Aus der
Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie
Medizinische Hochschule Hannover Direktor: Prof. Dr. med. J. Klempnauer
Regulatorische T- Zellen im peripheren Blut, Lymphknoten- und Schilddrüsengewebe bei
Patienten mit Schilddrüsenkarzinom
Dissertation zu Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
entstanden im Rahmen des „StrucMed“ -Programms vorgelegt von
Sarah Koch geb. Müller aus Langenhagen
Hannover 2013
- 2 -
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 30.05.2013
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Betreuer: PD Dr. med. Rainer Lück Referent: Prof. Dr. med. Tim Sparwasser Korreferent: Prof. Dr. med. Klaus Friedrich Gratz Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2013
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Reinhold Ernst Schmidt Prof. Dr. Anke Schwarz
Prof. Dr. Bettina Wedi
- 3 -
Inhaltsverzeichnis
Einleitung 5
Das Immunsystem 5
Regulatorische T-Zellen 5
Die Schilddrüse 7
Erkrankungen der Schilddrüse 8
Struma 8
Schilddrüsenkarzinome 9
Das medulläre Schilddrüsenkarzinom 9
Die differenzierten Schilddrüsenkarzinome 10
Ziele der Untersuchungen 11
Patientenmaterialien und Methoden 12
Die Durchführung der Forschungsarbeit im
Transplantationsimmunologischen Labor der MHH 12
Einschlusskriterien und Patientenkollektiv 13
Durchflusszytometrie 14
Immunhistochemische Untersuchungen 18
Statistische Analysen 19
Tumorstadien UICC 19
Ergebnisse 20
Studienpopulation 20
Facs Analysen 21
Kontrollgruppe 21
Medulläres Schilddrüsenkarzinom (MTC) im Vergleich mit der Kontrollgruppe 23 CD4 und CD25 Färbung in der Kontroll- und MTC-Gruppe 24
FoxP3 Färbung in der Kontroll- und MTC-Gruppe 25
Oberflächenexpression von CD4 und CD25 auf Foxp3+Zellen 26 Zusammenfassung der CD4 und CD25 Oberflächenexpression auf
FoxP3+Zellen im medullären Schilddrüsenkarzinom 28 Regulatorische T Zellen und Tumorstadien (UICC) 29 Differenzierte Schilddrüsenkarzinome (DTC) im Vergleich mit der
Kontrollgruppe 30
CD4 und CD25 Färbung in der Kontroll- und DTC-Gruppe 31
FoxP3 Färbung in der Kontroll- und DTC-Gruppe 32
Oberflächenexpression von CD4 und CD25 auf FoxP3+Zellen 33 Prä- und postoperativer Vergleich von CD4+25+- und Foxp3+Zellen in der
DTC-Gruppe 35
Immunhistologie 36
CD3 im Schilddrüsen- und Lymphknotengewebe der Kontroll- und
Karzinomgruppe 37
CD4 im Schilddrüsen- und Lymphknotengewebe der Kontroll- und
Karzinomgruppe 38
CD8 im Schilddrüsen- und Lymphknotengewebe der Kontroll- und
Karzinomgruppe 39
- 4 -
FoxP3 im Schilddrüsen- und Lymphknotengewebe der Kontroll- und
Karzinomgruppe 40
Diskussion 41
Abbildungsverzeichnis 49
Literaturverzeichnis 53
Zusammenfassung 57
Lebenslauf 59
Erklärung nach §2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 62
Anhang 63
Einverständniserklärung 63
Danksagung 64
- 5 -
Ei E in nl le ei it tu un ng g
Das Immunsystem
Das Immunsystem des Menschen besteht aus verschiedenen Komponenten mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen, welche in ihrer Gesamtheit zum Überleben, in einer sich ständig ändernden Umwelt, essentiell sind.
Das Immunsystem des Menschen wird in ein angeborenes und ein adaptives Immunsystem eingeteilt. Das angeborene bzw. unspezifische Immunsystem entwickelt sich schon in der Neonatalphase. Es beinhaltet neben natürlichen Barrieren, wie z.B. Epithelien, auch Zellkomponenten. So zählen zum angeborenen Immunsystem dendritische Zellen, Makrophagen, basophile und eosinophile Granulozyten und natürliche Killerzellen. Das adaptive bzw.
spezifische Immunsystem entwickelt sich im Laufe des Lebens. So entsteht durch klonale Selektion von Lymphozyten und Entstehung spezifischer Rezeptoren auf diesen, ein Abwehrapparat, welcher theoretisch jegliches Pathogen erkennen und bekämpfen kann. Zum adaptiven Immunsystem zählen T- und B-Lymphozyten.
Diese lassen sich in verschiedene Subtypen aufteilen, wovon jede einzelne Subpopulation spezifische Oberflächenmoleküle, Aktivierungswege und Funktionen aufweist.
Regulatorische T-Zellen
Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind immunsuppressive Zellen, welche außerhalb ihrer physiologischen Aufgaben im Körper, wie z.B. Erhaltung der körpereigenen Toleranz, Unterdrückung einer überschießenden körpereigenen Immunreaktion gegenüber Pathogenen und Allergenen (Sakaguchi S, 2006), immer mehr in Zusammenhang mit autoimmunen Erkrankungen sowie malignen Prozessen gebracht werden.
Regulatorische T Zellen sind seit Beginn der 1970er Jahre bekannt (Gershon, 1971), wurden jedoch erst Jahre später in Zusammenhang mit Autoimmunkrankheiten und Tumorimmunität gebracht (Fujimoto, 1975). In weiteren Forschungsarbeiten gelang es dann, zuerst in der Maus und später auch
- 6 -
im Menschen, die Herkunft und Funktionalität der regulatorischen T-Zellen weiter aufzudecken.
Heutzutage werden regulatorische T-Zellen in natürliche Tregs (nTregs) und induzierte Tregs (iTregs) eingeteilt. Sie unterscheiden sich in Aktivierungsweg und Wirkmechanismus. nTregs entstehen im Thymus im Kontakt mit Auto-Antigenen und wirken über Zell-Zell-Kontakt. So können sie dendritische Zellen zu immunsuppressiven Zellen wandeln (Mahnke K, 2007).
iTregs entstehen in der Peripherie durch Interaktion mit fremden Antigenen und wirken Zytokin-vermittelt (Horwitz DA, 2008). So können iTregs durch autologe Expression von TGF-ß, unter Mitwirkung von IL-2, unreife T-Zellen zu iTregs induzieren.
Die zuerst identifizierte Population regulatorischer T-Zellen wurde über die Oberflächenmoleküle CD4 und CD25 in der Maus bestimmt (Thornton AM, 2000).
Später wurde der Transkriptionsfaktor Forkhead box P3 entdeckt, welcher von regulatorischen T Zellen exprimiert wird (Yagi H, 2004). FoxP3 wurde zu Beginn als voraussetzender Indikator für die Phenotypisierung und Funktionalität der regulatorischen T-Zelle gesehen. Auch aktuell gilt FoxP3 als spezifischer Marker für regulatorische T-Zellen (Kryczek I, 2009), jedoch wurden nachfolgend auch andere Mechanismen, welche zur Entstehung regulatorisch aktiver T-Zellen führen, erforscht (Hill JA, 2007).
Funktionell haben regulatorische T-Zellen supprimierende Fähigkeiten und sind in der Lage körpereigene Immunreaktionen über ein Feed-Back-System zu steuern.
So werden bei ablaufenden Immunreaktionen auch immer regulatorische T-Zellen vom Körper gebildet, um nicht eine überschießende Immunantwort auf einen gegebenen Reiz zu entwickeln. Werden die regulatorischen T-Zellen in diesem Zuge nicht gebildet, führt dies zu einem Fortführen der Immunantwort und häufig zu autoimmunen Erkrankungen (Chatenoud L, 2001). Bei Malignomen sind die supprimierenden Eigenschaften der regulatorischen T-Zellen ebenfalls von Bedeutung. So konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass die Depletion von regulatorischen T-Zellen in Mäusen mit malignen Tumoren zu einer totalen Tumorabstoßung führte (Imai H, 2007), (Katz SC, 2012).
- 7 -
Auch im humanen Immunsystem konnte man einen Zusammenhang zwischen Malignomen und regulatorischen T-Zellen nachweisen. So beobachtete man bei Patienten mit Adenokarzinomen (Ovarial-, Brust-, Lungen-, Pankreas- und Kolonkarzinom) eine erhöhte Anzahl regulatorischer T-Zellen (Curiel TJ, 2004), (Liyanage UK, 2002), (Ling KL, 2007).
