Archiv "Grundlagen und Anwendung der Gentechnologie" (17.04.1980)

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Heft 16 vom 17. April1980

Die Gentechnologie hat Me- thoden entwickelt, mit deren

Hilfe Gene, das heißt Ab-

schnitte der Desoxyribonu- kleinsäure von höheren Orga- nismen im Bakterium Escheri- chia co/ivermehrt und Zljr Ex- pression gebracht werden können. Mit Hilfe dieser Me- thoden ist es insbesondere möglich geworden, spezifische Gene oder Gengruppen hochgradig zu reinigen, zu klonieren. Auf diese Weise können die Struktur und die Funktion von Genen höherer Organismen, auch des Men- schen erforscht werden. Die Gentechnologie eröffnet aber auch neue Aspekte für die ver- besserte und in Zukunft vielleicht verbilligte Herstellung von in der Medizin wichtigen Wirkstoffen, zum Beispiel von Hormonen (Insulin u. a.), von Interferon (zellulärer Abwehr- stoffe gegen Virusvermeh- rung) oder von Impfstoffen

(Hepatitis Vaccine u. a.).

Grundlagen und Anwendung der Gentechnologie

Walter Doerfler

Aus dem Institut für Genetik

(Geschäftsführender Direktor: Professor Dr. med. Walter Vielmetter) der Universität zu Köln

1. Einleitung

Die Gentechnologie stellt eine neue Entwicklung in der Molekularbiolo- gie dar. Sie ermöglicht es, das Ge- nom höherer Organismen zu analysieren. Berichte über die erhofften medizinisch-therapeutischen An- wendungsmöglichkeiten und über die potentiellen Gefahren der Gen- technologie sind nicht nur in der Laienpresse der letzten Jahre von Übertreibungen gekennzeichnet gewesen. Nachdem eine große Anzahl von Experimenten mit dieser Metho- dik durchgeführt worden ist, kann man die bisher gesammelten Erfah- rungen kritisch analysieren. Drei Fragen stehen zur Diskussion:

..,.. Wird die Gentechnologie vorwie- gend den Molekularbiologen weiter- helfen, die bestrebt sind, die Organi- sation und Funktion der Gene von Eukaryonten zu erforschen?

..,.. Oder werdendie Methodenzur ln- vitro-Neukombination von Kluklein- säuren die pharmazeutisch-chemi- schen Laboratorien in die Lage ver- setzen, wichtige Naturstoffe in gro- ßer Reinheit, relativ billig und in gro- ßen Mengen herzustellen?

..,.. Sollte es letztendlich gelingen, mit diesen Methoden die Erbanla- gen heutiger Organismen, die aus einer Entwicklung von Jahrmillionen hervorgegangen sind, gezielt zu ver- ändern?

Bereits heute ist die Gentechnologie aus dem Methodenrepertoire der Molekularbiologie nicht mehr weg- zudenken. Auch bei der Synthese von Naturstoffen, zum Beispiel des Insulins, des Somatostatins, von Wachstumshormon, des ACTH, des Interferon usw. wurden Fortschritte erzielt. Andererseits sind "Franken- steinszenen", in denen Erbanlagen in phantastischer Weise manipuliert werden, im Bereich der Fiktion ge- blieben.

2. Grundbegriffe der Gentechnologie

Bei der /n-vitro-Neukombination von Nukleinsäuren werden definierte Ab- schnitte der Desoxyribonukleinsäu- re (DNA), zum Beispiel einer Säuge- tierzelle, mit Hilfe von Restriktions- endonukleasen aus dem Gesamtge- nom isoliert und an ein kleines, selbstreplizierendes DNA-Eiement (Piasmid) des Bakteriums Escheri- chia coli (E.coli) oder an die DNA eines Virus gebunden.

Restriktionsendonukleasen (1 )*) kommen fast ausschließlich bei Mi- kroorganismen vor und erkennen spezifische Nukleotidsequenzen in doppelsträngiger DNA (Tabelle 1 ).

Restriktionsendonukleasen sind ei-

') Der Veröffentlichung im Heft ist nur ein Teil des Literaturverzeichnisses angefügt. Das gesamte Literaturverzeichnis ist mit dem Sonderdruck erhältlich.

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Sauger-DNA

Eco RI (Restriktionsendonuclease)

Plasmid -DNA

Fragment der Sauger-DNA Plasmid

(Vektor)

Eco RI

•Or Ligase

Abbildung 1: Einbau von Säuger-DNA in ein Bakterienplasmid als Vektor.

