In dieser Arbeit wird der negative regulatorische Effekt einer 18-stündigen C16:1 Stimulation auf die posttranslationale Proteinstabilität von FOXO 1 und 3a nachgewiesen. Nach einem 18-stündigen C16:1 Stimulationsintervall ließ sich eine signifikante Herunterregulation der Gesamtproteinmenge von FOXO1 sowie FOXO3a in HL-1 Kardiomyozyten demonstrieren.
In Abschnitt 6.1 wurde bereits dargestellt, dass C16:1 die FOXO-Isoformen 1 und 3a phosphoryliert und dadurch hemmt. Demzufolge müsste FOXO, nach erfolgter Inaktivierung bzw. Verlust seines transkriptionellen Potentials, aus dem Zellkern heraus in das Zytosol der Zelle exportiert werden, um dort letztendlich proteasomal abgebaut zu werden. Vor diesem theoretischen Hintergrund erscheint die Reduktion des FOXO1 sowie FOXO3a Gesamtproteingehaltes nach C16:1-induzierter Inaktivierung von FOXO äußerst plausibel.
Die C16:1-vermittelte Reduktion der FOXO-Proteinstabilität bekräftigt ferner die Annahme, dass die prohypertrophen zellulären Effekte von C16:1 maßgeblich durch die Inhibierung bzw. die Degradation der FOXO-Transkriptionsfaktoren erfolgt. Durch die Hemmung der anti-hypertrophen Wirkung von FOXO kann sich folglich PCH am Herzen manifestieren.
In Kongruenz mit unseren Daten demonstrierten Brunet et al. bereits 1999 in einer humanen epithelialen Zelllinie eine AKT-induzierte Verminderung von Gesamt-FKHRL1 (FKHRL1;
veraltet für FOXO3a) [166]. Plas et al. bewiesen ferner in der murinen Knochenmarkszellinie FL5.12, dass die Aktivierung von AKT eine signifikante Verminderung der Gesamtproteinmengen von FOXO1, FOXO3a und Tuberin herbeiführt [216]. Die Reduktion der drei AKT-Substrate FOXO1, FOXO3a und Tuberin ließ sich von Plas et al. durch die Anwendung eines Proteasom-Inhibitors unterbinden, weshalb angenommen wurde, dass die AKT-vermittelte FOXO-Degradation proteasomal vermittelt wird [216]. Matsuzaki et al.
zeigten darüber hinaus in der humanen Hepatozytenzelllinie HepG2, dass Insulin eine AKT-abhängige FOXO1 Proteindegradation induziert [217]. Übereinstimmend mit diesen Resultaten publizierten Aoki et al., dass PDGF (platelet-derived growth factor) via PI3K-AKT Signaltransduktion die proteasomale Degradation von FOXO1 herbeiführt [218]. In HL-1
Kardiomyozyten wurde von Liu et al. publiziert, dass eine 18-stündige IGF-1 Stimulation zu einer Phosphorylierung von AKT sowie zu einer bemerkenswerten Reduktion des Gesamt-FOXO1 Proteingehaltes führt [135]. In diesen Kontext fügen sich die in dieser Arbeit dargestellten Resultate bezüglich einer C16:1-vermittelten, AKT-abhängigen Modulation der FOXO1- sowie FOXO3a-Proteinstabilität ein.