Bisher gibt es kaum Untersuchungen regulatorischer T-Zellen in Schilddrüsenkarzinomen sowie in neuroendokrinen Malignomen, lediglich Vikman et al. beobachtete eine Erhöhung regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit einem Karzinoid (Vikman S, 2009). Daher stellt sich die Frage, ob Patienten mit einem neuroendokrinen Tumor der Schilddrüse, dem medullären Schilddrüsenkarzinom, bzw. einem Adenokarzinom der Schilddrüse, dem differenzierten Schilddrüsenkarzinom, ebenfalls erhöhte regulatorische T-Zellen aufweisen und diese in einen prognostischen Zusammenhang gebracht werden können.
Die Schilddrüse
Die Schilddrüse ist anatomisch in zwei Lappen (Lobus) einzuteilen, welche durch einen schmalen Gewebsstrang (Isthmus) verbunden sind. Sie ist im gesunden adulten Zustand ca. 20g schwer und umfasst bei der Frau ein Volumen von ca.
18ml und beim Mann von ca. 25ml. Histologisch wird das Gewebe der Schilddrüse in Schilddrüsenfollikel unterteilt. Das einschichtig angeordnete Follikelpithel produziert die Schilddrüsenhormone T3 und T4. Im Lumen der Schilddrüsenfollikel lagert die Vorstufe der Schilddrüsenhormone, das Protein Thyreoglobulin. Es bildet eine trüb glasige, gelatinös bis zähe Masse, das Kolloid. Durch eine Iodierung des Tyrosinanteils des Thyreoglobulins, entstehen die eben erwähnten Schilddrüsenhormone. Das dazu benötige Iod gelangt über Blutgefäße, in Gestalt seines Ions Iodid, in das Lumen der Schilddrüsenfollikel und wird an Thyreoglobulin gebunden (Gemsenjaeger, 2008).
Durch Bindegewebszüge, auch Septen genannt, welche mehrere Schilddrüsenfollikel umgeben, werden diese zu Läppchen zusammengefasst.
Zwischen den Schilddrüsenfollikeln liegen die parafollikulären Zellen, die C-Zellen.
Sie produzieren das Hormon Calcitonin, welches für den Calciumhaushalt von großer Bedeutung ist. Calcitonin, der Gegenspieler des Parathormons, welches in den Nebenschilddrüsen gebildet wird, bewirkt, dass bei einem zu hohem
- 8 -
Calciumspiegel im Blut, Osteoklasten, welche für den Abbau von Calcium aus Knochen verantwortlich sind, gehemmt werden. Ein Tumorleiden kann ebenfalls für einen Anstieg von Calcitonin im Körper verantwortlich sein, wie z.B. beim medullären Schilddrüsenkarzinom oder beim MEN (multiple endokrine Neoplasie) (Guliana JM, 1994).
Allgemein sind die von der Schilddrüse produzierten Hormone für den Gesamtorganismus von großer Bedeutung. So haben T3 und T4 Einfluss auf die Herzfrequenz und den Blutdruck des Menschen. Ein Mangel an Schilddrüsenhormonen bei Neugeborenen, führt zu schweren neurologischen bzw. kognitiven Einbußen (FR, 2007).
Erkrankungen der Schilddrüse Struma
In Deutschland zeigen ein Drittel der Bevölkerung Anomalien an der Schilddrüse (P.M. Schumm-Dräger, 2007). Die wohl bekannteste Erkrankung der Schilddrüse ist die (Jodmangel-) Struma. Hier setzt jodarmes Schilddrüsengewebe Wachstumsfaktoren frei, welches zu einer Hyperplasie des Schilddrüsengewebes und somit zu einer Struma führen. Abhängig vom Ausmaß der Wucherung und ggf. Knotenentstehung im Schilddrüsengewebe spricht man von einer krankhaften Wucherung. Die Entstehung einer Struma ist jedoch nicht nur auf einen Jodmangel zurückzuführen, so spielen auch genetisch Prädispositionen oder auch Schilddrüsenentzündungen eine Rolle (Neumann S, 1999). Eine Struma wird in verschiedene Stadien eingeteilt, welche sich maßgeblich an der Größe der Schilddrüse orientieren. So ist Stadium I eine tastbare und bei zurückgelegtem Kopf sichtbare Struma, während Grad III eine, ohne Reklination des Kopfes, große, sichtbare Struma ist. Geht eine Struma einher mit einer Beeinträchtigung der im Blut nachweisbaren Schilddrüsenhormone, fallen Symptome wie Müdigkeit, Herzrasen, etc. klinisch auf. Zeigt sich hingegen eine euthyreote Hyperplasie der Schilddrüse, so fallen erst in höheren Stadien einer Struma klinische Symptome, wie z.B. häufige Bronchitiden oder Luftnot auf.
Die meist zuerst veranlasste Therapie der Struma ist medikamentös durch Jodid und Thyroxin. Zeigt sich der medikamentöse therapeutische Versuch frustran,
- 9 -
besteht weiterhin Wachstums- bzw. Wucherungstendenz der Schilddrüse oder entsteht der Verdacht auf einen malignen Tumor im Schilddrüsengewebe, ist im weiteren Verlauf eine operative Therapie indiziert. In aller Regel ist dies die Hemithyreoidektomie, in welcher nur ein Schilddrüsenlappen vollständig entfernt wird oder die Thyreoidektomie, in welcher die Schilddrüse als gesamte Struktur entfernt wird. Spezielle Komplikationen dieser Eingriffe sind eine Beeinträchtigung des N. laryngeus recurrens, welcher die Stimmbänder innerviert, sowie ein postoperativer Hypoparathyreoidismus nach versehentlicher Entfernung der Nebenschilddrüsen (Führer D, 2012).
Nach erfolgter Thyreoidektomie ist eine lebenslange Substitution von Schilddrüsenhormonen empfohlen. Bei einer Hemithyreoidektomie produziert das verbliebene Schilddrüsengewebe weiterhin Schilddrüsenhormone, braucht jedoch einige Zeit bis es die volle Funktion des entfernten Gewebes voll übernimmt.
Somit wird bei einer Hemithyreoidektomie anfänglich eine Substitution mit Schilddrüsenhormonen benötigt, welche im Verlauf meist eingestellt wird.
Schilddrüsenkarzinome
Schilddrüsenkarzinome sind die häufigsten malignen Tumore in endokrinen Organen.
Das medulläre Schilddrüsenkarzinom
Das medulläre Schilddrüsenkarzinom (MTC) gehört mit einem Anteil von 3-10%
aller Schilddrüsenmalignome zu den eher seltenen Schilddrüsenerkrankungen. Es hat eine Inzidenz von 0,3/100.000 in der Bevölkerung (Schmoll, 2006). Das MTC entsteht aus den in der Schilddrüse gelegen neuroendokrinen C-Zellen. In 75%
der Fälle tritt es sporadisch auf, die anderen 25% sind familiär bedingt.
Da Schilddrüsenkarzinome nur selten klinische Symptome verursachen, erfolgt die Diagnosestellung häufig zufällig durch eine Vorsorge-Sonographie der Schilddrüse, bei Auftreten von tastbaren zervikalen Lymphknoten oder bei Komplikationen durch fortgeschrittene Tumore. So erklärt sich, dass 50 % Patienten bei Erstdiagnose schon lokoregionäre Lymphknotenmetastasen aufweisen (Frilling A, 1998).
- 10 -
Ebenfalls ist die Bestimmung laborchemischer Parameter im Blut, wie TSH, T3, T4 und Calcitonin häufig diagnoseweisend.
Diagnostisch zeigen Patienten mit einem medullären Schilddrüsenkarzinom mit familiärer Belastung in 88% eine Mutation des Proto-Onkogens RET (Eng C, 1996). Therapeutisch wird hier aufgrund des schnellen Wachstums des medullären Schilddrüsenkarzinoms eine prophylaktische Thyreoidektomie sowie Lymphknotendissektion bis zum fünften Lebensjahr empfohlen (AWMF online: Nr.
032/014) (Skinner MA, 2005).
Für MTC-Patienten mit familiärer Belastung, jedoch ohne eine RET-Mutation, ist bis heute noch kein einheitliches Diagnose- oder Therapiekonzept vorhanden, welches besonders für die sehr aggressiven Formen des medullären Schilddrüsenkarzinoms von Nachteil ist (Niccoli-Sire P & Endocrines, 2003).
Selbst der spezifischste Marker des MTCs, Calcitonin, zeigt sich in diesen Formen insuffizient (Brandi ML, 2001).
Allgemein hat das MTC eine 10-Jahres-Überlebensrate von 76% und stellt eine hauptsächliche Todesursache endokrinologischer Erkrankungen dar.
