8.1 Nährmedien für Escherichia Coli
Medium Zusammensetzung
LB (Luria‐Bertani)‐Medium 10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
SOC‐Medium 2,0% Trypton
0,5% Hefeextrakt
10 mM NaCl
2,5 mM KCl
10 mM MgSO4
nach dem Autoklavieren:
10 mM MgCl2 (steril‐filtriert)
20 mM Glukose (steril‐filtriert)
Die Nährmedien wurden mit bidestilliertem Wasser angesetzt, autoklaviert und bei 4°C aufbewahrt. Zusätze für die Selektion wurden nach dem Autoklavieren zugegeben. Der jeweiligen Resistenz entsprechend wurde Carbenicillin (Endkonzentration: 100 µg/ml), Chloramphenicol (Endkonzentration: 30 µg/ml) oder Kanamycin (Endkonzentration: 50 µg/ml) zugegeben. Für Agarplatten wurde 1,5% Agar‐Agar beigemengt.
2.8.2 Nährmedien für eukaryotische Zellkultur
Die zur Kultur eukaryotischer Zellen verwendeten Medien wurden als sterile Lösungen oder Pulver bezogen und vor Gebrauch mit folgenden Komponenten (siehe unten) versetzt. Für die Langzeitlagerung von Zellen wurde Gefriermedium benutzt.
Medium Zusammensetzung /Hersteller
Medium für HeLa und QBI‐HEK293A Zellen basal Iscove Medium (Biochrom AG, Berlin)
8% FKS
100 U/ml Antibiotic/Antimycotic Solution
Medium für COS7 und NIH3T3 Zellen DMEM (Invitrogen, Karlsruhe)
10% FCS
1% (v/v) Penicillin/Streptomycin Lösung
Medium für neonatale Kardiomyocyten 4 Teile DMEM (Sigma‐Aldrich, München)
1 Teil M199, Sigma‐Aldrich
1% (v/v) Penicillin/Streptomycin Lösung 1% (v/v) L‐Glutamin
Medium für adulte Kardiomyocyten M199 (Sigma‐Aldrich, München)
1% (v/v) Penicillin/Streptomycin Lösung
1% (v/v) L‐Glutamin
5 mM Taurin 5 mM D‐, L‐Carnitin 5 mM Creatin
2.9 Biologisches Material
2.9.1 Bakterienstämme
Bakterienstamm Bezugsquelle
Escherichia coli DH5 (Hanahan, 1983) Invitrogen, Karlsruhe
Escherichia coli XL1‐blue Agilent Technologies, Santa Clara (USA) Escherichia coli One Shot® ccdB survival 2 T1 Invitrogen Karlsruhe
Escherichia coli One Shot® Top 10 Invitrogen, Karlsruhe
2.9.2 Eukaryotische Zelllinien
Zelllinie Bezugsquelle
COS‐7 LGC Prochem, London, England
NIH3T3 ATCC, Rockville, USA
HeLa (Scherer et al., 1953) DSMZ, Braunschweig QBI‐HEK‐293A (Graham et al., 1977) Microbix, Toronto, Canada
2.9.3 Adenoviren
Adenovirus biologische Aktivität
Ad‐Balt‐CMV gal (lacZ) 5,4x1010 Pfu/ml
Ad‐GAL4‐Mek1 8,84x1010 Pfu/ml
Ad‐pG5luc 6,43x1010 Pfu/ml
Ad‐Raf‐BXB (Klesse et al., 1999)
zu Verfügung gestellt von Dr. Luis Parada
2,07x1010 Pfu/ml
Ad‐Rcn1 1,26x1011 Pfu/ml
Ad‐Rcn1‐miR2 3,71x1011 Pfu/ml
Ad‐Rcn1‐miR3 1,59x1011 Pfu/ml
Ad‐Pkm2 1,56x1011 Pfu/ml
Ad‐VP16‐BRaf 1,11x1011 Pfu/ml
2.9.4 Antikörper
Primärantikörper Bezugsquelle
anti‐α Actinin (Sarcomeric), monoklonaler Antikörper (#A7811), Maus
Sigma‐Aldrich, München