Piasmid-DNA und Säuger-DNA werden mit der gleichen Restriktionsendonu- klease geschnitten. so daß Fragmente entstehen, die einander komplementäre Enden ( 1 I) tragen. Diese kohäsiven Enden binden aneinander und können mit Hilfe des Enzyms DNA-Ligase kovalent miteinander verbunden werden. Das entstehende neue Hybrid-DNA-Molekül ist infektiös und kann in E.coh *Zellen eingeführt, in diesen vermehrt und unter speziellen Bedingungen (siehe Text) auch zur Expression gebracht werden

nes der wichtigsten Hilfsmittel der Gentechnologie. Wenn die DNAs un- terschiedlichster Spezies mit dem gleichen Restriktionsenzym ge- schnitten werden, entstehen in vie- len Fällen Fragmente, die zueinan- der komplementäre Enden besitzen

(Abbildung 1). Diese kohäsiven En- den können schwach aneinander binden und durch das Enzym Poly- nukleotid-Ligase (2) kovalent mitein- ander verknüpft werden. Falls DNA- Fragmente aneinandergekoppelt werden sollen, die durch Behand-

lung von verschiedenen DNA-Spe- zies mit unterschiedlichen Restrik- tionsendonu kleasen entstanden sind und deren Enden einander dann natürlich nicht komplementär sind, müssen die Bruchstücke unter- schiedlicher Herkunft durch Adapto- ren künstlich einander angepaßt werden.

Mit dem zur Vermehrung befähigten DNA-Element, das durch geeignete Vorbehandlung in die Wirtszelle ein- geschleust wird, vermehren sich auch die künstlich eingebauten Ge- ne, die aus einem völlig anderen (he- terologen) Wirt stammen können.

Auf diese Weise kann ein Gen oder eine Gruppe von Genen isoliert und hochgradig gereinigt werden. Man spricht von der Klonierung von Genen.

Klone von Genen erhält man, indem E.co/i-Zellen mit der Hybrid-DNA unter Bedingungen transfiziert werden, daß nicht mehr als ein solches Hybridmolekül in eine Zelle gelangen kann. Ein Hybridmolekül besteht aus dem Plasmid- oder Pha- genvektor und den eingebauten Ge- nen heterologen Ursprungs.

Der Nachweis spezifischer heterologer DNA-Sequenzen in Vektor- Populationen erfolgt durch In-

situ-Nukleinsäu re-Hybrid isieru ngs- methoden. Voraussetzung für diesen Nachweis sind einmal das Vor- handensein spezifischer DNA-Mole- küle („probes"), die man in vitro hochgradig radioaktiv markieren kann (3), zum anderen die Entwick- lung von /n-situ-Nachweisverfahren.

Indem man die Nachkommen sol- cher Hybridmoleküle in einer Kolo- nie oder einem Virusplaque isoliert, erhält man Zellen oder Viren, die ein Klon eines bestimmten Säugergens oder einer Gruppe solcher Gene ent- halten. Wie wir sehen werden, be- darf es bestimmter technischer Vor- aussetzungen, um heterologe Gene in E.colizur Expression zu bringen, das heißt die Synthese von Genpro- dukten in einem heterologen Wirt zu ermöglichen. Gerade bei der Syn- these wichtiger Naturstoffe, etwa des Insulins, in E.coliist man auf das Zustandekommen dieses Synthese-

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Endonuklease Herkunft Erkennungssequenz

Bam HI

Bgl II

Bal I

Eco RI

Hha I

Hind III

Hinf I

Hpa II

Pst I

Taq I

Bacillus amyloliquefaciens H

Bacillus

Brevibacterium albidum

Escherichia coli

Haemophilus haemolyticus

Haemophilus influenzae d

Haemophilus influenzae Rf

Haemophilus parainfluenzae

Providencia stuartii

Thermus aquaticus

5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 5'-AGATCT-3' 3'-TCTAGA-5' 5'-TGGCCA-3' 3'-ACCGGT-5' 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' 5'-GCGC-3' 3'-CGCG-5' 5'-AAGCTT-3' 3'-TTCGAA-5' 5'-GANTC-3' 3'-CTNAG-5' 5'-CCGG-3' 3'-GGCC-5' 5'-CTGCAG-3' 3'-GACGTC-5' 5'-TCGA-3' 3'-AGCT-5'

Tabelle 1: Einige Beispiele von Restriktionsendonukleasen und ihren Erkennungssequenzenl