Die differenzierten Schilddrüsenkarzinome
Die differenzierten Schilddrüsenkarzinome (DTC), das papilläre Schilddrüsenkarzinom (PTC) und das follikuläre Schilddrüsenkarzinom (FTC), haben eine Prävalenz von zwei bis drei Neuerkrankungen pro 100.000/Jahr (J.
Witte, 1997). Seit einigen Jahren zeigen sie eine stark steigende Inzidenz (Zhu C, 2009).
Die 10-Jahres-Überlebensrate liegt beim PTC bei 89,5% und beim FTC bei 80%.
Ein wichtiger Pfeiler der Diagnosestellung ist heutzutage die ultraschallgesteuerte Feinnadelaspiration (FNA). Therapiert werden differenzierte Schilddrüsenkarzinome, entsprechend des Stadiums, durch Thyreoidektomie mit Lymphadenektomie genau definierter Kompartimente und ggf. einer Radiojodtherapie (Slough CM, 2006).
Trotz der guten Prognosen, sind 15-27% der Patienten postoperativ nicht karzinomfrei und stellen eine diagnostische und therapeutische Herausforderung
- 11 -
dar. Eben auch aufgrund weniger postoperativer Verlaufsparameter, welche Hinweise auf eine erneute Erkrankung geben.
Besonders schwierig ist dabei die Begutachtung des follikulären Schilddrüsenkarzinoms. Häufig werden diese Patienten, aufgrund unklarer Zytologie aus der FNA, hemithyreoidektomiert. Erst postoperativ wird die Diagnose eines follikulären Schilddrüsenkarzinoms gesichert (Lin JD, 2009). Die Patienten müssen sich somit einer Zweitoperation und den damit verbunden Folgen und Risiken unterziehen. Dies gilt des Weiteren auch für Patienten mit einem papillären Schilddrüsenkarzinom, da primär benigne follikuläre Adenome der Schilddrüse, sekundär auch zum papillären Schilddrüsenkarzinom entarten können. Eine Verbesserung der präoperativen Diagnostik könnte für alle Patienten somit eine deutliche Optimierung der Therapie ergeben.
Ziele der Untersuchungen
Das primäre Ziel der Studie war es zu ermitteln, ob sich im Adenokarzinom der Schilddrüse, dem differenzierten Schilddrüsenkarzinom, sowie auch im neuroendokrinen Tumor der Schilddrüse, dem medullären Schilddrüsenkarzinom, eine Erhöhung regulatorischer T-Zellen bzw. FoxP3+Lymphozyten zeigt.
Mit dem Ziel einer frühen, radikalen Therapieentscheidung, um die häufig infauste Prognose des medullären Schilddrüsenkarzinoms zu verbessern, ist es wichtig, weitere diagnostische Möglichkeiten aufzudecken. Es besteht die Frage, ob ein immunologischer Marker, wie das vermehrte Vorhandensein von regulatorischen T-Zellen bzw. FoxP3+Zellen, in Zukunft als Malignitätsmarker im medullären Schilddrüsenkarzinom und auch im differenzierten Schilddrüsenkarzinom dienen kann.
Hinsichtlich des häufigen postoperativen Wiederauftretens eines differenzierten Schilddrüsenkarzinoms stellt sich ebenfalls die Frage, ob die Anzahl regulatorischer T-Zellen bzw. FoxP3+ Lymphozyten im differenzierten Schilddrüsenkarzinom einen postoperativen Verlaufsparameter darstellen kann, um ein Rezidiv frühzeitig erkennen und therapieren zu können.
- 12 -
Pa P at ti ie en nt te en nm ma at te e r r ia i al li ie e n n u un nd d M M et e th ho od de en n Die Durchführung der Forschungsarbeit im
Transplantationsimmunologischen Labor der MHH
Die Dissertation wurde unter der Leitung des Programms „Strukturierte Doktorandenausbildung“ absolviert. Dieses hat sich zum Ziel erklärt, in einer ca.
neun Monatigen Auszeit vom Studium der Humanmedizin, dem Doktoranden praktische und theoretische Kenntnisse der molekularen Biomedizinforschung näher zu bringen. Dies beinhaltet die regelmäßige Vorstellung seiner Forschungsergebnisse in Laborseminaren, Präsentationen seines Projektes auch in anderen Fachbereichen sowie mindestens 50 Stunden Weiterbildung in wissenschaftlichen Kolloquien.
Die hier präsentierten Forschungsarbeiten wurden im Transplantations- immunologischen Labor, welches durch Professor Dr. rer. nat. R. Schwinzer geleitet wird, untersucht. Unser Projekt war in die Klinik für Allgemein-, Viszeral-, und Transplantationschirurgie unter der Leitung von Professor Dr. med. Jürgen Klempnauer eingegliedert. Die Studie wurde durch die Arbeitsgruppe von Frau Professor Dr. med. M. Koch im Transplantationsimmunologischen Labor betreut.
Zu Beginn unserer Forschungsarbeiten wurden die einzelnen Methoden der Materialverarbeitung festgelegt und standardisiert. Ein Teil der Methodik, wie z.B.
Standards zu Gatingverfahren an Humanmaterial am FACS Calibur unter dem Softwaresystem „Cellquest“ (BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland), wurde von der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. rer. nat. R. Schwinzer zur Verfügung gestellt. Diese werden im Rahmen der regulären Patientenversorgung in der Medizinischen Hochschule Hannover angewandt. Ebenfalls wurde die Aufarbeitung des humanen Materials nach den Standards des Transplantationslabors übernommen. Andere Verfahren, wie z.B. das Anfärben immunhistologischer Schnitte mit Forkhead box P3, wurden als neue Methoden im Transplantationsimmunologischen Labor eingeführt und es wurden Standardprotokolle angefertigt.
Die aus dieser Studie hervorgegangen Ergebnisse wurden regelmäßig in Laborbesprechungen, an welchen alle Arbeitsgruppen des Labors teilnahmen
- 13 -
(Transplantationsimmunologie, Xenotransplantation, Onkologische Forschung, Doktoranden der Biologie, Arbeitsgruppen aus der Pädiatrie) vorgestellt und diskutiert. So wurden die Ergebnisse ständig überwacht, überdacht und in neue Zusammenhänge gestellt.
Zum Abschluss des Strukturierten Doktorandenprogramms wurden die Endergebnisse dieser Arbeit in einem Abschluss-Symposium des Programms
„Strukturierte Doktorandenausbildung“ vorgestellt und diskutiert.
Einschlusskriterien und Patientenkollektiv
Die Untersuchungen von humanem Material (Schilddrüsengewebe, Lymphknotengewebe, Blut) wurden angemeldet und durch die Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) genehmigt. Die Patienten wurden vor der Probenentnahme aufgeklärt und jeder Patient gab vor Therapiebeginn nach Aufklärung sein schriftliches Einverständnis an dieser Studie teilzunehmen.
Das Aufklärungsformular ist im Anhang nachzuschlagen.
In dieser Studie wurden insgesamt 52 Patienten untersucht. Alle Patienten wurden aufgrund einer Erkrankung der Schilddrüse operativ behandelt. 19 Patienten hatten eine gutartige Schilddrüsenwucherung (Struma), acht Patienten hatten ein medulläres Schilddrüsenkarzinom und 25 Patienten hatten entweder ein papilläres oder ein follikuläres Schilddrüsenkarzinom, die im Folgenden in der Gruppe differenziertes Schilddrüsenkarzinom zusammengefasst wurden. Die operativen Behandlungen sowie gegebenenfalls im Anschluss erfolgte postoperative Radiojod-Therapie aller Patienten wurden an der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. In der Gruppe der medullären Schilddrüsenkarzinome wurden fünf Rezidiveingriffe durchgeführt, bei den differenzierten Schilddrüsenkarzinomen insgesamt 12 (papillär 10, follikulär zwei) und in der Kontrollgruppe zwei. Die Behandlung der Patienten erfolgte entsprechend der aktuellen Leitlinien der Chirurgischen Arbeitsgemeinschaft Endokrinologie.
In dieser Studie wurde venöses Blut untersucht, welches direkt präoperativ vor der Anästhesieeinleitung im Operationsvorbereitungsraum vom Patienten abgenommen wurde, sowie intraoperativ entnommenes Schilddrüsen- und Lymphknotengewebe der Patienten. Das entnommene Schilddrüsengewebe
- 14 -
entsprach immer einem makroskopisch repräsentativen Gewebeanteil der vorab diagnostizierten Schilddrüsenerkrankung (Struma- bzw. Karzinomleiden). Das Lymphknotenmaterial war jeweils nah der Schilddrüse entnommen und enthielt ggf. Anteile von Metastasen, wenn diese makroskopisch sichtbar waren. Das pathologische Staging wurde durch die Probenentnahmen nicht beeinflusst. Die Gewebeproben wurden auf die nachfolgend beschriebenen Parameter untersucht und die Patienten wurden nach dem endgültig histologischen Untersuchungsbefund aus dem pathologischen Institut der MHH unter der Leitung von Professor Dr. med. H.-H. Kreipe gruppiert.
