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des Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besseren

Durchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter das eingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, die Texterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichen Dateien mit Fehlern behaftet.

Alle mehr als 700 Protokolle (Anfang 2007) können auf der Seite

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Zudem stehen auf der Seite www.chids.de weitere Versuche, Lernzirkel und Staatsexamensarbeiten bereit.

Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007

Lehramtsstudenten

Thema: Einführung in die Enzymologie

Sommersemester 1989 Fachbereich Chemie Datum: 21.06.1989

Referent: Julius Zander

INHALT:

r>.

Seite

Definitionen ...•••..•••••••••....••... 1

Enzyms trukt ur . • • • • . . . • • . . . . • . . • • . . . . • • • • . .. 1

Spezifität . • • • . • • . . . . • . . . • . • • . . • . • • . . . . • 3

Energiediagramm der Katalyse ...•...•...•....•..•.•••• 5

Nomenkla tur. . • . . . . • • .. . .. .. • • • • • .. • • . • • • • . . . • . .. • . . . • . . .. . .. • . . .. •• 5

Versuch Nr. 2: Eiweißspaltung durch Peps in . . . .

6

Versuch Nr. 3: Phosphatase in Frischmilch • • • . • • . . . .

7

Versuch Nr. 4: Aldehyddehydrogenase in Frischmilch .•..••..•

⁹

Versuch Nr. 5: Peroxidase in Meerrettich ...••.••...••..••.. 11

Versuch Nr. 6: Katalase in Kartoffeln . • . . . • . • • • • • • . . • . . 14

VERSUCHTSTEIL B: REAKTIONSKINETIK Versuch Nr. 7: Harnstoffspaltung durch Urease 16 Quantitative

Enzymkinetik: 17

Versuch Nr. 8: Michaelis-Konstante von Hefe-ADH • . • . . • . . . • 20

Versuch Nr. 9: Hemmung der Lipase ••••...•••... 24

HEMMUNGSTYPEN

25

Li

tera turl

i

s te 27

ANHANG:

FOLIEN

ÄNDERUNG DES PH - WERIES BEI DER HARNS1UFFSPAL1UNG llJRCH UREASE ERMI'ITIlJNG DER MIOIAELIS- KCIlm'ANTEN :

- EXTINJITIOOSÄNDERUNG - L INEWFAVER- BURK- DIAGRAMM PROORAMMLISTING DES LEHRFII..MFß

1. DEFINITIONEN

Enzyme sind hochmolekulare, kolloid im Cyto- plasma gelöste Proteine,

bzw.

Proteide, die

in

der lebenden Zelle in einem komplizierten, als Translation bezeichneten Prozeß

an

den Riboso-

men

synthetisert werden.

Enzyme katalysieren biochemische Reaktionen des Zellstoffwechsels.

Nahezu jede biochemische Reaktion im lebenden Organismus wird durch Enzyme katalysiert.

Die von den Enzymen umgesetzten Substanzen nennt man SUBSTRATE (siehe auch

Folie Nr.

1). _~ Allerdings können Enzyme eine Reaktion nur bis

zur

Einstellung

des

thermodynamisch möglichen Gleichgewichts, nicht darüber hinaus, beschleu- nigen.

Ein kleines Zahlenbeispiel soll die Wichtigkeit enzymatischer Reaktionen

für

den Organismus verdeutlichen: für eine biochemische Reaktion, die in der Zelle in wenigen Minuten abläuft, wird eine Reaktionszeit von

etwa 300

Jahren an- genommen,

falls

die Reaktion nichtkatalysiert ablaufen sollte.

2. ENZYMSTRUKTUR

~-~:

l~ e.'....

<..-

GI.-

\f'4-r~. ~

Enzyme bestehen aus Ketten miteinander ver- knüpfter Aminosäuren, also aus Polypeptiden.

Die

Reihenfolge der Aminosäuren bezeichnet man

auch als die Primärstruktur der Eiweiße. Die Peptidbindung, die Veresterung der Carbonsäure~

mit der Aminogruppe der Aminosäuren, weist in- folge einer tautomeren Grenzstruktur eine ein- geschränkte Drehbarkeit der -C-N-Bindung auf^I die die Enzyme

in

ihrer räumlichen Struktur fi- xiert. Aber nicht nur dieser tautomere Effekt, auch verschiedene intermolekulare Kräfte, wie Wasserstoffbrücken benachbarter Gruppen, ~

fidbindungEill,

zwischen Cysteinresten,

ionische

Anziehungskräfte oder Anziehungskräfte zwischen

IjLpophflen

Gruppen

sind EffeKte, die die räum-

liche (tertiäre) Struktur der Enzyme festlegen

(siehe Folie Nr. 2).

Um Enzyme als Eiweiße nachzuweisen, gibt es mehrere einfache Reaktionen:

! -.s ^/A(J

ICI-V. ~~

f'1~/.( .

VERSUCH Nr. 1:

Biuret-Reaktion, ein Eiweißnachweis

- Versuchsdurchführung:

in einem Reagenzglas löst man elnlge Milligramm eines Enzymes (in diesem Fall Trypsin, eine Protease) in aqua dest. auf. Man stellt die Lösung mittels Natronlauge auf einen alkali- schen pH-Wert ein (etwa

pH=10)

und gibt ein bis zwei Tropfen einer l%-igen CUS04-Lösung hinzu.

Die schnell einsetzende violette Färbung deutet

auf

einen Chelatkomplex der Kupferionen mit den Stickstoffen der Peptidbindungen hin (siehe Fo-

lie Nr. 3).

ENZYMSTR UKTUR

Durch die dreidimensionale Faltung der Polypep- tidkette entstehen nun ganz bestimmte Bindungs- zentren, an die Substratmoleküle, aber auch ähnlich

gebaute Moleküle

angreifen können.

Diese Bindungszentren nennt man aktive Zentren.

Bindungsstellen, an die das Substratmolekül nicht, aber andere Moleküle angreifen können, werden allosterische Zentren genannt.

In Folie Nr. 4 ist am Beispiel einer Rinder-Ri- bonuclease die Tertiärstruktur rekonstruiert.

Im aktiven Zentrum ist ein Phosphation gebunden.

Wie nun die Enzym-Substrat-Bindung erfolgt, wird in einem kleinen Lehrfilm gezeigt, dessen

Programmlisting am Ende des Protokolls aufge- führt

ist.

Das

Enzym

weist ein aktives Zentrum auf, an welches ein Substratmolekül ankoppeln kann. Die

Enzym-Substratbindung kann

durch das Schlüssel- Schloß-Modell schematisch beschrieben werden.

Nach Ankoppeln des Substratmoleküls spricht man vom ENZYM-SUBSTRAT-KOMPLEX.

Dieser geht nun aufgrund der veränderten chemi- schen Bindungsenergie in einen aktivierten Zu- stand über und verändert seine Konformation.

Durch diese Konformationsänderung erfolgt ein

Bindungsaufbruch

des Substratmoleküls ,

so

daß der Enzym-Substrat-Komplex in den

ENZYM-

PRODUKT-KOMPLEX übergeht.