Bisher sind fast 200 solcher Endonukleasen aus Mikroorganismen isoliert worden. Es ist nicht endgültig geklärt, ob diese Enzyme auch bei Eukaryonten vorkommen. Die

II

geben die Schnittstellen innerhalb der Erkennungsnukleotidsequenz an. Nach der Spaltung entstehen vielfach Enden mit kurzen, einander komplementären Enden, zum Beispiel nach Spaltung mit Eco RI

5' G AATTC 3'

3' CTTAA G 5'

Diese Komplementarität kann beim Aneinanderfügen von Frag- menten heterologer Herkunft verwendet werden. Manche Endonu- kleasen produzieren auch Fragmente mit sogenannten „glatten"

Enden, zum Beispiel Bal I. In diesen Fällen muß man beim Klonie- ren sogenannte Adaptoren verwenden (siehe Text). Die Abkürzun- gen für die Bezeichnungen der Restriktionsendonukleasen erge- ben sich aus den Anfangsbuchstaben der Spezies-Namen der entsprechenden Mikroorganismen.

weges angewiesen. Bei der Gen- technologie können also prinzipiell zwei Ziele verfolgt werden:

cp

Es können Gene praktisch jedes Organismus zur Homogenität gereinigt, beliebig vermehrt und schließ- lich analysiert werden. Die zu dieser Reinigung und Vermehrung erfor- derlichen Operationen sind einfach.

Bei einem sogenannten „shotgun"- Experiment mischt man die gesamte DNA eines Organismus oder einer Zellart mit dem zu verwendenden Vektor, schneidet das Gemisch mit einer Restriktionsendonuklease und ligasiert die Bruchstücke. So entstehen Hybride zwischen Vektor und theoretisch allen DNA-Abschnitten der Spenderzellen. Aus einer so ent- standenen „Genbank" kann man Klone spezifischer Gene selektio- nieren.

C Gene, die aus einem Organismus isoliert wurden, können unter bestimmten Voraussetzungen in einem heterologen Wirt, zum Beispiel in Bakterien, exprimiert werden. Es kann also die in diesen Genen ge- speicherte Information in die messenger-RNA (m-RNA) transkribiert und letztere zu Protein(en) transla- tiert werden.

Bei der Expression klonierter eukaryotischer Gene in E.coli-Vektoren ist es von Bedeutung, daß die Erken- nungssequenzen (Promotoren) pro- und eukaryotischer DNA-abhängiger RNA-Polymerasen auf der DNA nicht identisch sind. So konnte zum Bei- spiel das im Plasmid pBR322 klonierte Insulin-Gen von Ratten in E.coli nicht ohne weiteres transkribiert werden. Es war notwendig, dieses Insulin-Gen an einen bekannten Promotor/Operator zu koppeln (4).

Das Insulin-Gen des Menschen wurde zunächst chemisch synthetisiert, dann an ein gut charakterisiertes Gen von E.coli gebunden und in einem Plasmid kloniert (5). Unter diesen Bedingungen gelang es mit sehr empfindlichen Radioimmun-Metho- den, die Insulinproduktion in E.coli nachzuweisen (4, 5). Für praktische Anwendungsmöglichkeiten der Gentechnologie im medizinisch-bio-

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Grundbegriffe der Gentechnologie

Konzepte und Methoden der Mo- lekularbiologie werden seit meh- reren Jahren mit erheblicher Ge- schwindigkeit weiterentwickelt.

Vor allem der praktisch-klinisch tätige Arzt wird mit vielen Begrif- fen, die in diesem Artikel verwendet werden, nicht vertraut sein.

Zur Erleichterung der Lektüre stelle ich der Arbeit daher ein Glossar voran, das wichtige Fachausdrücke auch für den Laien verständlich erklärt.

Adaptoren: Als Adaptoren ver- wendet man: 1) Polydesoxyade- nosin-Reste und Polythymidin- Reste, die enzymatisch an die En- den von DNA-Fragmenten ge- hängt werden. 2) Verbindungs- nukleotide, deren Sequenz das Erkennungssignal einer der Re- striktionsendonukleasen (Tabelle 1) darstellt. Auch diese Oligonu- kleotide werden enzymatisch an DNA-Fragment-Enden gebunden.

Bakteriophagen sind Viren, die sich nur in Bakterien vermehren können. Der Escherichia-coli- Phage Lambda (X) ist genetisch hervorragend untersucht und kann auch als Vektor (--›) in der Gentechnologie verwendet werden.

cDNA: Complementary DNA = komplementäre DNA wird an der messenger-RNA als Matrize mit Hilfe des Enzyms reverse Tran- scriptase synthetisiert.