Patienten der Kontrollgruppe zeigten, außer einer gutartigen Wucherung des Schilddrüsengewebes, keinen Hinweis auf eine autoimmunologische- oder maligne Schilddrüsenerkrankung. In den Karzinomgruppen wurde das Patientenmaterial definitiv einem medullären bzw. differenzierten Schilddrüsenkarzinom durch das pathologische Institut der MHH zugewiesen.
Durchflusszytometrie
Das, wie oben beschrieben, gewonnene periphere, venöse Blut sowie das Lymphknotengewebe wurden im Transplantationsimmunologischen Labor am FACS Calibur unter Benutzung der Software „Cellquest“ (BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) durchflusszytometrisch untersucht. Dies erfolgte unmittelbar im Anschluss an die Probegewinnung. In allen Fällen betrug der zeitliche Aufwand zwischen der Materialgewinnung und der Probenbearbeitung weniger als zwei Stunden.
Das gewonnene Lymphknotenmaterial wurde zu einem Teil für immunhistochemische Untersuchungen bei -80°C eingefroren, während der andere Teil für die Durchflusszytometrie genutzt wurde. Dieser wurde in einer Petri-Schale mit TC199- Flüssigkeit angereichert und soweit aufbereitet (zupfen, sieben, zentrifugieren), dass eine Mindestzellzahl von 1.000.000 Zellen/ml erreicht wurde.
Das gewonnene Blut wurde ebenfalls mit TC199 verdünnt (1:2) und weiterführend mit Ficoll- Lösung versetzt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation des Gemisches, setzte sich ein Lymphozytenring ab, welcher abpipettiert und weiter
- 15 -
aufbereitet wurde, so dass eine Mindestzellzahl von 1.000.000Zellen/ml erreicht wurde.
Die gewonnen Zellen wurden mit humanem Immunglobulin inkubiert (Octagam;
Octapharma, Langenfeld, Deutschland) und mit fluoreszierenden monoklonalen Antikörpern bzw. dem intrazellulären Marker FoxP3 gefärbt.
Es wurden die folgenden monoklonalen Antikörper verwendet:
CD45 PE (F10-89-4, Southern Biotechnology, U.S.A.), CD3 FITC (SK7),
CD8 PE (SK1),
CD20 FITC (LeuTM-16), CD4 PE (RPA-T4), CD25 PE (M-A251), CD4 FITC (RPA-T4), CD45RO PE (UCHL1), CD16 (B73.1),
CD56 (MY31),
CD45RA FITC (HI100, alle BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland).
Für die intrazelluläre Färbung wurde das Alexa Fluor 647 anti-human FoxP3 Flow Kit (206D, Biolegend, San Diego) verwendet. Die intrazelluläre Färbung erfolgte nach der Beschreibung des Färbevorgangs des Herstellers. So wurden die Zellen durch den Fix/Perm-Buffer zuerst fixiert und im Anschluss durch den Perm-Buffer wiederholt permeabilisiert, so dass die intrazelluläre Färbung mit Forkhead box P3 Antikörper bzw. mit der ISO-APC möglich war.
Die generierten Daten wurden, wie oben erwähnt, durch das FACS Calibur sowie das Programm „Cellquest“ (BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) analysiert.
- 16 -
Abbildung 1: CD45+ Zellen im a) peripheren Blut und b) Lymphknotengewebe
Die Identifikation der hämatopoetischen Zellpopulation erfolgte mit dem Oberflächenmarker CD45 (Abbildung 1). Im weiteren Verlauf wurden in der CD45+ Lymphozytenpopulation die darin enthaltenen CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD3- CD16+CD56+- und CD20+-Zellen analysiert (als Beispiel Abbildung 2). Es wurde ein standardisiertes Gatingverfahren für die Zellen der oben genannten Färbungen verwendet, welches von dem Transplantationsimmunologischen Labor der Medizinischen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt wurde (Leitung durch Prof. Dr. rer. nat. R. Schwinzer). Bei Abweichungen bzw. großem Zellzerfall wurde die Probe verworfen und nicht in diese Studie mit eingebracht.
Abbildung 2: CD3+CD4+Zellen im a) peripheren Blut und b) Lymphknotengewebe
Die Auswertung der FoxP3+Zellen erfolgte, wie oben beschrieben, nach der Permeabilisierung und Fixierung (als Beispiel Abbildung 3) der Zellen aus dem peripheren Blut bzw. aus dem Lymphknotengewebe.
- 19 -
gegengefärbt mit Mayer’s Hämalaun (Merck, Darmstadt, Deutschland). PBS wurde als Kontrollfärbung anstelle des ersten Antikörpers benutzt.
Nach Auszählen von 10 Gesichtsfeldern in 20facher Vergrößerung (Mikroskop Olympus BX-40, Hamburg, Deutschland) wurden die im Ergebnisteil genannten Aussagen gemacht. Die immunhistochemischen Untersuchungen sollen die FACS-Analysen jedoch lediglich visualisieren, nicht quantifizieren, da die hier gewählte Zählmethode keine Signifikanzaussagen zulässt.
Statistische Analysen
Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Student T-Test durchgeführt.
Das Signifikanzniveau wurde erreicht bei p≤ 0.05.
Tumorstadien UICC
Die später aufgeführten Ergebniseinteilungen des medullären Schilddrüsenkarzinoms basieren auf der UICC-Stadiengruppierung nach TNM 7 (Prof. Dr. C. Wittekind, 2012).
- 20 -
Er E rg ge eb bn ni is ss s e e
Studienpopulation
medulläre differenzierte Benigne Struma/
n=52 SD-Karzinome Kontrollgruppe
Geschlecht männlich 4 9 2
weiblich 4 16 17
Durchschnittsalter Jahre ± STABW 59 ± 15 53 ± 19 51 ± 18
Behandlungseingriff Ersteingriff 3 13 17
Rezidiveingriff 5 12 2
Tabelle 1: Demographische Daten der Studienpopulation
In der Studie wurden 52 Patienten untersucht (Tabelle 1).
Ein medulläres Schilddrüsenkarzinom (MTC) hatten vier Frauen (49 ± 14 Durchschnittsalter ± STABW) und vier Männer (59 ± 12 Durchschnittsalter ± STABW), ein differenziertes Schilddrüsenkarzinom (DTC) hatten 25 Patienten, davon hatten 20 Patienten ein papilläres Schilddrüsenkarzinom (13 Frauen, 47 ± 23 Durchschnittsalter ± STABW und 7 Männer, 51 ± 21 Durchschnittsalter ± STABW) und fünf Patienten ein follikuläres Schilddrüsenkarzinom (3 Frauen, 52 ± 19 Durchschnittsalter ± STABW und 2 Männer, 66 ± 0 Durchschnittsalter ± STABW).
Die Kontrollgruppe umfasst 19 Patienten mit benigner Struma (17 Frauen 49 ± 19 Durchschnittsalter ± STABW, 2 Männer 62 ± 5 Durchschnittsalter ± STABW).
Die Patienten wurden in der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) aufgrund ihrer Schilddrüsenerkrankung operiert und basierend auf der endgültigen Histologie der entnommenen Präparate aus dem pathologischen Institut der MHH auf die Gruppen verteilt. Wie bereits oben erwähnt, sind in der Gruppe der medullären Schilddrüsenkarzinome fünf Rezidiveingriffe durchgeführt worden, bei den differenzierten Schilddrüsenkarzinomen insgesamt 12 (papillär 10, follikulär zwei) und in der Kontrollgruppe zwei.
- 22 -
Abbildung 9: CD4+CD25+- und FoxP3+- Lymphozytenverteilung in CD45+Lymphozyten in der Kontrollgruppe im peripheren Blut
Abbildung 10: CD4+CD25+- und FoxP3+- Lymphozytenverteilung in CD45+Lymphozyten im Lymphknotengewebe der Kontrollgruppe
- 23 -
Medulläres Schilddrüsenkarzinom (MTC) im Vergleich mit der Kontrollgruppe
Abbildung 11: Vergleich der Verteilung der CD45+Lymphozytenpopulation im peripheren Blut zwischen der MTC-Gruppe und der Kontrollgruppe (MTC= medulläres
Schilddrüsenkarzinom, MW= Mittelwert)
Abbildung 12:Vergleich der Verteilung der CD45+Lymphozyten im Lymphknotengewebe zwischen der MTC-Gruppe und der Kontrollgruppe (MTC=medulläres
Schilddrüsenkarzinom, MW= Mittelwert)
- 24 -
Die Untersuchungen der CD45+Lymphozytenpopulation im peripheren Blut (Abbildung 11) als auch im Lymphknoten (Abbildung 12) zeigten keine Unterschiede zwischen MTC- und Kontrollpatienten. Es zeigte sich eine vergleichende Anzahl lymphozytärer Zellen (T-, B-, NK-Zellen) in Karzinom- und Kontrollgruppe.