Die erneut veränderten chemischen Bindungs-

kräfte verursachen ein Ablösen der Produktmole-

küle, so daß das Enzym seine ursprüngliche Kon- formation wiedergewinnt. Zusammenfassend läßt sich formulieren:

E + S

<====>

ES

ES <====> EP

EP

<====>

E + Pl + P2+ •••

Dieser Prozeß läßt sich durchaus auch umgekehrt formulieren, daß also mehrere Substratmoleküle zu einem Produktmolekül vereinigt werden.

Enzyme können nicht nur als Proteine vorliegen, sondern auch mit anderen Molekülen in Wechsel- wirkung treten, Molekülen, die niedermolekulare Wirkgruppen darstellen und irreversible oder reversibel gebunden werden.

Im

Falle einer irreversiblen Bindung spricht man ^von

PROSTHETISCHEN

GRUPPEN, im ^{Fall einer} reversiblen Bindung bezeichnt man die hinzutre- tende Gruppe als das

COENm

(genauer als das COSUBSTRAT),

^{das Enzym}

als APOENZYM, den zusam- mengelagerten Komplex als

HOLOENZYM.

In Folie

Nr. 5

sind

im

Falle einer

Dehydrierung

einer Aminosäure (ein wichtiger Schritt im Prozeß der Oxidation von Aminosäuren zu den entsprechenden Carbonsäuren) und der Oxidation eines Gly- cerinsäurederivats zum entsprechenden Aldehyd

Prozesse

beschrieben, in denen

NAD, bzw. FAD

als Cosubstrat, bzw. als prosthetische Gruppe in den Stoffwechselmetabolismus eingreifen.

3. SPEZIFITAT

Die Existenz eines chemisch aktiven Bindungs- zentrums hat mehrere Effekte zur Folge.

Zum Beispiel kann man Enzyme in ihrer Spezifi- tät unterscheiden.

Man spricht zum einen von

a) Substratspezifität:

Diese beruht auf dem

spezifischen PASSEN

des Substratmoleküls am aktiven Zentrum des Enzyms.

Man

unterscheidet~yme,

die eine geringe Sub- stratspezifi tät

best

tzen, also von vielen un- terschiedlichen Substratmolekülen angegriffen

(

,---,

werden können,

von Enzymen, die

auf

bestimmte Molekülgruppen eingestellt sind oder von

hoch- spezifischen Enzymen, die nur auf

ein speziel- les

Substratmolekül reagieren.

b) Wirkungsspezifität:

Diese

besagt, daß Enzyme

nur

eine

von vielen

thermodynamisch

möglichen Umsetzungen

kataly- sieren.

Die Wirkungsspezifität wird durch

den

Protein- anteil des Enzyms determiniert.

Manchmal kann ein

Enzym

auch in verschiedenen

Formen

vorliegen

(sich zum

Beispiel in seiner Ladung ändern). In diesem Fall spricht man von

ISOENZYMEN

(siehe

auch

Folie

Nr. 6).

c)

Milieuspezifität:

Da

Enzyme im zellulären

Milieu

ihre

Aufgaben

erfüllen, sind sie auf

bestimmte

zelluläre Fak- toren eingestellt (siehe Folie Nr. 7).

Zum

einen

wird ihre Akti

vi

tä t

durch

die Temperatur

bestimmt, die

im Verlauf

einer OPTIMUM-KURVE

entspricht. Enzymatische Reaktio-

nen verlaufen um

40

⁰

C

am schnellsten, darüber hinaus ist ein zunehmender Aktivitätsverlust

festzustellen,

der

auf

der DENATURIERUNG der Enzyme beruht. Bei höheren

Temperaturen

nimmt nämlich

die

Kraft polarer Bindungskräfte ab (während die hydrophober Wechselwirkungen an- steigt). Es

setzt

also eine

Veränderung

der räumlichen

struktur

der Enzyme ein. Dieser Pro-

zeß

setzt

sich sowei t

fort,

daß die Proteine

vollkommen ihre

tertiäre

Struktur

(und dami

t natürlich

ihre Wirksamkeit) verlieren

und "auf-

fasern

^{11 •}

Aber nicht nur die Temperatur, auch der Ionen- gradient oder

das

Redoxpotential

haben einen

Einfluß auf die Enzymaktivität. Viele Ionen kooperieren mit Enzymen, stellen prosthetische Gruppen dar, die den Enzymen erst

zu

ihrer Ak-

tivität

verhelfen.

Die Bindung von Disiulfidbrücken wird maßgeb- lich durch das Redoxpotential gesteuert, so daß die Tertiärstruktur beeinflußt werden kann.

Einer der wichtigsten Effekte wird allerdings durch den pH-Wert gesteuert. Viele enzymatische Reaktionen sind in ihrem Aktivitätsverlauf pH-

abhängig,

da sie im aktiven Zentrum Carboxyl- oder Aminogruppen tragen, die protoniert, bzw.

deprotoniert werden können. Die Folge ist ein Einschränken bzw. ein Effektivieren der enzyma- tischen Aktivität bei niedrigem oder hohem pH- Wert (siehe auch Folie Nr. 8).

4. ENERGIEDIAGRAMM DER KATALYSE

Auf Folie Nr. 9 ist das Energiediagramm enzyma- tischer Reaktionen dargestellt. Enzymatische Reaktionen sind in der Lage, durch die Bildung der Enzym-Substrat- bzw. der Enzym-Produkt-Kom- plexe

die Aktivierungsenergie für die

Ein- zelschri t te herabzusetzen, so daß nicht mehr eine große Energiebarriere wie für nichtkata- lysierte Reaktionen übersprungen werden muß, sondern viele kleine Energiebarrieren. Durch dieses Herabsetzen der Aktivierungsenergie für die Einzelschritte können chemische Reaktionen erheblich schneller ablaufen, das chemische Gleichgewicht kann allerdings nicht verändert werden.

5. NOMENKLATUR

1961 hat eine internationale Enzymkommission der IUPAC Regeln für eine allgemeingültige No- menklatur der

Enzyme

aufgestell t.

Früher gab

man den Enzymen Trivialnamen, die sich aus dem Namen des Substrates, welches sie umsetzten und der Endung -ase zusammensetzten (Beispiel UREASE für das harnstoffspaltende Enzym). Da allerdings in der Zwischenzei

t

eine Vielzahl anderer möglicher Umsetzungen bekannt geworden war, war die alte Nomenklatur überholt. Man einigte sich darauf, die Enzyme in 6 verschiedene Klassen zu unterteilen:

1. Oxido-Reduktasen

2. Transferasen

3. Hydrolasen

4. Lyasen

5. Isomerasen

6. Ligasen

Jede Klasse ist nocheinmal unterteilt und zwar

aufgrund der spezifische

Wirksamkei

t der En-

zyme. So erhalten die Enzyme also eine Ziffern- kombination, die sie exakt einordnen

läßt

(siehe Folie Nr. 10).

VERSUCH Nr. 2:

Eiweißspaltung durch

PEPSIN

Um

die

bisher angeführten Tatsachen zu unter- mauern, soll ein Versuch durchgeführt werden, in dem die Temperatur- und pH-Abhängigkeit einer enzymatischen Reaktion beobachtet werden

soll.

Als Substrat dient koaguliertes Eiweiß, welches aus Eiklar, das mit aqua dest. geschüttelt

wurde,

gewonnen wird.