anti‐GAPDH, monoklonaler Antikörper, Maus Biotrend Chemikalien, Köln
anti‐MEK1/2, polyklonaler Antikörper (#9122), Kaninchen
New England Biolabs GmbH, Bad Schwalbach
anti‐phospho‐MEK1/2, polyklonaler Antikörper (#9154), Kaninchen
New England Biolabs GmbH, Bad Schwalbach
anti‐B‐RAF (L12G7), monoklonaler Antikörper (#9434), Maus
Cell Signaling Technology, Danvers, USA
anti‐KSR1, monoklonaler Antikörper (611511), Maus
BD Biosciences, San Jose, USA
anti‐Raf1, polyklonaler Antikörper (sc‐133), Kaninchen
Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg
anti‐Ras, Clone Ras 10, monoklonaler Antikörper (05‐516), Maus
Millipore Corporate, Billerica, USA
anti‐Rcn1, polyklonaler Antikörper (A300‐407A), Kaninchen
Bethyl Laboratories, Montgomery, USA
Sekundärantikörper Bezugsquelle
Anti‐mouse IgG, Horseradish peroxidase‐
linked whole Antibody (Schaf)
Amersham Biosciences, Freiburg
Anti‐mouse IgG Cy3‐linked Antibody (Ziege) Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA
Anti‐rabbit IgG Horseradish peroxidase‐linked whole Antibody (Esel)
Amersham Biosciences, Freiburg
2.9.5 DNA‐Plasmide
Plasmid/Vektor Bezugsquelle
pBHGfrtΔE1,3FLP Microbix, Toronto, Kanada
pDC511 Microbix, Toronto, Kanada
pDC515 Microbix, Toronto, Kanada
pDC516 Microbix, Toronto, Kanada
pACT Promega, Mannheim
pBIND Promega, Mannheim
pG5luc Promega, Mannheim
pcDNA™6.2‐GW/miR Invitrogen, Karlsruhe
pDONR221 Invitrogen, Karlsruhe
2.9.6 DNA‐Konstrukte
Konstrukt Datenbank‐Nr. Insertposition Primer Enzyme
pACT‐BRAF NM_004333.4
120‐2340 B‐RAF (Human)
BRAF‐BamHI‐f BRAF‐EcoRV‐r2
BamHI / EcoRV
pACT‐CRaf NM_029780
426‐2380 C‐Raf (Maus)
CRaf‐EcoRV‐f CRaf‐KpnI‐r
EcoRV / KpnI
pACT‐CRAF‐BXB NM_002880.3 1324‐2469 C‐RAF (Human)
CRAF‐BXB‐BamHI‐f CRAF‐BXB‐XbaI‐r
BamHI / XbaI
pBIND‐Mek1 NM_008927.3 312‐1502 Mek1 (Maus)
Mek1‐BamHI‐f Mek1‐KpnI‐r
BamHI / KpnI
pDC511‐pG5luc AF264724
37‐3128 Luciferase aus pG5luc
pG5luc‐SacI‐f pG5luc‐SalI‐r
SacI /SalI
pDC515‐VP16‐
BRAF
NM_004333.4 120‐2340
VP16‐BRAF aus pACT‐BRAF
pAct‐BRAF‐NheI‐AS pAct‐BRAF‐NheI‐S
NheI
pDC515‐Gal4‐
Mek1
NM_008927.3 312‐1502
Mek1 Gal4 aus pBIND‐Mek1
pAct‐BRAF‐NheI‐AS pAct‐BRAF‐NheI‐S
NheI
pDC516‐CfB‐Rcn1
NM_009037.2 107‐1103
Rcn1 (Maus) aus pcDNA‐
DEST40
BxP Klonase
Konstrukt Datenbank‐Nr. Insertposition Primer Enzyme
pDONR221‐Rcn1 NM_009037.2 107‐1103 Rcn1 (Maus) aus pcDNA‐
DEST40
LxR Klonase
pDC515‐Pkm2 NM_011099.2 52‐1665
Pkm2 (Maus) aus CMV‐Sport6
EcoRI
pDC516‐CfB Gateway Kassette EcoRI
2.9.7 Synthetische Oligonukleotide
Die verwendeten Oligonukleotide wurden von den Firmen Eurofins MWG Operon oder Sigma‐
Aldrich bezogen, mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 100 µM eingestellt und als Stocklösung bei ‐20°C gelagert.