Folgend dargestellte Ergebnisse beziehen sich auf die hier dargestellte CD45+Lymphoyzytenpopulation.
CD4 und CD25 Färbung in der Kontroll- und MTC-Gruppe
Abbildung 13: CD4+CD25+ Zellen in CD45+Lymphozyten der MTC-Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe im A) peripheren Blut der MTC-Gruppe und B) im Lymphknotengewebe (MTC=medulläres Schilddrüsenkarzinom, MW= Mittelwert)
Es konnte kein Unterschied in der CD4+CD25+ Lymphozytenpopulation zwischen MTC- und Kontrollpatienten gezeigt werden. Im Blut fanden sich bei MTC- Patienten 4,3 ± 1,3 % CD4+CD25+ Lymphozyten gegenüber 4,0 ± 2,4 % in der Kontrollgruppe.
Im Lymphknoten zeigten sich 10,7 ± 5,8 % CD4+CD25+ Lymphozyten bei MTC- Patienten und in der Kontrollgruppe 8,8 ± 3,3 % (Abbildung 13).
A B
- 25 -
FoxP3 Färbung in der Kontroll- und MTC-Gruppe
Abbildung 14: FoxP3+ Zellen in CD45+Lymphozyten im A) peripheren Blut der MTC-Gruppe und B) im Lymphknotengewebe der MTC-Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe (MTC=medulläres Schilddrüsenkarzinom, MW= Mittelwert)
Im Blut der MTC-Patienten war die Population der FoxP3+ Lymphozyten mit 6,3 ± 3,6 % im Vergleich zur Kontrollgruppe mit 3,6 ± 1,8 % FoxP3+ Lymphozyten signifikant erhöht.
Im Lymphknoten konnte kein signifikanter Unterschied beobachtet werden. So waren in der MTC-Gruppe 11,8 ± 5,1 % FoxP3+Lymphozyten und in der Kontrollgruppe 9,2 ± 3,2 % FoxP3+Lymphozyten zu finden (Abbildung 14).
A B
p=0.02
- 26 -
Oberflächenexpression von CD4 und CD25 auf Foxp3+Zellen
Abbildung 15: FoxP3+ Zellen in CD45+Lymphozyten im peripheren Blut von MTC-Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe A) Oberflächenexpression von CD4 und B)
Oberflächenexpression von CD25 (MTC=medulläres Schilddrüsenkarzinom, MW=Mittelwert)
In den FoxP3+ Lymphozyten zeigten sich Unterschiede bezüglich der Expression von CD4 und CD25 zwischen der Kontroll- und MTC-Gruppe.
Bei Patienten der MTC-Gruppe fand sich eine Expression von CD4 auf 78% der FoxP3+ Lymphozyten, in der Kontrollgruppe auf 88% der Zellen.
FoxP3+CD25+ Lymphozyten zeigten sich im peripheren Blut der MTC-Patienten zu 42%, in der Kontrollgruppe zu 52% (Abbildung 15). Die Unterschiede sind statistisch nicht signifikant.
A B
- 27 -
Abbildung 16: FoxP3+ Zellen in CD45+Lymphozyten im Lymphknotengewebe der MTC- Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe A) Oberflächenexpression von CD4 und B)Oberflächenexpression von CD25 Verteilung (MTC=medulläres Schilddrüsenkarzinom, MW= Mittelwert)
In den Lymphknoten der MTC-Patienten waren 78%, in der Kontrollgruppe 91%
der FoxP3+Lymphozyten CD4positiv.
FoxP3+CD25+ Lymphozyten waren in den Lymphknoten der MTC-Gruppe zu 37%, in der Kontrollgruppe zu 46% zu sehen (Abbildung 16).
Abbildung 17: prozentuale CD4 Expression auf FoxP3+Lymphozyten der Kontrollgruppe und MTC-Patienten A) im peripheren Blut B) im Lymphknotengewebe (MTC=medulläres
Schilddrüsenkarzinom, MW= Mittelwert)
A B
A B
- 28 -
Bezogen auf die Gesamtpopulation der CD45+ Lymphozyten zeigten sich im Blut der MTC-Gruppe 1,3 ± 1,5 % FoxP3+CD4- Lymphozyten, während es in der Kontrollgruppe nur 0,5 ± 0,4 % waren. (p =0,23)
Im Lymphknoten zeigten sich in der MTC-Gruppe 2,3 ± 2,2 % FoxP3+CD4- Lymphozyten und in der Kontrollgruppe 0,8 ± 0,6 %. (p =0,13).
Bezüglich der FoxP3+CD4+ Lymphozyten in der Gesamtpopulation zeigten sich im Blut der MTC-Gruppe 4,8 ± 2,3 % FoxP3+CD4+ Lymphozyten und in der Kontrollgruppe 3,0 ± 1,5 %. Im Lymphknoten waren in der MTC-Gruppe 9,4 ± 4,4
% FoxP3+CD4+ Lymphozyten und in der Kontrollgruppe 8,5 ± 2,9 % nachzuweisen (Abbildung 17).
Zusammenfassung der CD4 und CD25 Oberflächenexpression auf FoxP3+Zellen im medullären Schilddrüsenkarzinom
Abbildung 18: Expression von CD4 und CD25 auf FoxP3+Lymphozyten A) im Blut B) im Lymphknoten (MTC=medulläres Schilddrüsenkarzinom)
Durch die Beobachtungen der Oberflächenexpression von CD4 und CD25 auf FoxP3+ Lymphozyten, fiel ein Unterschied in der Population der FoxP3+CD4- CD25-Lymphozyten im Blut und in den Lymphknoten der C-Zell-Karzinom- und Kontrollgruppe auf.
Im peripheren Blut waren in der MTC-Gruppe 22% FoxP3+CD4-CD25- Lymphozyten, in der Kontrollgruppe 12%.
A B
- 30 -
Differenzierte Schilddrüsenkarzinome (DTC) im Vergleich mit der Kontrollgruppe
Abbildung 20: Vergleich der Verteilung der CD45+Lymphozyten im peripheren Blut der DTC- Gruppe und der Kontrollgruppe (diff. SD=differenziertes Schilddrüsenkarzinom, MW=
Mittelwert)
Abbildung 21:Vergleich der Verteilung der CD45+Lymphozyten im Lymphknotengewebe der DTC-Gruppe und der Kontrollgruppe (diff. SD= differenzierte Schilddrüsenkarzinome, MW=
Mittelwert)
- 31 -
Die Untersuchungen der CD45+ Lymphozytenpopulation im peripheren Blut (Abbildung 20) als auch im Lymphknoten (Abbildung 21) zeigten keine Unterschiede zwischen DTC- und Kontrollpatienten. Es zeigte sich eine vergleichende Anzahl lymphozytärer Zellen (T-, B-, NK-Zellen) in DTC- und Kontrollgruppe. Folgende Ergebnisse beziehen sich auf die hier dargestellte CD45+ Lymphozytenpopulation.
CD4 und CD25 Färbung in der Kontroll- und DTC-Gruppe
Abbildung 22: CD4+CD25+ Zellen in CD45+Lymphozyten der DTC-Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe im A) peripheren Blut der DTC-Gruppe und B) im Lymphknotengewebe (diff. SD= differenzierte Schilddrüsenkarzinome, MW= Mittelwert)
Es konnte ein signifikanter Unterschied in der CD4+CD25+ Lymphozytenpopulation zwischen Patienten mit differenziertem SD-Karzinom und Kontrollpatienten gezeigt werden. Im Blut zeigten DTC-Patienten 6,1 ± 4,1 % CD4+CD25+ Lymphozyten gegenüber 4,0 ± 2,4 % CD4+CD25+ Lymphozyten in der Kontrollgruppe (p < 0.05).
Im Lymphknoten zeigte sich hingegen kein signifikanter Unterschied. DTC- Patienten zeigten 11,8 ± 5,9 % CD4+CD25+ Lymphozyten und die Kontrollgruppe 8,8 ± 3,3 % CD4+CD25+ Lymphozyten (Abbildung 22).