Zu 5 Proben gibt

man

nun der Reihe nach:

a)

^H20

b)

Pepsin

c)

Pepsin + Salzsäure

d)

erhitztes Pepsin

e) erhitzte Lösung von Pepsin und Salzsäure.

Zu erwarten ist folgendes:

(a) Das trübe Koagulat bleibt unverändert.

(b) Es

t r i t t kein Aufklaren

des

Koagulats auf,

da

Pepsin

nur im

sauren Bereich

wirksam

ist.

(c) Nach einiger Zeit tri t t ein Aufklaren des Koagulats auf, da Pepsin im sauren Milieu die Eiweißketten spaltet

(d) und (e ) Die Lösungen trüben sich ein, da aufgrund der hohen Temperaturen ein Denaturie- ren der Eiweiße einsetzt.

Im

Vortrag funktionierte leider Versuch (c) nicht, was auf einen nicht korrekt eingestell-

ten pH-Wert (vermutlich zu hoch) zurückzuführen sein könnte.

WIRKUNGSWEISE DES PEPSINS:

Das

Pepsin ist ein proteolytisches Enzym, also ein eiweißspaltendes Enzym. Es wird in den Ma- gendrüsen höherer Wirbeltiere gebildet (siehe Folie

Nr.

11), die Vagus- und gastrin-kontrol-

liert

eine

unwirksame Vorstufe

des Pepsins,

~.

nämlich das Pepsinogen aus den Hauptzellen se- zernieren. Bei niedrigem pH-Wert werden nun ei- nige kleinere Peptidketten von dem Pepsinogen abgespal ten, es entsteht das hochwirksame PEPSIN.

Das Pepsin spaltet sich zwar "selber", aber an- scheinend sind Zugaben kleinerer Peptidketten förderlich für die katalytische Aktivität.

Es gibt mehrere Modelle für den katalytischen Mechanismus des Pepsins. Einen plausiblen möchte ich hier vorstellen (siehe auch Folie Nr.12):

Das Pepsin besitzt in seinem aktiven Zentrum zwei Carboxylgruppen, die mi

t

der Ketogruppe eines Polypeptides in Wechselwirkung treten.

Dadurch wird der entsprechende Kohlenstoff po- larisiert und bindet an ein Sauerstoff anion der Carboxylgruppe des Enzyms, es entsteht ein Carbonsäureester. Durch einen Elektronenüber- gang , der durch das "Umklappen" einer Wasser- stoffbrücke initiiert wird, entsteht unter Ab- spaltung einer Peptidkette mit endständiger Carboxylgruppe ein Carbonsäureamid, welches durch Hydrolyse abgespal ten werden kann. Auch hier entsteht eine kleinere Peptidkette, aller- dings mi

t

endständiger Aminogruppe. Das Enzym ist in seinen ursprünglichen Zustand zurückge-

kehrt, die Peptidkette

ist gespalten worden.

Das Pepsin wirkt als Endopeptidase, spaltet also selektiv innerhalb eines Proteins.

VERSUCH Nr. 3:

Phosphatase in Frischmilch

Als 3. Versuch wird der Nachweis einer Phospha- tase in einem Frischmilchansatz demonstriert.

Zum Vergleich wird ein Ansatz mit pasteurisier- ter und ultrahocherhitzter Milch vorgestellt.

,r--

Versuchsaufbau:

+risc.~"';lc~~~"Clh.

< ; 'P<1s~eü.

^{r ;}

sit,tt

~ M;k~

In einem Reagenzglas bereitet man einen Ansatz mit Frischmilch vor, den man mittels Natron- lauge auf einen pH von 9.3 einstellt. Desglei- chen verfährt man mi t einem Ansatz pasteuri- sierter Milch. Im Vortrag gibt man nun einige ml einer Phenolphthaleindiphosphat-Lösung hinzu und inkubiert im Wasserbad bei 40° c. ^Schon

nach kurzer Zeit (etwa

3

min) sollte eine intensive Rosafärbung des Frischmilchansatzes einsetzen, die auf der Freisetzung von Phenolphthalein beruht.

Der Ansatz mit der pasteurisierten Milch sollte im Gegensatz dazu allerdings farblos bleiben.

Der Versuch schlug leider fehl, vermutlich war die Phosphatase-Konzentration im Frischmilchan- satz zu gering. Versuche mi t frischer Milch bergen immer ein bestimmtes Risiko, da ja das nachzuweisende Enzym produziert und in die Milch sezerniert worden sein mußte.

Die Hydrolyse des Phosphatesters erfolgt nach folgendem schematischen Ablauf:

ROP03Hz

+

H20 <====} ROH

+

HOP03H2 R=Phenolphthaleinphosphat

Die Phosphatase in der Milch ist eine alkalische Phosphatase, die also ihr Wirkungsoptimum bei hohem pH-Wert erreicht.

Vermutlich werden dadurch die Phosphatgruppen

des Substrats deprotoniert und können im

aktiven Zentrum der Phosphatase ankoppeln

(siehe auch Folie Nr. 14). Gleichzeitig tritt

der Sauerstoff, der mit dem Rest des

Substratmoleküls verestert ist, mi t einer sauren Gruppe

des

Enzyms in Wechselwirkung.

Dadurch wird die Bindung zwischen dem Phosphor und diesem Sauerstoff abgeschwächt, der Phosphor kann mit dem Sauerstoffatom einer ebenfalls im aktiven Zentrum gebundenen Hydro- xylgruppe in Wechselwirkung treten. Es entsteht ein zyklisches Elektronengas, in dem durch zy- klischen Elektronenübergang das Substratmolekül in Phosphat und Alkohol gespalten wird und durch nachfolgende Hydrolyse die Phosphatgruppe vom aktiven Zentrum des Enzyms abgespalten wird.

Man unterteil

t

die Phosphatasen in Mono- bzw.

Diphosphatasen, je nachdem, ob sie eine oder zwei Phosphatgruppen vom Substratmolekül ab- spalten. Triester werden übrigens nicht enzyma- tisch gespalten.

Unter den Phosphomonoesterasen, zu denen auch die Phosphatase in der Frischmilch gehört, un- terscheidet man die sauren und die alkalischen Phosphatasen (siehe auch Folie Nr. 13).

Saure Phosphatasen sind bei höheren Pflanzen, Bakterien, Pilzen und in höheren Wirbel tieren

(z.B. in hoher Konzentration in der menschli- chen Prostatadrüse) verbreitet und besitzen ein pH-Optimum von 5,4. Bei diesem pH-Wert sind sie nicht nur am aktivsten sondern auch am stabil- sten.

Alkalische Phosphatasen kommen in fast allen tierischen Geweben vor, vor allem in den Kno- chenwachstumszonen, da Phosphat ausgesprochen wichtig für den Knochenbau ist.

Zweiwertige Ionen, wie Mn

2 +

oder Ca

2 +

aktivie- ren die alkalischen Phosphatasen, deren pH-Op- timum bei 9,3 liegt.

(Zur Farbreaktion des Phenolphthaleins siehe auch Folie Nr. 15).

VERSUCH Nr. 4:

Aldehyddehydrogenase in Frischmilch

Ein weiteres Enzym, das in Frischmilch nachzu- weisen ist, ist eine Aldehyddehydrogenase, die auch unter dem Begriff Schardinger-Enzym be- kannt ist.