Oligonukleotid Sequenz (5’‐3’)
18S-RT-f CGAAAGCATTTGCCAAGAAT
18S-RT-r GAGGTTTCCCGTGTTGAGTC
Ankr13a‐RT‐f CCGAGACTACCACAACACGTC
Ankr13a‐RT‐r GTGAACTCCCACTTCATCTGC
attR‐f CACATTATACGAGCCGGAAGCAT
attR‐r CAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCG
BRAF‐BamHI‐f CGGATCCACGGGGACATGGAG
BRAF‐EcoRV‐f CATGGAGCAGAAGCTGATATC
BRAF‐EcoRV‐r2 GCAAGATATCGAGCTTAGTGA
BRaf‐RT‐f AATTTGGTGGAGAGCATAACC
BRaf‐RT‐r CAAAAGCTGCTGTTCTCTTTG
BRAF‐Seq TTTGAACAGTTGTCTGGGTCC
BRAF‐Seq1 CTCTCTGCCGAAAATCAACAG
BRAF‐XbaI‐r TTCCTTTTCTAGATACTCTCCTG
Calsequestrin‐mouse‐f AAGACCCAGTGGAGATCGTG
Calsequestrin‐mouse‐r TGACATTGGGCTCATCCATA
CRaf‐EcoRV‐f TTAAACGATATCAATGGAGCACA
Oligonukleotid Sequenz (5’‐3’)
CRaf‐KpnI‐r ACAGGTACCTCATCAGCTAGAA
CRaf‐Seq TCATGAGCACTGTAGCACCA
CRaf‐Seq2 GGACGAGCTCCACTTAGACG
CRAF‐BxB‐BamHI‐f CCAGGATCCATATGGCTTACC
CRAF‐BxB‐XbaI‐r CCTGTCTTCTAGTCTAGATTGCA
Ddx46‐RT‐f GAGACAGAGACCGGAGGAGAG
Ddx46‐RT‐r ACTCCTTGAGCGCCTTCTATC
G3bp1_2‐RT‐f CCTGACAGTCACCAGCTCTTC
G3bp1_2‐RT‐r GGCAGCTCGAGTCTTCTTCTC
Mek1‐BamHI‐f CGGGATCCAGATGCCCAAGAAGAA
Mek1‐KpnI‐r TTGCTGGTACCTAAAGGCTCA
miRNA1_Rcn1_358_bottom
CCTGATCACTGTCAACGATCCACGTCAGTCAGTGGCCAA AACGTGGATCGAATTGACAGTGATC
miRNA1_Rcn1_358_top
TGCTGATCACTGTCAATTCGATCCACGTTTTGGCCACTGA CTGACGTGGATCGTTGACAGTGAT
miRNA2_Rcn1_374_bottom
CCTGTAACAAGGCCAACCATCACGTCAGTCAGTGGCCAA AACGTGATGGTGATGGCCTTGTTAC
miRNA2_Rcn1_374_top
TGCTGTAACAAGGCCATCACCATCACGTTTTGGCCACTG ACTGACGTGATGGTTGGCCTTGTTA
miRNA3_Rcn1_414_bottom
CCTGTTCTGTACCCGTGATCCAAGTCAGTCAGTGGCCAA AACTTGGATCAAACGGGTACAGAAC
miRNA3_Rcn1_414_top
TGCTGTTCTGTACCCGTTTGATCCAAGTTTTGGCCACTGA CTGACTTGGATCACGGGTACAGAA
miRNA4_Rcn1_455_bottom
CCTGAATCCTTCCAGTTTAGCGAGTCAGTCAGTGGCCAA AACTCGCTAAAGTCTGGAAGGATTC
miRNA4_Rcn1_455_top
TGCTGAATCCTTCCAGACTTTAGCGAGTTTTGGCCACTGA CTGACTCGCTAAACTGGAAGGATT
Kontroll‐miR_top AAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAAC
GTCTCCACGCGCAGTACATTTC
Kontroll‐miR_top GAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTG
ACGTCTCCACGCAGTACATTT
pAct‐BRAF‐NheI‐AS CCTCACTAAAGGCTAGCGGCCTTAGTTATTCAGGTACC
pAct‐BRAF‐NheI‐S GGTACCTGAATAACTAAGGCCGCTAGCCTTTAGTGAGG
pDC511‐f TTTGACCGTTTACGTGGAGAC
pDC515‐f AGCTGCGTTCTACGTGGGTA
Oligonukleotid Sequenz (5’‐3’)
pDC515‐r TTGTGAAATTTGTGATGCTA
pG5luc‐SacI‐f GGTACCGAGCTCCTAGACGGAGTAC
pG5luc‐SalI‐r CGGAAGGAGTCGACTGGGTTGAA
Pja1‐RT‐f TGAGGAACAGCACCAGATTTC
Pja1‐RT‐r CTCAAAAGCGTCATTTCGTTC