A B
p<0.05
- 32 -
FoxP3 Färbung in der Kontroll- und DTC-Gruppe
Abbildung 23: FoxP3+ Zellen in CD45+Lymphozyten der DTC-Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe im A) peripheren Blut der DTC-Gruppe und B) im Lymphknotengewebe (diff.
SD= differenzierte Schilddrüsenkarzinome, MW= Mittelwert)
Die FoxP3+ Lymphozyten zeigten eine signifikante Erhöhung im Blut der DTC- Patienten von 5,0 ± 2,4 % FoxP3+ Lymphozyten verglichen zur Kontrollgruppe mit 3,6 ± 1,8 % FoxP3+ Lymphozyten.
Im Lymphknoten konnte ein signifikanter Unterschied festgestellt werden. So sind in der DTC-Gruppe 13,3 ± 5,7 % FoxP3+ Lymphozyten und in der Kontrollgruppe 9,2 ± 3,2 % FoxP3+ Lymphozyten zu finden (Abbildung 23).
p = 0.02
A B
p=0.04
p=0.02
- 34 -
Abbildung 25: FoxP3+ Zellen in CD45+Lymphozyten im Lymphknotengewebe der DTC- Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe A) Oberflächenexpression von CD4 und
B)Oberflächenexpression von CD25 (diff. SD=differenziertes Schilddrüsenkarzinom, MW=
Mittelwert)
Die FoxP3+ Lymphozyten der DTC-Patienten waren zu 87% CD4 positiv, die der Kontrollgruppe zu 90%.
Eine Expression von CD25 fand sich in der DTC- und der Kontrollgruppe auf jeweils 44% der FoxP3 positiven Lymphozyten (Abbildung 25).
A B
- 35 -
Prä- und postoperativer Vergleich von CD4+25+- und Foxp3+Zellen in der DTC-Gruppe
Abbildung 26: Präoperativ A) CD4+CD25+ Zellen und B) FoxP3+ Zellen im peripheren Blut in CD45+Lymphozyten im Vergleich mit postoperativen Werten (diff. SD= differenzierte Schilddrüsenkarzinome, MW= Mittelwert)
In der Klinik für Nuklearmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover wurde bei sechs Patienten nach operativer Behandlung eines differenzierten Schilddrüsenkarzinoms eine erneute Kontrolle der regulatorischen T-Zellen im peripheren Blut durchgeführt. Die Blutproben wurden direkt vor Beginn der sich an die operative Therapie anschließenden Radiojod-Therapie von den Patienten entnommen.
Vergleicht man die Ergebnisse mit den Werten der präoperativen Patienten, erkennt man bei den CD4+CD25+ Lymphozyten keinen Unterschied. Präoperativ zeigten sich 6,1 ± 4,1 % CD4+CD25+ Lymphozyten und postoperativ 7,0 ± 4,9 % CD4+CD25+ Lymphozyten.
Bei den Foxp3 Lymphozyten zeigten sich präoperativ 5,0 ± 2,4 % FoxP3+ Lymphozyten, während postoperativ nur noch 2,9 ± 1,7 % FoxP3+ Lymphozyten nachgewiesen werden konnten (Abbildung 26). Dieser Unterschied ist wegen der Fallzahl nicht signifikant.
A B
- 36 -
Immunhistologie
Die immunhistologischen Untersuchungen wurden an Schilddrüsen- und Lymphknotengewebe der untersuchten Patienten durchgeführt.
Es zeigten sich im Lymphknoten- und Schilddrüsengewebe mehr FoxP3+ Zellen bei Patienten mit einem medullären bzw. differenzierten Schilddrüsenkarzinom verglichen mit der Kontrollgruppe.
Die gefärbten lymphozytären Marker CD3, CD4 und CD8 zeigten keine Unterschiede zwischen der Kontroll- und MTC-Gruppe.
Folgende Abbildungen zeigen Auszüge der immunologischen Färbungen für die einzelnen lymphozytären Marker CD3, CD4, CD8 und FoxP3 in 20-facher Vergrößerung von Patienten aus der Kontroll- und MTC- bzw. DTC-Gruppe.
- 41 -
Di D is sk ku us ss s io i on n
In der Literatur wurden regulatorische T-Zellen und ihre hemmenden Fähigkeiten erstmalig in den 1970er Jahren von Gershon et al. beschrieben (Gershon, 1971).
Die regulatorischen Lymphozyten gerieten wieder in Vergessenheit, bis sie fünf Jahre später erstmalig im Zusammenhang mit Tumorimmunität von Sehon et al.
„wiederentdeckt“ wurden (Fujimoto, 1975). Seit dieser Zeit wurden regulatorische T-Zellen in Zusammenhang mit Tumoren und Autoimmunität kontrovers diskutiert.
Es konnte in einigen Untersuchungen gezeigt werden, dass regulatorische T- Zellen in Adenokarzinomen erhöht waren, wie z.B. im Ovarial-, Brust-, Lungen, Pankreas- und Kolonkarzinom (Curiel TJ, 2004), (Ling KL, 2007), (Liyanage UK, 2002). Über Adenokarzinome der Schilddrüse, sowie über das neuroendokrine Karzinom der Schilddrüse, das medulläre Schilddrüsenkarzinom, wurden bis zu Beginn unserer Studie keine Untersuchungen im Zusammenhang mit regulatorischen T-Zellen publiziert.
Die Besonderheit dieser Studie zeigt sich nicht nur in den erstmalig erhobenen Daten regulatorischer T-Zellen im Schilddrüsenkarzinom, sondern auch in den gleichzeitig erhobenen Daten einer Kontrollgruppe ohne Karzinomdiagnose. Die Kontrollgruppe besteht aus Personen, welche bis auf die gutartige Wucherung der Schilddrüse (Struma multinodosa) und der daraus resultierenden Indikation einer operativen Therapie, keine weiteren Erkrankungen aufweisen. Patienten mit einer autoimmunologischen Erkrankung der Schilddrüse, einem Morbus Basedow oder einer Hashimoto-Thyreoditis, wurden aus der Kontrollgruppe ausgeschlossen. Die Daten der Patienten der Kontrollgruppe zeigen somit die Verteilung regulatorischer T-Zellen im gesunden humanen Blut und Lymphknotengewebe auf. Es konnten so Veränderungen der regulatorischen T-Zellen im direkten Vergleich zwischen Karzinomgruppen und einer normalen Kontrollgruppe ermittelt werden. Viele der o.g. Untersuchungen weisen ein derartiges Patientenkollektiv nicht auf, sondern vergleichen regulatorische T-Zellen nur innerhalb eines Karzinom-Kollektivs.
Die durchgeführte Bestimmung der CD45+ Lymphozyten im peripheren Blut und Lymphknotengewebe sowie ihre Verteilung auf T-, B- und NK-Zellen zeigen in allen Gruppen eine gleiche Verteilung auf, sodass dies eine konstante Qualität der
- 42 -
untersuchten Proben bestätigt und eine Vergleichbarkeit der erhobenen Daten besteht.
Das erste Ziel der Studie war es die Häufigkeit regulatorischer T-Zellen (FoxP3+Lymphozyten) im peripheren Blut sowie Lymphknotengewebe bei Patienten mit einem medullären Schilddrüsenkarzinom im Vergleich zu gesunden Patienten zu untersuchen. Es konnte in den FACS-Analysen im peripheren Blut von Patienten mit medullärem Schilddrüsenkarzinom eine signifikante Erhöhung FoxP3+Lymphozyten (p=0.02) im Vergleich zur Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Im Lymphknotengewebe konnte eine Erhöhung von FoxP3+Lymphozyten gezeigt werden, welche jedoch keine Signifikanz erreichte.
Die immunhistochemischen Färbungen in Lymphknoten- und Schilddrüsengewebe bei Patienten mit einem medullärem Schilddrüsenkarzinom waren in der Lage die vermehrten FoxP3+ Zellen zu visualisieren. Es konnte dabei gezeigt werden, dass die vermehrten regulatorischen T Zellen im jeweiligen Gewebe diffus verteilt waren. Die jetzt erhobenen Befunde sind ein erster Hinweis für eine tumorbiologische Bedeutung regulatorischer T-Zellen auch beim MTC. Weitere Untersuchungen sind dabei angezeigt, wobei wegen der geringen Inzidenz des MTCs Multizenterstudien mit ihren dann wieder eigenen Limitationen notwendig sein werden.
Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen im Lymphknoten- und Schilddrüsengewebe von Patienten mit einem medullären Schilddrüsenkarzinom könnten ein Hinweis auf eine autologe „Produktion“ FoxP3+ Zellen des Tumors sein, welche von anderen Gruppen beschrieben wurden (Hinz S, 2007). So könnte der Tumor, durch Induktion verschiedener Botenstoffe, eine Konvertierung von den ihn umgebenden T-Zellen in regulatorische T-Zellen anregen, um so eine adäquate körpereigene Immunantwort auf das tumoröse Geschehen zu unterdrücken. So könnten sich Malignome gezielt den Angriffen des Immunsystems ihres Wirtes entziehen.