Die Aldehyddehydrogenase vermag Aldehyde zu den

J~

entsprechenden Carbonsäuren zu oxidieren und dabei gleichzei tig Wasserstoff auf organische Substanzen zu übertragen, also im biochemischen Sinne Reduktionsäquivalente zu produzieren.

- Versuchsaufbau:

""

~,~~<-I,tA.\;

t,

~ ^t- Mt~~yIt",l,tCl~

In ein Reagenzglas mit Frischmilch wird etwa 1 ml Methylenblau und einige ml einer

0,

l%-igen Formaldehydlösung zugegeben und mi ttels 0, 5

n

Natronlauge auf pH 9,5 eingestellt. Mit Paraf- fin wird dieser Ansatz überschichtet und im Wasserbad

bei

etwas

40°

Cinkubiert. Dies ge- schah etwas eine halbe Stunde vor Beginn des Vortrages. Die Aldehyddehydrogenase oxidierte nun

das Formaldehyd

und übertrug dabei Wasser- stoff

auf

das Methylenblau, welches

in

die farblose

Leukoform

überführt wurde.

Ein

Sauer- stoffentwickler

(H202

auf Braunstein, Mn02)

wurde angeschlossen und

eine

(im

Vortrag

aller-

dings nur geringe) Blaufärbung registriert, die

auf

der Reoxidation des Leukomethylens zu Me- thylenblau beruht (siehe zur Oxidation des Me- thylenblaus auch Folie Nr. 17).

Mechanismus der Aldehyddehydrogenase:

Das Formaldehyd geht in wässriger Lösung sehr

schnell

in seine Hydratform über. Diese (ei- gentlich ein Alkohol!) wird nun nach einem

nicht näher

beschriebenen

Mechanismus von

der

Aldehyddehydrogenase zu Ameisensäure oxidiert,

wobei zwei Wasserstoffatome auf Methylenblau

übertragen werden. Dieses geht dadurch in seine

Leukoform über

(siehe auch Folie

Nr. 16). Im

Gegensatz zur Leukoform weist die farbige Form

des Methylenblaus ein über drei aromatische

Ringe verteiltes delokalisiertes pi-Elektronen- System auf, welches die Farbigkeit des Moleküls verursacht.

VERSUCH Nr. 5:

Reaktion der Peroxidase aus Meerrettich

In hohen Konzentrationen findet sich im Meer- rettich ein Enzym, welches wie die Aldehyddehy- drogenase zur Klasse der Oxido-Reduktasen ge- zählt wird. Oft wird es mit einem weiteren En- zym, der Katalase, welche im Anschluß vorge- stellt wird, verwechselt.

- Versuchsaufbau:

Mcc.rrcH;c~- ~)CI,..~

f

~

f'yrOjofl.1 · _Lc~.

Versuchsdurchführung:

In einem hohen Becherglas werden 200 ml einer

Pyrogallol/H202-Lösung vorbereitet (dazu bringt

man in

einen 250

ml-Rundkolben

190 ml aqua

dest., 10 ml frisch berei tete 5%-ige Pyrogal-

lol-Lösung und 1 ml frische 0, 5%-ige

H2 02

-Lö-

sung

und

vermischt gut). Auf laufendem Magne-

trührer werden einige ml eines Meerrettich-Ex-

,~

sung dunkelviolett, um nach Zugabe einiger Tropfen Salzsäure (1 m) sich nach rötlich- orange aufzuhellen.

Diese Reaktion verläuft sehr schnell und ver- deutlicht die hohe Wechselzahl der Peroxidase (Wechselzahl : gibt an, wieviele Moleküle pro Zeiteinheit umgesetzt werden).

Reaktionsmechanismus:

In einem komplizierten, 1969 von Huisgen vorge- schlagenen Mechanismus wird das farblose

PYRO- GALLOL

zum roten

PURPUROGALLIN

oxidiert:

Zunächst wird das Pyrogallol von der Peroxidase zu einem Hydroxychinon oxidiert:

Dieses Hydroxychinon ist durch Resonanz stabi- lisiert:

Unter anderem kann man ein 1,3-dipolares System formulieren, welches für die Addition eines 2.

Moleküls Hydroxychinon aufnahmefähig ist. Die Addition erfährt ihren Antrieb in der Aromati- sierung des Adduktes:

.'

Hf>

.--...~ I

-(at -111#J wo'

~I 0

Diese nicht isolierbare Zwischenstufe wird als beta-Diketon zur Carbonsäure verseift, die (zu- mindest lassen Absorptionsberechnungen darauf schließen) bei ungefähr 430 nm absorbiert, also violett erscheinen müßte. Durch Zugabe von Pro- tonen (in unserem Fall durch Zugabe von Salz- säure) decarboxyliert diese Carbonsäure zu dem rötlichen Purpurogallin:

0 '1

t"'

^t-€>

'I\) ,

~O I)

L~

o

'oW

Die Peroxidase, die diese Reaktion ini tiiert, kommt in vielen pflanzlichen Geweben vor, in diesem Fall habe ich sie aus Meerrettich extra- hiert, indem Meerrettich zerkleinert wurde und nach Mixen durch ein Kolliertuch gepreßt wurde.

Dieser Rohextrakt ist schon hochaktiv.

Peroxidasen haben die Funktion, organische Sub- stanzen

nach

der allgemeinen Formel

H202 + AH2

<====> A

+ 2H20

zu oxidieren.

Die Peroxidasen haben ein Molekulargewicht von etwa 44000 und tragen als prosthetische Gruppe ein Porphyrinringsystem, das sog. Protohaemin, in dem ein Eisenion komplex gebunden ist. Die- ses Eisenion trägt eine Hydroxylgruppe, die zur Aufnahme eines Atoms Sauerstoff fähig ist und dami

t

in ein Peroxid übergeht. Allerdings ist diese Bindung relativ reaktiv, das Sauerstoffatom kann leicht abgegeben werden, in unserem Fall wird

es

auf Pyrogallol übertragen

(siehe dazu auch

Folie

Nr.

18).

Die Peroxidase hat in der pflanzlichen Zelle die Funktion, das

für

Pflanzen toxische

H202

abzubauen (und, wie gesagt, organische Substan- zen gleichzeitig zu oxidieren).

H202

entsteht in den pflanzlichen Zellen zum

einen

am

reduzierenden Ende des Photosystems

I

und

bei

der Umsetzung von Superoxidradikalanio-

nen , die

bei

der

Aufnahme

von Elektronen am

Photosystem I und der Obertragung dieser Elek-

tronen auf Wasser gebildet werden:

. Oa " + .

Oz-

+ 2W

---> H202

+ Os

Nach Reaktion mit den Superoxidradikalanionen kann das Hz 02 die Bildung von sehr reaktiven Hydroxylradikalen veranlassen, die Zellmembra- nen zerstören können, da sie Lipide peroxidie- ren (siehe auch Folie Nr. 19).

VERSUCH Nr. 6:

Katalase in Kartoffeln

Versuchsaufbau:

Versuchsdurchführung:

Man gibt zu einem Kartoffelrohextrakt einige ml einer konzentrierten H202-Lösung. Beobachtet wird ein starkes Aufschäumen des Extraktes, was auf die Bildung molekularen Sauerstoffs zurück- zuführen ist.