Hinsichtlich des Einflusses von C16:1 auf die posttranslationale FOXO3a-Proteinstabilität, wird deutlich, dass eine Kontroverse zu den in Abschnitt 6.2 diskutierten Western Blot-Daten besteht. Während eine kurzfristige, 30-minütige C16:1 Stimulation die Gesamtproteinmenge an FOXO3a heraufreguliert, bewirkt das in diesem Abschnitt dargestellte 18-stündige C16:1 Stimulationsintervall eine signifikante Verminderung von Gesamt FOXO3a. Demnach induziert C16:1, je nach Länge des gewählten Stimulationsintervalls, entgegengesetzte Effekte auf die zelluläre FOXO3a-Gesamtproteinmenge. Diese Beobachtung erscheint jedoch valide, da sie mit ähnlichen experimentellen Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt. Wie in Abschnitt 6.2 erwähnt, zeigten Van Gorp et al., dass die Gesamtmenge von FOXO3a nach kurzfristiger AKT-Aktivierung gesteigert wird [215]. Im Gegensatz dazu, wurde wie bereits in diesem Abschnitt diskutiert, auch von anderen Arbeitsgruppen verifiziert, dass länger andauernde AKT-Aktivierungen zwischen 18 und 48 Stunden eine Reduktion der FOXO3a Gesamtproteinmenge herbeiführen [166,216,217]. Um den molekularen Wirkmechanismus von C16:1 genauer verstehen zu können, kommt zukünftig der Identifikation des genauen C16:1-Stimulationszeitpunktes, welcher als Wendepunkt zwischen Steigerung und Reduktion des zellulären FOXO3a-Proteingehalts fungiert, eine besondere Bedeutung zu. Hierzu müsste künftig der Zeitverlauf des zellulären FOXO-Proteingehaltes genauer untersucht werden. Demzufolge müsste die FOXO3a Gesamtproteinmenge nach verschiedenen C16:1 Stimulationsintervallen proteinbiochemisch evaluiert werden. Durch den genannten Versuchsansatz könnte der exakte C16:1 Stimulationszeitpunkt detektiert werden, ab welchem C16:1 die Proteinstabilität von FOXO3a in HL-1 Kardiomyozyten negativ reguliert. Wie bereits in Abschnitt 6.2 diskutiert, scheint die kurzfristige Steigerung der FOXO3a Gesamtproteinmenge, gefolgt von der längerfristigen Reduktion der FOXO Proteine unter C16:1 Stimulation von physiologischer Relevanz zu sein. Demzufolge ist anzunehmen, dass C16:1 eine temporäre zytoplasmatische Kumulation der inaktivierten FOXO Proteine
bewirkt, bevor FOXO letztendlich über das zelluläre Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut wird. Durch den Abbau der Atrophie-vermittelnden FOXO Proteine kann C16:1 folglich die Manifestation von PCH am Herzen induzieren.
6.3.1 Vergleich des Effektes von IGF-1 und C16:1 auf die FOXO-Proteinstabilität
Im Rahmen der FOXO-Stabilitätsversuche wurde IGF-1, der natürliche Ligand der PI3K-AKT Signalkaskade, als Positivkontrolle verwendet. Wie bereits von Liu et al. in einem identischen experimentellen Setup gezeigt werden konnte, führt eine 18-stündige IGF-1 Stimulation von HL-1 Kardiomyozyten zu einer signifikanten Reduktion des Gesamt-FOXO1 Proteingehaltes [135]. Derselbe IGF-1 vermittelte signifikante Effekt ließ sich in dieser Arbeit ferner für Gesamt-FOXO3a demonstrieren. Hierbei fällt auf, dass C16:1 im Vergleich zu IGF-1 eine stärkere Reduktion von FOXO1 herbeizuführen scheint. Diese Beobachtung impliziert, dass C16:1 vermutlich eine potentere Wirkung auf die PI3K-AKT Signalkaskade bzw. auf den Transkriptionsfaktor FOXO1 ausüben könnte, als IGF-1. Dies könnte ein erster Anhalt dafür sein, dass C16:1 in HL-1 Kardiomyozyten eventuell stärkere prohypertrophe Effekte besitzen könnte als IGF-1.
Da eine mögliche mechanistische Ursache für dieses Resultat aktuell noch unerforscht bleibt, bedarf dieser Zusammenhang weiterer Abklärung. Denkbar wäre jedoch, dass die Vergleichbarkeit der IGF-1 und C16:1 Stimulationsversuche, trotz identischem experimentellen Setup, aufgrund unterschiedlich starker Stimulationskonzentrationen nicht zwangsläufig gewährleistet sein kann. Folglich lassen sich nur sehr begrenzt stringente Schlussfolgerungen bezüglich der Potenz von C16:1 im Vergleich zu IGF-1 auf die PI3K-AKT-Signalkaskade ziehen. Um die physiologische Relevanz des Resultates sicherzustellen, müsste dieses zukünftig mittels unterschiedlicher IGF-1 sowie C16:1 Konzentrationen reproduziert werden.