Für die genaue Herkunft und Bedeutung der Infiltration Tumor-naher Lymphknoten sowie die Infiltration des Schilddrüsengewebes mit FoxP3+ Zellen werden jedoch weitere Studien nötig sein.
- 43 -
Es konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass in Zusammenschau mit der Tumorklassifizierung (UICC) eine Korrelation zwischen der Erhöhung der FoxP3+Lymphozyten im peripheren Blut der MTC-Patienten und der Größe, Streuung und Metastasierung des medullären Schilddrüsenkarzinoms einhergeht.
So könnten FoxP3+Lymphozyten prä- und postoperativ klinischen Nutzen haben.
Die Bedeutung der FoxP3+Lymphozyten könnte präoperativ als Screening- Instrument dienen und vor allem als Entscheidungshilfe zur Indikation einer prophylaktischen Thyreoidektomie bei einem genetisch belasteten Patienten helfen. Da hiervon häufig Kinder betroffen sind, könnte eine Thyreoidektomie zu einem optimierten Zeitpunkt erfolgen, der einerseits eine größtmögliche onkologische Sicherheit, andererseits ein normales Wachstum mit eigener Schilddrüsenfunktion ermöglichen würde. Regulatorische T-Zellen könnten so neben Calcitonin ein weiterer Entscheidungsparameter werden. Dies könnte auch für die Tumornachsorge gelten.
Anfänglich wurden regulatorische T-Zellen durch die Oberflächenmarker CD4 und CD25 charakterisiert, bis der intrazelluläre Marker FoxP3 als zuverlässigster intrazellulärer Marker für regulatorische T-Zellen galt. Die Untersuchung der CD4+CD25+Lympohzyten zeigte in dieser Studie keine signifikante Differenz zwischen Struma- und Karzinompatienten.
In Zusammenschau mit der signifikanten Erhöhung der FoxP3+Lymphozyten im peripheren Blut der MTC-Patienten, bestätigt dies, die vielfach aufgezeigte Variabilität der regulatorischen T-Zellen und zeigt ebenfalls, dass die anfängliche strenge Zuordnung der regulatorischen T-Zellen zu CD4+CD25+ Zellen nicht zutreffend ist. Die Komplexität der regulatorischen T-Zellen und ihrer Funktionen spiegelt sich in den verschiedenen Subphenotypen wider, welche in verschiedenen Forschungsarbeiten publiziert wurden. So wurden in späteren Studien definierte Profile zur Differenzierung einer T-Zelle zu einer regulatorischen T-Zelle auf Genomebene entdeckt, welche in ihrer Vielfalt und Variabilität in keiner anderen immunologischen Zelle aufzufinden ist (Feuerer M, 2009), (Hill JA, 2007).
In aktuellen Studien wurde diskutiert, FoxP3 nicht als absoluten Marker für regulatorische T-Zellen zu verwenden , da es noch weitere, nicht an FoxP3 gebundene Gene gibt, welche der Differenzierung zu einer regulatorischen T-Zelle dienen. Für zukünftige Studien ist eine Klassifizierung der regulatorischen T-Zellen
- 44 -
auch weiterhin mit dem intrazellulären Marker FoxP3 durchführbar, jedoch sind weitere Marker, wie z.B. CD4, CD8 oder CD103, welche weiteren Aufschluss über Herkunft bzw. Funktion der regulatorischen T-Zellen geben könnten hilfreich (Feuerer M, 2009).
Bei der Auswertung unserer FACS-Untersuchungen zeigte sich eine deutliche Erhöhung der FoxP3+CD4-CD25-Lymphozyten in Patienten mit medullärem Schilddrüsenkarzinom. Im Zusammenhang mit einer in der Immunhistologie sichtbaren Vermehrung der CD8+Zellen im Karzinom-, Lymphknoten- und Schilddrüsengewebe im Vergleich zum Gewebe der Kontrollgruppe sowie in Bezug auf die aktuelle Literatur, könnte man postulieren, dass diese Zellen der Population der CD8+Tregs entstammen (JY., 2008), (Feuerer M, 2009). Aus heutiger Sicht wäre es sinnvoll gewesen eine Doppelfärbung hinsichtlich CD8+Foxp3+ Lymphozyten in den FACS-Analysen anzufertigen. Da die Debatte über weitere Populationen regulatorischer T-Zellen, wie z.B. CD8+Tregs, erst nach Abschluss der Konzeption unserer Forschungsarbeiten aufgenommen wurde, konnten wir dieser in unserer Studie nicht weiter nachgehen (Smith TR, 2008).
Bei Untersuchungen am Kolorektalem Karzinom konnte eine erhöhte Anzahl von CD8+Tregs nachgewiesen werden, welche in ihren suppressorischen Fähigkeiten die der CD4+Tregs ergänzen und somit das Wachstum des Tumors ebenfalls begünstigen (Chaput N, 2009). Eine weitere Gruppe konnte zeigen, dass CD8+Tregs hauptsächlich über die Produktion von Interleukin 10, welches wiederum IFN-γ beeinflusst, fungieren und aktivierte T-Zellen supprimieren (Rifa'i M, 2008)(Endharti AT, 2005). CD4+Tregs wirken überwiegend über Zell-Zell- Kontakt, jedoch auch über Zytokinausschüttung (TGF-ß) können sie nicht aktivierte T-Zellen unterdrücken (Trevor R.F. Smith, 2008), (Kazuhiko Nakamura, 2001).
Ein weiterer Funktionsweg der CD8+Tregs könnte indirekt supprimierend sein, indem sie durch ihre autologe TGF-ß und IL-10 Expression wiederum CD4+Tregs induzieren, welche ihrerseits, wie bereits erwähnt, das Immunsystem direkt unterdrücken (Roberts SJ, 2007).
Weiterführend wurde gezeigt, dass eine erhöhte Anzahl CD4+Tregs wiederum CD8-Memory-Zellen rekrutieren und diese zu zytotoxischen T-Zellen aktivieren.
So beeinflussen CD4+FoxP3+ regulatorischen T-Zellen, den Interleukin 2 Spiegel
- 45 -
in der Expansionsphase der CD8 Effektorzellen, um so dessen Wachstum und Proliferation zu stärken (de Goër de Herve MG, 2012). Dies zeigt, dass die Untersuchungen zu regulatorischen T-Zellen, welchen bisher ein immer nur supprimiernder Charakter zugeschrieben wurde, bei Karzinomen erst in den Anfängen steckt.
Es stellt sich die Frage, ob die durch das Tumorwachstum induzierten CD8+Tregs einen ausreichenden indirekten inhibitorischen Effekt haben und eine Erhöhung regulatorischer T-Zellen auf diesen Mechanismus zurückzuführen ist, oder ob eine schon vorher erhöhte Anzahl CD4+regulatorischer T-Zellen die Entstehung des medullären Schilddrüsenkarzinoms begünstigt hat, welches wiederum die CD8+Tregs induziert hat.
Zusammenfassend konnte eine signifikante Erhöhung FoxP3+Lymphozyten im Blut der Patienten mit medullärem Schilddrüsenkarzinom verglichen mit Struma- Patienten gezeigt werden. Diese korrelierte mit dem Schweregrad des Karzinomleidens. Aufgrund der beschriebenen Variabilitäten von Oberflächenmarkern auf regulatorischen T-Zellen (CD4, CD25, CD8), zeigt sich der intrazelluläre Transkriptionsfaktor FoxP3 aktuell als der zuverlässigste Marker für die Gesamtheit regulatorischer T-Zellen.
Weiter bestätigen die Ergebnisse, dass FoxP3 in Zukunft als diagnostischer und prognostischer Marker im medullären Schilddrüsenkarzinom dienen könnte und besonders im Zusammenhang mit familiär belasteten Patienten ein zusätzliches diagnostisches Entscheidungskriterium, neben Calcitonin und dem Pentagastrin- Test, darstellen könnte.
Die dadurch bedingte frühzeitige Diagnosestellung könnte so auch Einfluss auf die hohe Metastasierungsrate des medullären Schilddrüsenkarzinoms nehmen, welche meist durch zu späte Diagnosestellung zustande kommt.
Gegenstand weiterer Forschungen sollten weiterführend die genauen Wirkmechanismen, Zusammenhänge und Zielstrukturen der regulatorischen T- Zellen sein, um das heutige Wissen in therapeutische Ansätze umsetzen zu können.