Mechanismus der Katalase:

Die Katalase wirkt prinzipiell wie die Peroxi- dase. Auch sie ist in der Lage, HzOz abzubauen.

Auch sie hat als prosthetische Gruppe ein Pro-

tohaemin

^I

in dem ein Eisenion zentral komple-

xiert ist. Allerdings überträgt sie den Sauer-

stoff des gebildeten Peroxids nicht auf eine

organische Subs tanz, sondern auf Hz

Oa ,

Dami t

ist ihre Aufgabe die reine Zersetzung des Was-

serstoffperoxids, welches sowohl als Acceptor wie auch als Donator des Sauerstoffs dient.

In der pflanzlichen Zelle wird die Katalase in die PEROXISOMEN, kleine, mitunter auch als

microbodies

bezeichnete Zellorganellen trans- portiert, wo sie ihre katalytische Funktion er- füllt (siehe auch Folie Nr. 20).

Die Katalase hat ein im Unterschied zur Peroxi- dase viel größeres Molekulargewicht (c.

200000) • Das

H202

stammt nicht aus der

Photosynthese, sondern aus der

PHOTORESPIRATION.

,~.

VERSUCHSTEIL B: REAKTIONSKINETIK

Wie aus den bisherigen Versuchen zu entnehmen war, benötigen enzymatische Reaktionen eine ge- wisse Zeit. Es gibt Reaktionen, die schneller und solche, die langsamer ablaufen.

Um die Geschwindigkeit von enzymatischen Reak- tionen zu erfassen, möchte ich im folgenden zwei Versuche vorstellen, die quali tati ve und quantitative Aussagen über die Art und Weise, wie Enzyme die Reaktionsgeschwindigkeit beein- flussen, machen.

Zuerst wird der Geschwindigkeitsverlauf einer enzymatisch katalysierten Reaktion verfolgt, danach die Ermittlung einer enzymspezifischen Konstanten, der MICHAELIS-KONSTANTEN vorge- stellt.

Aus zeitlichen Gründen war es mir im Vortrag nicht möglich, die Ermittlung der Michaelis- Menten-Konstanten experimentell zu demonstrie- ren. Es blieb mir lediglich die theoretische Erörterung von Versuch und Auswertung.

VERSUCH Nr. 7:

Messung der pH-Anderung bei der Harnstoffspal- tung durch Urease

Versuchsaufbau:

Versuchsdurchführung:

In ein 300 ml Becherglas gibt man etwa 200 ml einer 15%igen Harnstofflösung und einige Trop- fen Phenolphthaleinlösung. Man prüft mit einer pH-Elektrode den pH-Wert. Bei frisch bereiteten Harnstofflösungen liegt dieser bei pH=7. Nun gibt man bei eingeschal tetem Magnetrührer und angeschlossenem Schreiber einige Milligramm ei- nes käuflichen Urease-Präparats (Merck) hinzu.

Versuchsergebnis:

Die Lösung

verfärbt sich nach rosa,

was

auf eine basische Reaktion hindeutet. Der Schreiber registriert eine logarithmische Kurve, die den Geschwindigkeitsverlauf der Reaktion bis zur Einstellung des Gleichgewichtes wiederspiegelt.

Zum Ergebnis siehe auch Anhang

Versuchsergebnisse) .

Die Urease ist eine Hydrolase, die sehr spezi- fisch auf Harnstoff ist

(sieh

auch Folie Nr.

21). Sie kommt in Hefen und Schimmelpilzen vor, in Harnbakterien, in denen sie auch entdeckt wurde, bei niederen Tieren wie Mollusken, der Magenmucosa höherer Tiere und in hohen Konzentrationen im Samen von Schwert- und Sojabohnen.

Die Urease spaltet den Harnstoff (wahrscheinlich über ein instabiles Zwischenprodukt (Carbaminsäurederivat) formell in Ammoniak und

C02.

In wäßriger Lösung erfolgt allerdings eine Säure-Base-Reaktion, in der die Carbonationen für die Alkalisierung der Lösung verantwortlich sind, daher die Erhöhung des pH- Wertes der Lösung.

Man könnte übrigens auch genauso gut den An- stieg der Leitfähigkeit messen

QUANTITATIVE ENZYMKINETIK:

Im Lehrfilm ist schon von den allgemeinen Reak-

tionsgleichungen einer einfachen Ein-Substrat-

Reaktion

gesprochen worden:

r:

k+l k+2

E

+

S <===> ES <===> E

+

P

k-1

Bezogen auf das Substrat ist dadurch eine Reak- tion 1. Ordnung formuliert.

Zu Beginn des

20.

Jahrhunderts wurden einige wesentliche Beobachtungen gemacht, die heute noch allgemeingültig sind:

- die Reaktionsgeschwindigkeit ist der Enzym- konzentration direkt proportional.

- die Reaktionsgeschwindigkei t ist bei kon- stanter Enzymkonzentration von der Substratkon- zentration abhängig.

Diese experimentell belegbaren Fakten können am Modell der Enzym-Substrat-Reaktion veranschau- licht werden:

Bei einer konstanten Substratkonzentration und einer kleinen Enzymkonzentration wird es natür- lich einige Zeit dauern, bis die gesamte Sub- stratmenge umgesetzt worden ist. Jedes Enzym muß sehr viel öfter in den katalytischen Zyklus eingreifen als bei einer hohen Enzymkonzentra- tion .

^Auch

wenn der Einzelprozeß die gleiche Zei t dauert, so ist doch die Gesamtzei t bei kleinen Enzymkonzentrationen dadurch erheblich größer.

Bei steigenden Substratkonzentrationen

und

kon- stanter Enzymkonzentration beobachtet man im Bereich kleiner Substratkonzentrationen einen

linearen Geschwindigkeitsverlauf.

Mit zunehmen- der Substratkonzentration werden nun immer mehr aktive Zentren abgesättigt, bis alle Zentren von Substratmolekülen besetzt sind. Die Reakti- onsgeschwindigkei t in diesem Bereich wird

Maximalgeschwindigkeit

genannt, v••

x.

Bei noch höheren Substratkonzentrationen beobachtet man in vielen Fällen ein Absinken der Geschwindig- keit, was auf

H ~ ~

zurückzuführen ist

(siehe unten).

MICHAELIS

und MENTEN postulierten nun ein

Kom- plexbildungsgleichgewicht

zwischen E und S, das sich so schnell einstellen sollte, daß E und S stets in Gleichgewichtskonzentrationen vorlä- gen. Daher mußte die Reaktion in Richtung der Produkte

^(k+2)

geschwindigkeitsbestimmend sein

(siehe auch Folie Nr. 22).