DNA: Deoxyribonucleic acid = Desoxyribonukleinsäure, stellt das genetische Material fast aller Lebewesen dar.

Endonukleasen: Enzyme, die die Phosphodiester-Bindung zwischen zwei Nukleotiden im Inne- ren eines DNA-Moleküls spalten.

Expression von Genen: Im ersten Schritt der Expression, der als

Transkription (-->) bezeichnet wird, wird die in der Nukleotidse- quenz der DNA encodierte gene- tische Information in eine mes-

senger-(m) RNA (= Boten-RNA) überschrieben. Im zweiten Schritt, als Translation (->) be- zeichnet, wird die Information in der mRNA in der Proteinbiosyn- these in eine Polypeptidsequenz übersetzt.

Eukaryonten: Höhere Organis- men, bei denen die DNA in Chro- mosomen im Zellkern organisiert ist.

Gen-Therapie: Substitution feh- lender oder defekter Gene in Zel- len. Dabei werden Zellen mit der DNA, die diese Gene trägt, be- handelt Transformation). Bis- her nur auf experimenteller Basis durchführbar.

Genom: Die Gesamtheit der Gene in einer Zelle, beziehungsweise in einem Organismus. Im Prinzip ist das Genom in allen Zellen eines Organismus identisch.

Histone: Stark basische Proteine, die bei Eukaryonten an DNA gebunden sind. Der Komplex defi- nierter Struktur aus DNA, Histo- nen und anderen Proteinen wird als Chromatin bezeichnet.

Hybridmolekül: DNA^-Molekül, das aus zwei künstlich aneinander gebundenen Teilen unterschiedlicher Herkunft besteht. In einem für die Gentechnologie ty- pischen Experiment wird ein DNA-Fragment aus einer euka- ryotischen Zelle an einen Vektor

das heißt an ein Plasmid- (-->)-DNA-Molekül oder ein Virus- DNA-Molekül gebunden.

Interferone: Proteine mit Moleku- largewicht von 20 000-40 000. In- terferone werden von der Zelle

nach einer Virusinfektion gebil- det. Der Angriffspunkt der Inter- ferone liegt in der Wirtszelle. In- terferone sind im Genom der Wirtszellen encodiert. Interferone sind von der Zelle gebildete Ab- wehrstoffe, zum Beispiel gegen Virusinfektion.

Klon: Genetisch identische Nach- kommenschaft einer Zelle, eines

Virions (->) oder eines Gens.

Klonieren: In der Gentechnologie versteht man unter Klonieren die Isolierung eines Gens, das heißt eines DNA-Fragmentes, in abso- lut reiner Form, sowie die Ver- mehrung dieses Gens in einem Vektor.

Ligase: Das Enzym Polynukleo- tid-Ligase verknüpft verschiede- ne DNA-Moleküle über eine Phosphodiester-Bindung kovalent miteinander.

Lytische Vermehrung: Wenn Zel- len von Viren infiziert werden, und sich diese Viren stark vermehren können und die Zellen zu zerstören (lysieren) vermögen, spricht man von einem lytischen

Infektionszyklus.

Messenger-RNA: Siehe Expres- sion von Genen.

Nick-Translation: In dieser Reak- tion wird DNA gleichzeitig mit sehr geringen Mengen von Des- oxyribonuklease (DNA abbauen- des Enzym) und mit Polymerase (DNA synthetisierendes Enzym) inkubiert. Im Reaktionsgemisch befinden sich außerdem [ 32 P]- markierte Desoxyribonukleosid- triphosphate (Vorstufen beim Aufbau der DNA). Während der Reaktion werden die Nukleotide der DNA durch [32 P]-markierte Nukleotide ersetzt. So kann man jede DNA in vitro hochgradig radioaktiv markieren.

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Grundbegriffe der Gentechnologie

Nukleinsäure Hybridisierung:

DNA-Moleküle oder RNA-Molekü- le gleicher Nukleotidsequenz binden hochspezifisch als Einzel- stränge aneinander. Die Identität oder Ähnlichkeit verschiedener DNA- oder RNA-Moleküle kann mit dieser Methode nachgewiesen werden.

Phagen: Bakteriophagen.

Plaques: Zonen der Zellzerstö- rung durch Viren auf einem Bak- terienrasen (Bakteriophagen) oder einer Schicht tierischer Zel- len in Kultur (tierische Viren).

Plasmide: Kleine, ringförmige DNA-Moleküle aus Bakterien, die in ihrer Replikation vom Bakte- riengenom unabhängig sind.