Pkm2‐RT‐f TTTGCATCTGATCCCATTCTC
Pkm2‐RT‐r TAGTCCAGCCACAGGATGTTC
Rcn1‐RT‐f GCTTCCAGTACGATCATGAGG
Rcn1‐RT‐r ACCCGTTTGATCCAAAGTTTC
Wdr92‐RT‐f CAAGCCCATTAAATGTGGAAC
Wdr92‐RT‐r TCCAAGTCCACCTACACCATC
Zfand2a‐RT‐f TTTCCTACGTGGGTCATAAGTG
Zfand2a‐RT‐r TGAAAGGTGCAATCTCTGTCC
2.9.8 Längenstandards
Zur Bestimmung der Länge von DNA‐Fragmenten auf Agarosegelen wurden folgende Längenstandards mitgeführt:
Längenstandard Bezugsquelle
Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus Fermentas, St. Leon‐Rot Gene RulerTM 1 kb DNA Ladder Fermentas, St. Leon‐Rot
2.9.9 Versuchstiere
Versuchstiere Bezugsquelle
Adulte und neonatale Wistar Ratten Tierzucht Universitätsmedizin Göttingen European Neuroscience Institute, Göttingen FVB/N Mäuse Max‐Planck‐Institut für experimentelle Medizin,
Göttingen
Die Versuchstiere wurden in einem zwölfstündigen Hell‐Dunkel‐Rhythmus bei 22°C und 55±5%
relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Das Tierfutter wurde von der Firma ssniff‐Spezialdiäten (Soest) bezogen.
2.9.10 Herkunft des Patientenmaterials
Im Rahmen dieser Arbeit fanden molekularbiologische Untersuchungen an Protein aus Myokardbiopsien von Patienten mit der klinischen Diagnose einer Aortenklappeninsuffizienz statt.
Die Gewebe‐Proben der Patienten wurden zum Zweck der Grundlagenforschung aus der Abteilung Herz‐Thorax‐Gefäßchirurgie des Universitätsklinikums Göttingen und aus dem Herzzentrum Bad Oeynhausen bezogen. Die Verwendung ist durch die Ethikkomission der Universität Göttingen genehmigt und die Patienten haben schriftlich ihre Zustimmung erklärt. Es sich um den Antrag 21/10/00 "Funktionelle, biochemische undmolekularbiologische Charakterisierung von menschlichem Vorhofmyokard anhand von Gewebeproben aus dem rechten Vorhofohr“. Die Proben wurden freundlicherweise von Dr. Samuel Sossalla zur Verfügung gestellt.
2.9.11 cDNA‐Library
Die Mouse Embryo Uncut Full‐length cDNA Library @ pENTR222 wurde bei Invitrogen (Karlsruhe) bestellt. Die Untersuchung der Primärlibrary mit insgesamt 1,6x107 Primärklonen ergab eine durchschnittliche Insertgröße von 3 kb. Insgesamt enthielten 96% der Primärklone ein Insert und 87% davon ein Full‐length cDNA Insert. Diese Primärlibrary wurde von der Firma Invitrogen mit Hilfe der Gateway Cloning Technology in einer LxR Klonasereaktion in den gewünschten Expressionsvektor pcDNA‐DEST40 transferiert.