BRIGGS

und

HALDANE

erkannten allerdings, daß

der stationäre Wert der Enzym-Substrat-Komplex-

Konzentration stark von dem des Kom- plexbildungsgleichgewichtes abwich. Daher po- stulierten sie ein Fließgleichgewicht (steady state), in dem

(ES)

konstant war (siehe auch Folie Nr. 23):

d(ES)

--- = k.l·

(E)· (S)

-k-l·

(ES) -k+

^2·

(ES) = 0 dt

nie Anfangsgeschwindigkeit vo der Reaktion ist also nur bestimmt durch den Zerfall dieses Komplexes in die Produktmoleküle:

d(P)

= k+ 2· (ES) = vo

dt

Trägt man die Anfangsgeschwindigkeiten einer enzymatischen Reaktion gegen steigende Sub- stratkonzentrationen auf, so erhäl

t

man eine logarithmische Sättigungskurve, die nach ihren Entdeckern genannte MICHAELIS-MENTEN-KURVE (siehe auch Folie Nr. 24). Die Substratkonzen- tration, bei der die halbmaximale Geschwindig- keit erreicht wird, nennt man MICHAELIS-MENTEN- KONSTANTE, KM_ KM ist temperatur- und pR-abhän-

gig,

aber nicht abhängig von der eingesetzten Enzymkonzentration. Die Michaelis-Konstante ist für jedes Enzym spezifisch und gibt seine Reak- tivität, besser, seine Affinität zum Substrat- molekül bei definierten Bedingungen (Tempera- tur, Milieu), an.

LINEWEAVER und BURK erkannten die Nachteile der Michaelis-Menten-Kurve:

- oft ist die Maximalgeschwindigkeit einer en- zymatischen Reaktion schwer zu ermitteln, da das Maximum nicht oder nur sehr kurz erreicht wird und Substrathemmungseffekte die Kurve überlagern. Daher fällt es auch oft schwer, KM zu ermitteln.

- Außerdem sind Abweichungen vom Kurvenverlauf schwer zu registrieren.

Sie linearisierten daher den Kurvenverlauf, in- dem sie den reziproken Wert der Anfangsge- schwindigkeit gegen den reziproken Wert der Substratkonzentration auftrugen. Man erhält so eine Gerade, deren Schnittpunkt mit der x-Achse (1/(8» -l/KM angibt. Der Schnittpunkt mit der y-Achse (l/vo) gibt den Wert der reziproken

Vmax

an. Die Steigung der Geraden ist der

Quotient von KM und

Vmax

(siehe Folie Nr. 25).

Es existieren viele Möglichkei ten, die Micha- elis-Konstante eines Enzyms zu ermitteln, man- nometrische, photometrische Methoden, ich möchte im folgenden den OPTISCHEN TEST vorstellen, der auf der unterschiedlichen

Absorption des NAD+

(Nicotinamidadenindinucleotid),

bzw.

des

NADH

beruht. Alle enzymatischen Reaktionen, bei denen Wasserstoff auf

NAD+

übertragen werden, können

mi

t

dem

nach o.

^{WARBURG entwickel}

^ten

Test untersucht werden:

VERSUCH Nr. 8:

Ermittlung der Michaelis-Konstanten der Hefe- Alkoholdehydrogenase (H-ADH)

Versuchsdurchführung:

Reaktionsprinzip:

NAD+, bzw. NADH zeigen

bei

340-360 nm ein un- terschiedliches Absorptionsverhalten (siehe auch Folie Nr.

26) •

Die oxidierte Form absorbiert lediglich bei 300 nm, bei 340 nm aber nicht, wogegen die reduzierte Form bei

340

nm ein zweites Absorptionsmaximum aufweist.

Das unterschiedliche Absorptionsverhalten re- sultiert aus dem unterschiedlichen Oxidations- zustand

des

NAD speziell

am

Pyridinring

des

Nicotinamidanteils

des NAD

(siehe auch

Folie Nr. 27).

Aufgrund

des unterschiedlichen Absorptionsver- haltens des NAD+ und des

NADH muß

es also mög- lich

sein,

enzymatische Reaktionen,

bei

denen NAD+ reduziert wird, spektroskopisch zu verfol- gen und aus der Geschwindigkeit der Extinkti- onsänderung auf die Geschwindigkeit der enzyma-

tischen Reaktion zu schließen.

Benötigte Materialien:

1: Puffer, pH=9,O:

16,6

g

Na4P207 x 10 H20,

4,16 9 Semicarbazidhydrochlorid, 0,84 9 Glycin und

16 ml 2 n NaOH

mit a. dest auf 500 ml auffüllen.

2:

Äthanol-Lösung:

92,1

mg

Äthanol aha. in 100 ml a. dest lösen (2.10-2 Mol)

3: NAD-Lösung:

40 mg NAD in 1 ml a. dest auflösen

4: G-SH-Lösung:

90 mg Glutathion-SH in 1 ml a.dest auflösen

5:

Serumalbuminlösung:

5 ml O,l%-ige Serumalbuminlösung

6:

Hefe-ADH:

1

ml einer

Hefe-ADH-Suspension:

0,5 mg ADH/mI, verdünnt mit Lsg. 5.

Zu 2.5 ml des Puffers pipettiert man nun in 1 cm-Glasküvetten:

- 0,06 ml NAD-Lsg., - 0,01 ml GSH-Lsg.,

- jeweils verschiedene Äthanol-Mengen (0,02 /

0,06/0,1/0,12/0,2

ml Athanol-Lsg.)

Zu jeder Lösung werden nun 0, 02 ml der Hefe- ADH-Suspension pipettiert. Gleichzeitig wird eine Stoppuhr gedrückt und nach 30 sek. 7

mine

lang die Extinktionsänderung bei 366

nm

registriert.

Das Ergebnis ist auf den folgenden Seiten

auf-

gelistet.

Aus

der

Steigung einer an

den

Extinktionsver-

lauf zum

Beginn der Reaktion angelegten Tangen- ten kann man die Extinktionsänderung ermitteln:

Lsg. Äthanol-Zug.

c(Et-OH)

(mL) · 10-⁴ Mol

dE

· min-¹

Lsg.

1:

0,2

14,4 0,40

Lsg.

2: 0,12

8,9

0,14

Lsg. 3: 0,10 7,44 0,10

Lsg.

4:

0,06 4,53

0,085

Lsg. 5:

0,02 1,53 0,012

Die Extinktion steht im direkt

proportionalen Verhältnis zur Konzentration des NADH:

E = e·c·d

e = Extinktionskoeffizient (für NAD: 3340-Mol-

1. cm- 1

c = Konzentration (Mol/I)

d = Schichtdicke der Küvette (=1 cm)

Da die Anfangsgeschwindigkei

t v«

wiederußI di- rekt proportional zur Konzentration ist, folgt daraus:

äv« dc

=

dt dt

äv« dE

=> = ---

dt e- d- dt

Für die

Konzentrationsänderung zu

Beginn der

Reaktion folgt daraus:

dc dE

= ----~-

dt

e·

d- dt

Trägt man die so ermi ttel ten Anfangsgeschwin- digkeiten

und

Substratkonzentrationen

gegen-

einander auf, so erhält man die Michaelis- Kurve • In der reziproken Darstellung kann im Lineweaver-Burk-Diagramm sowohl die Michaelis- Konstante als auch die Maximalgeschwindigkei t ermittelt werden.

Versuchsergebnis (siehe auch Anhang, Versuch- sergebnis) :

KM

=

^1,5-10-4

(Mol-I)

V.ax

=

^1,1-10-4

(Mol·1-1·min-

^{1 )}

REAKTIONSMECHANISMUS DER ADH:

Formell kann man für die Umsetzung des Sub- strates Äthanol durch die Alkoholdehydrogenase formulieren:

H H

CH3-C-OH

+

NAD+ <====> ^CHa-C=O

⁺

NADH

+

H+

H

Das Gleichgewicht liegt bei pH=7 auf der

lin-

ken Seite, wird aber im alkalischen Milieu (Puffer!) und bei Entfernung des Reaktionspro- duktes Acetaldehyd durch Semicarbazid fast vollständig auf die rechte Seite verschoben.