Das Ziel des zweiten Vergleichs der Untersuchungen, war es zu sehen, ob sich beim Adenokarzinom der Schilddrüse, also den differenzierten
- 46 -
Schilddrüsenkarzinomen, ebenfalls eine erhöhte Anzahl regulatorischer T-Zellen findet und ob diese ebenfalls als prognostischer Marker genutzt werden können.
Die dargestellten Ergebnisse zeigen eine signifikante Erhöhung FoxP3+Lymphozyten im peripheren Blut sowie im Lymphknotengewebe der untersuchten Patienten im Vergleich zu unserer Kontrollgruppe. Dies wurde durch die immunhistochemischen Untersuchungen unterstrichen. Dort zeigten sich vermehrt FoxP3+ Zellen im Lymphknoten- sowie im Schilddrüsengewebe der Karzinompatienten.
In weiter führenden Untersuchungen des peripheren Blutes der Karzinompatienten nach erfolgter Thyreoidektomie und Lymphadenektomie ist eine deutliche Reduktion regulatorischer T-Zellen im Vergleich zu nicht-therapierten bzw.
präoperativen Patienten zu sehen. Die Vermehrung FoxP3 positiver Zellen wird durch eine radikale operative Resektion des Karzinoms wieder normalisiert.
So zeigen diese Ergebnisse, dass FoxP3 als diagnostischer sowie auch als prognostischer Marker genutzt werden kann. So könnte die Anzahl FoxP3+Lymphozyten im peripheren Blut postoperativer Patienten als Tumormarker verwendet werden. Dies würde bestehende Marker, wie z.B. Thyreoglobulin, diagnostisch gut ergänzen, zumal diese Marker durchaus ihre Limitationen haben.
In einer Studie konnte gezeigt werden, dass selbst Patienten mit einem postoperativen, nicht-stimulierten Thyreoglobulin unter 0,6ng/mL ein Rezidiv entwickeln können (Robenshtok E, 2012).
Auch präoperativ könnte FoxP3 eine weitere Entscheidungshilfe darstellen. So stellen die Ultraschalluntersuchungen der Schilddrüse und die bei verdächtigem Befund anschließende Feinnadelpunktion den Goldstandard bei der Diagnostik eines Schilddrüsenkarzinoms dar. Die hohe Rate von Nachresektionen nach inkompletter Schilddrüsenresektion bei einem Zufallsbefund eines Schilddrüsenkarzinoms zeigen auf, dass weitere diagnostische Verfahren hilfreich sein können (Ito Y, 2008). Um ein zweizeitiges Vorgehen und dessen Risiken zu verhindern, muss die präoperative Diagnostik um weitere Marker erweitert werden.
So könnte in Zukunft eine bestimmte Häufigkeit an regulatorischen T-Zellen im peripheren Blut der Patienten eine Operationsindikation zu einer Thyreoidektomie darstellen, da die Wahrscheinlichkeit eines malignen Tumors in der Schilddrüse
- 47 -
damit erhöht wäre. Besonders wichtig ist die Abgrenzung des Schilddrüsenadenoms zum gut differenzierten Karzinom. In diesem Bereich könnten zukünftig prospektive Untersuchungen für eine Validierung der regulatorischen T-Zellen als Tumormarker sorgen.
Wir konnten in unserer Studie zeigen, dass die CD4+CD25+Lymphozyten im peripheren Blut von Patienten mit einem differenzierten Schilddrüsenkarzinom im Vergleich zu den Kontrollpatienten signifikant erhöht waren. Im Vergleich zu Untersuchungen am medullären Schilddrüsenkarzinom zeigen sich hier zwischen den unterschiedlichen Karzinomen Unterschiede. Patienten mit einem medullären Schilddrüsenkarzinom zeigen weder im peripheren Blut noch im Lymphknotengewebe eine signifikante Erhöhung der CD4+CD25+Lymphozyten (Müller S, 2010). Dies lässt darauf schließen, dass die verschiedenen Karzinome, das differenzierte Schilddrüsenkarzinom als ein Adenokarzinom und das medulläre Schilddrüsenkarzinom als ein neuroendokrines Karzinom, unterschiedliche Regulierungsmechanismen auf regulatorische T-Zellen haben.
So zeigt das medulläre Schilddrüsenkarzinom einen deutlichen Unterschied zur Kontrollgruppe in Bezug auf die Oberflächenexpression von CD4 und CD25 auf FoxP3+Lymphozyten (Müller S, 2010), während dies beim differenzierten Schilddrüsenkarzinom nicht nachweisbar ist. So zeigt sich beim differenzierten Schilddrüsenkarzinom ein quantitativer Unterschied zur Kontrollgruppe, aber kein qualitativer in Bezug auf die Expression der Oberflächenmarker CD4 und CD25.
Karzinome haben einen unterschiedlichen Einfluss auf regulatorische T-Zellen.
Nicht nur unsere Untersuchung zeigt, dass im Umfeld von Karzinomen Tregs vermehrt auftreten. Welche Tregs jedoch wo auftreten, scheint zwischen den unterschiedlichen Karzinomen zu variieren. Im Rahmen der translationalen Karzinomforschung muss deshalb zwischen unterschiedlichen Karzinomentitäten differenziert werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass auch beim differenzierten Schilddrüsenkarzinom FoxP3+Lymphozyten im peripheren Blut und Lymphknotengewebe signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht ist. FoxP3 zeigt sich, in Zusammenschau mit den Befunden beim medullären Schilddrüsenkarzinom, als ein möglicher biologischer Marker für Malignome in der
- 48 -
Schilddrüse und könnte in Zukunft als diagnostischer und prognostischer Marker genutzt werden.
Langfristig könnte neben diagnostischen Möglichkeiten auch eine therapeutische Option durch eine gezielte Beeinflussung der regulatorischen T-Zellen bestehen.
Tumor-Vakzinierungen könnten durch eine Reduktion spezifischer regulatorischer T-Zellen eine erfolgreiche Therapie darstellen. Eine unspezifische Depletion regulatorischer T-Zellen erscheint beim aktuellen Kenntnisstand allerdings fragwürdig, zumal die Auswirkungen einer Reduktion regulatorischer T-Zellen bei Autoimmunerkrankungen sichtbar sind.
- 49 -
Ab A bb bi il ld du un ng gs s ve v er r z z ei e ic ch hn ni is s
Abbildung 1: CD45+ Zellen im a) peripheren Blut und b) Lymphknotengewebe ... 16 Abbildung 2: CD3+CD4+Zellen im a) peripheren Blut und b) Lymphknotengewebe ... 16 Abbildung 3: Permeabilisiert und fixierte CD45+Zellen aus peripherem Blut ... 17 Abbildung 4: FoxP3+CD4+ Zellen im peripheren Blut a) im Gate b) lineare
Darstellung ... 17 Abbildung 5: FoxP3+CD25+ Zellen im peripheren Blut a) im Gate b) lineare
Darstellung ... 17 Abbildung 6: Isotypkontrolle CD4+ Zellen im peripheren Blut a) im Gate b) lineare
Darstellung ... 18 Abbildung 7: Isotypkontrolle der CD25+ Zellen im peripheren Blut a) im Gate b)
lineare Darstellung ... 18 Abbildung 8: Verteilung der CD45+Lymphozyten in der Kontrollgruppe (LK=
Lymphknoten, Blut = peripheres Blut, MW= Mittelwert) ... 21 Abbildung 9: CD4+CD25+- und FoxP3+- Lymphozytenverteilung in
CD45+Lymphozyten in der Kontrollgruppe im peripheren Blut ... 22 Abbildung 10: CD4+CD25+- und FoxP3+- Lymphozytenverteilung in
CD45+Lymphozyten im Lymphknotengewebe der Kontrollgruppe ... 22 Abbildung 11: Vergleich der Verteilung der CD45+Lymphozytenpopulation im
peripheren Blut zwischen der MTC-Gruppe und der Kontrollgruppe (MTC=
medulläres Schilddrüsenkarzinom, MW= Mittelwert) ... 23 Abbildung 12:Vergleich der Verteilung der CD45+Lymphozyten im
Lymphknotengewebe zwischen der MTC-Gruppe und der Kontrollgruppe (MTC=medulläres Schilddrüsenkarzinom, MW= Mittelwert) ... 23 Abbildung 13: CD4+CD25+ Zellen in CD45+Lymphozyten der MTC-Gruppe im
Vergleich mit der Kontrollgruppe im A) peripheren Blut der MTC-Gruppe und B) im Lymphknotengewebe (MTC=medulläres Schilddrüsenkarzinom, MW=
Mittelwert) ... 24