Folgende Ergebnisse (von

Blume

zusammenge- stellt) haben zum tiefgreifenden Verständnis des Reaktionsmechanismus der

ADH

geführt:

a) Die Zahl der Zink-Atome sowie die der NAD+

(bzw. der NADH)-Moleküle stimmt überein.

b)

Die katalytische Wirkung der ADH sinkt mit Zugabe von Komplexbildnern, welche mit Zn2 + - I o -

nen reagieren.

c) Das Zn2 + - I o n

kann

zusätzlich zu zwei negativ geladenen Ionen vier ungeladene Liganden mit

freien Elektronenpaaren koordinativ binden.

d) Die ADH wird durch Komplexbildner vergiftet.

e) Das pH-Optimum der ADH liegt bei

9,5. Da

der pKs

-Wert

der SH-Gruppen bei 8,3 liegt, liegt bei diesem pH-Wert ein großer Teil dieser Grup- pen dissoziiert

in

der Form -8- vor. Oberhalb vom

pH 9,5

bildet sich Zn(OH)2.

f) Setzt man anstelle des Äthanols CH3 CH2 OH deuterierten Alkohol CH3CD20H

ein, so

erhält man NADD anstelle von NADH.

g) Methanol zeigt im Gegensatz zu Athanol fast überhaupt keinen Umsatz.

Auf Folie 28 ist der genaue Reaktionsmechanis- mus zu sehen:

Die ADH besi tzt im aktiven Zentrum Sulfid-Io- nen, die ein Zn²⁺ komplexieren. Diffundiert nun ein NAD+ -Molekül heran, so erwei tert sich der Zn-Komplex, durch Komplexierung mit den freien Elektronenpaaren der Stickstoffe des Adeninan- tei 1s des NAD+. Gleichzei tig binden ionische Anziehungskräfte den Pyridinanteil des NAD+ an ein wei teres im aktiven Zentrum befindliches Sulfidion . Das NAD+ ist dami t als Coenzym re- versibel gebunden (Bild A).

Das herandiffundierende Äthanol-Molekül wird mit seinem Sauerstoffatom koordinativ an das Zn²+-Ion und mi t dem Wasserstoffatom des OH- Restes an die Aminogruppe des Adenins gebunden

(Bild B).

Dabei wird die Bindung zwischen dem Sauerstoff- und Wasserstoffatom gelockert.

Die lipohile Methylgruppe des Athanols ist über Van der Waals-Kräfte an homöopolare Reste des Enzyms, die eine lipophi le Tasche bilden, ge- bunden. Diese Fixierung des Alkoholmoleküls be-

wirkt eine enge Nachbarschaft des mit dem Sau- erstoffatom verbundenen C-Atoms zum positiv ge- ladenen Nicotinsäureamidrest von NAD+. Dadurch wird der Obergang eines Hydridions zum NAD+-Mo- lekül ermöglicht (Bild Cl.

Die am Äthanolmolekül zurückbleibende Ladung wird durch Abstoßen des Hydroxyl-Wasserstoffs als Proton eliminiert,. Diese wird zunächst durch die Aminogruppe des Adenins und an- schließend durch das Puffersystem abgefangen.

Das entstehende Acetaldehyd löst sich aufgrund der veränderten Molekülgeometrie aus der koor- dinativen Bindung zum Zink und diffundiert ab.

Gleichzeitig zerfällt der Enzym-NADH-Komplex (Bild D). Der katalytische Zyklus ist durchlaufen ,

^das

Enzym ist wieder

"einsatzbereit".

VERSUCH Nr. 9:

Hemmung der Lipase-Aktivität

Versuchsaufbau:

it;.f'l

H.

",r

t^{M Al.}tJH

,t4/',,~ ^«.M

s 0.1 z

~ L"ptl~t

Versuchsdurchführung:

In

zwei

300

ml Erlenmeyerkolben

gibt

man

50 ml frische (!) Vollmilch und setzt jeweils

6 ml

o, 5

n NaOH zu. Man

färbt

mi

t

einigen

Tropf

en Phenolphthalein bis zu einer

sichtbaren

Ro- safärbung.

Nun

gibt man jeweils

1

g

eines Lipasepräparates

(Pankreatin Forte)

hinzu.

Nach

wenigen Sekunden ist schon eine

sichtbare

Entfärbung der Lösungen zu erkennen. Dies ist auf die Lipaseaktivität zurückzuführen. Die Li-

pase

hydrolysiert die Milchfette und setzt Fettsäuren frei. Diese neutralisieren die alka- lische Milchlösung, der pH wird erniedrigt, die Rosafärbung verschwindet.

Nun gibt man zu einer der Lösungen einen über- schuß Athanol zu. Die zwei te Lösung wird mi

t

0,5 n NaOH bis zur Rosafärbung zurücktitriert.

Danach wird auch die mit Athanol versetzte Lö- sung zurücktitriert.

Lösung 1 (ohne Äthanol) sollte etwas

mehr

NaOH verbrauchen und nach einer gewissen Zei tauch wieder farblos werden. Dies war im Versuch zu erkennen. Lösung 2 blieb noch eine sehr lange Zeit rosafarben.

Das Ergebnis

ist

auf

eine Hemmung der

Lipaseak-

tivität durch Äthanol zurückzuführen.

Die Lipase spaltet

in

drei aufeinanderfolgenden Schri t ten ein Fet tmolekül in drei Fet tsäuren und ein Glyceridmolekül (siehe Folie

Nr. 30).

Allerdings kann diese Umsetzung nur an der Grenzfläche zwischen Fett- und Wasserphase stattfinden. Das

Äthanol

löst die

Fette

parti- ell, die Grenzphase ist nicht mehr existent und die Lipase kann die Fette nicht mehr angreifen.

Die

Lipase

ist ein Enzym, das den Hydrolasen zugerechnet wird. Ihre Funktion ist - wie ge- sehen, die hydrolytische Spaltung von Fetten.

Dabei steigt die Spaltungsgeschwindigkeit mit

a)

der Kettenlänge der Fettsäuren, b) der

Anzahl

der Fettsäuren und

c) dem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren.

Die

einzige Bedingung für die Hydrolyse ist die, daß der auf Wasser übertragene Rest eine Ketogruppe neben der SpaltsteIle tragen muß.

Daher haben Lipasen eine geringe Substratspezi- fität.

Lipasen kommen in den meisten tierischen Orga- nismen und Organen vor (in höheren Wirbeltieren haupts. in der Pankreas).

HEMHUNGSTYPEN:

Enzymatische Reaktionen laufen also nicht immer ungehindert ab. Viele Reaktionen sind mehr oder weniger gehemmt.

Man unterscheidet (filmische Darstellung) zwi- schen mehreren Hemmungstypen:

a) kompetitive Hemmung:

wie am das ein Die stark Ein Molekül, welches ähnlich gebaut ist,

das Substratmolekül , greift das Enzym aktiven Zentrum an und bindet. Dadurch ist Enzym nicht mehr in der Lage, Substratmolekül umzusetzen.

Reaktionsgeschwindigkeit ist herabgesetzt.

b) Substrathemmung:

Zu viele Substratmoleküle konkurrieren um das aktive Zentrum. Dabei hemmen sie sich durch sterische Hinderung oder in dem Fall, wenn meh- rere Bindungsstellen für ein Substratmolekül existieren und mehrere Substratmoleküle im ak- tiven Zentrum binden.

c) allosterische oder nichtkompetitive Hemmung:

Ein allosterisches Molekül bindet an das Enzym an einer anderen Stelle, verändert die Konfor- mation des Enzyms, so daß dieses seine durch die Struktur bedingte Wirksamkeit verliert.

d) Produkthemmung:

Produktmoleküle wirken als allosterische Inhi- bitoren.

Natürlich kann man sich bei diesen Typen auch

eine fördernde (effektivierende) Wirkung vor-

stellen.

Zum Schluß sei noch auf die regulative Funktion dieser Effekte hingewiesen.

Enzymatische Reaktionen, die solch "schnellen"

Inhibierungs- bzw. Effektivierungseffekten un- terliegen, sind natürlich sehr gut geeignet, im zellulären Milieu

^für

eine angemessene Anpas- sung an Milieuänderungen zu sorgen. Die Verän- derung biochemischer Konzentrationen muß nicht über die relativ langsame Kontrolle durch das genetische Material erfolgen.

Daher liegt der Schluß nahe, daß Enzyme ein

sehr al ter Bestand lebender, bzw. sich selbst

selbstorganisierender System sind.

LITERATURLISTE:

Alberts/Bray/Lewis/Ralff/Roberts/Watson:

"Mole- kularbiologie der Zelle", VCH Verlagsgesell- schaft, Weinheim, 1986

Beyer, H./Walter, W.:

Chemie", 19.

Stuttgart, 1981

"Lehrbuch der organischen Auflage, Hirzel-Verlag,

-r-,

Boyer:

"The Enzymes", Vol 111: "Hydrolysis " , Academic press, New York a. London, 1971

Bukatseh, F. /Glöckner, W. (Hrsg.):

"Experimen- telle Schulchemie" , Bd.

6/11,

"Organische Che- mie", Aulis-Verlag Deubner & Co KG, Köln, 1976

Christen, R.:

"Grundlagen der Organischen Che- mie", 6. Auflage, Otto Salle-Verlag, Frank- furt/Main, 1985

14. COI.JUJIUN DER GmEf.lS(J[MT FOR PHYSIOI.fX]I-S(J[E CJlHrlIE:

"Mechanismen enzymatischer Reak

-tionen",

Springer-Verlag, Berlin, 1964

Eckert, R.:

"Tierphysiologie", Georg-Thieme- Ver-lag, Stuttgart, 1986

Gutfreund , H.:

"Enzymes: Physical principles", John Wiley & sons, Wiley-Interscience, Bristol, 1972

Hammer/Storck/Waqner (Hrsg.):

"Der Chemieunter- richt", Jahrgang 11, Heft 1, Februar 1980, Ernst Klett-Verlag, Stuttgart, 1980

Hoppe-Seyler/Thierfelder:

"Handbuch der physio- logisch- und pathologisch-chemischen Analyse", 10. Auflage, 6. Bd, Teil A-C, Springer-Verlag, Berlin, 1964

Karlson, P.:

"Kurzes Lehrbuch der Biochemie f.

Mediziner u. Naturwissenschaftler", 11.

Auflage, Georg Thieme

-Verlag,

Stuttgart, 1980

Knippers, R.:

"Molekulare Genetik", 4. Auflage, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1985

Mengel, K.:

Pflanze" , 6.

Je-na, 1984

"Ernährung u. Stoffwechsel der

Auflage, Gustav Fischer-Verlag,

Myrbäck, K.: "Enzymatische Katalyse, Einführung in die Enzymchemie" , Walter de Gruyter

&

Co- Verlag, Berlin, 1953

SIr:EL,

sons,

I. H.: "Enzyme

Kinetics",

John

Wiley

^&

Wiley-Interscience, New York, 1975

I~'

Strasburaer, E.: "Lehrbuch der Botanik", 32.

Auflage, Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart,1983

Sykes, P.: "Reaktionsmechanismen in der Organi-

schen Chemie", 8. Auflage, Verlag Chemie, Wein-

heim, 1982

- Folien 1-30

- Gleichgewichtseinstellung bei der Harnstoffspaltung durch Urease

- Ermittlung der Michaelis-Konstanten

- Programmlisting des

Lehrfilmes

- Folien 1-30

- Gleichgewichtseinstellung bei der Harnstoffspaltung durch Urease

- Ermittlung der Michaelis-Konstanten

- Programmlisting des Lehrfilmes

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di~ p~~t~~i~~t~ b~~. d~p~~t~-

~i~~t ~~~~~~ ko~n~~.

8

10 6

Papain (Substrat ==

Benzoylargininamid)

4

10 6 Pepsin

8 4

Cholin- esterase

6 2

4

pH

:197f5:>

ohne

Katalysator

Enzym-Katalyse

-YL-

E + P

S+J3

<-==>

: E S

<==.> ^EP <==> E

-I- F"

ka.-ca.-

k~ei.-

1. OXIDO-REDUKTASEN

(Oxidations-Reduktions-Reaktionen):

1.1. Wirkend auf -CH-OH 1. 2. Wirkend auf -C=O 1. 3. Wirkend auf -CH=CH- 1. 4. Wirkend auf -CH-NR2 1. 5. Wirkend auf -CH-NH- 1.6 . Wirkend auf NADH;NADPH

... . . . . . . . . ^. .. .

2. TRANSFERASEN

(~bertragung von funktionellen Gruppen):

2.1. Cj.-Gruppen

2.2. Aldehyd oder Keto-Gruppen 2.3. Acyl-Gruppen

2.4. Alkyl- oder Aryl-Gruppen (außer Methyl-) 2.5. N-haltige Gruppen

2.6. P-haltige Gruppen 2.7. S-haltige Gruppen 3. HYDROLASEN

(Hydrolytische Reaktionen): 3.1. Ester

3.2. Glykosidische Bindungen 3.3. Äther-Bindungen

3.4. Peptid-Bindungen 3.5. Andere C-N-Bindungen 3.6. Säureanhydride

4. LYASEN

(Lösen C-C, C-O, C-N und andere Bindungen)

5. ISOMERASEN

(Isomerisierung, d.h. intramolekulare Änderungen):

5.1.

5.2.

5.3.

Racemasen, Epimerasen Cis-trans-Isomerasen

Intramolekulare Oxidoreduktasen

6. LIGASEN (Synthetasen)

(Kovalente Bindung zwischen zwei Molekülen bei gleichzeitiger ATP-Spaltung)

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[E] hoch

[E] niedrig

Substratkonzentration

Die Michaelis-Menten-Konstante

KM

gleicht der S~bstratkonzen~ration. bei der die Reaktionsgeschwindigkeit die Ha/fte der maximalen Geschwindigkeit beträgt. Die schwarze und die farbige Kurve stehen für verschiedene Enzymkonzentra- tianen.

Na.c=btei~e Mic=ba.e~iS3-

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