Plasmide tragen ihren eigenen Replikationsursprung. Auf Plas- miden sind häufig die Gene für die Resistenz gegen bestimmte Antibiotika lokalisiert. Plasmide werden als Vektoren (—) in der Gentechnologie verwendet.

Polyomavirus: DNA-haltiges Tu- morvirus, das ursprünglich aus Mäusen isoliert wurde und bei Nagern eine Vielzahl von Tu- moren (Poly-oma) auslösen kann.

„Probe": (englisch) Sonde, mit deren Hilfe in Hybridisierungsver- suchen spezifische Nukleinsäu- resequenzen nachgewiesen werden können. Meist handelt es sich bei „probes" um hochgradig [32PFmarkierte DNA- oder RNA- Präparationen.

Prokaryonten: Niedrigere Orga- nismen (Mikroorganismen), deren DNA nicht chromosomal organisiert ist, und die keinen Kern besitzen.

Promotor: Bindungsstelle der DNA-abhängigen RNA-Polymera-

se auf der DNA. Diese Polymera- se ist für die Synthese der mRNA verantwortlich. Bei Prokaryonten sind Promotoren als definierte Nukleotidsequenzen gut charak- terisiert. Bei Eukaryonten sind Promotoren weniger gut be- stimmt (Hogness box).

Regulation der Genexpression:

Bei Prokaryonten sind einige Me- chanismen der Regulation auf molekularer Ebene genau erforscht. Wenig ist über die Genre- gulation bei Eukaryonten bekannt.

Restriktionsendonukleasen: Die- se Gruppe von Enzymen aus Mi- kroorganismen schneidet dop- pelsträngige DNA Nukleotidse- quenz-spezifisch. Es handelt sich um endonukleolytische Spaltun- gen, das heißt um Schnitte im Inneren der Kette.

RNA: Ribonukleinsäure.

Simian Virus 40 (SV40): Ein DNA- haltiges Tumorvirus, das ur- sprünglich aus Affenzellkulturen isoliert wurde. SV40 wurde als Kontamination in den ersten Po- liomyelitis-Vaccinen entdeckt.

SV40 ruft Tumoren bei Versuchs- tieren, aber — soweit bekannt — nicht beim Menschen hervor.

SV40 ist eines der am besten un- tersuchten Viren.

Splicing: (englisch) Spleißen. Als

„splicing" bezeichnet man eine charakteristische Form des Um- baus der hochmolekularen Kern- RNA bei Eukaryonten. Bestimmte Sequenzen werden aus der RNA ausgeschnitten, und die Bruch- stücke werden wieder aneinan- dergebunden zu einer funktionel- len messenger-RNA. So werden funktionell zusammengehörige Genabschnitte, die auf der DNA voneinander getrennt aufgereiht

sind, posttranskriptionell miteinander vereinigt (siehe auch Abbil- dung 2).

„Shotgun-Experiment": (englisch) Bei einem „Schrotschuß- Experiment" mischt man die gesamte DNA eines Organismus oder einer Zellart mit dem zu verwendenden Vektor, schneidet das Gemisch mit einer Restrik- tionsendonuklease und ligasiert schließlich die Bruchstücke.

Theoretisch können auf diese Weise alle Abschnitte des Spen- dergenoms in den Vektor einge- baut werden.

Somatostatin: Growth Hormone

— Release lnhibitory Factor — Faktor, der die Freisetzung (Bil- dung) des Wachstumshormons (Somatotropin) der Hypophyse hemmt.

Transfektion: Direkte Infektion von Zellen mit DNA, häufig mit viraler DNA, die zu einer produk- tiven Virusinfektion führt.

Transformation: Übertragung und Fixierung von Genen in Zel- len, indem diese Zellen direkt mit der entsprechenden DNA behan- delt werden. Die übertragenen Gene werden in der Rezeptorzel- le auch ausgedrückt.

Transkription — Translation: Sie- he Expression von Genen (—>).

Vektor: DNA-Molekül, das zur selbständigen Replikation befä- higt ist und sich für den Einbau fremder DNA eignet. Häufig wer- den Plasmide (—›) aus Bakterien- oder Virus-DNA, zum Beispiel die DNA des Bakteriophagen k oder des SV40 als Vektoren verwandt.

Zellen können direkt mit diesen Vektoren infiziert werden.

Virionen: Viruspartikel.

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2 3 DNA

Transcription

hn RNA

Umbau zur m—RNA

Abbildung 2: Vereinfachtes Schema der m-RNA-Synthese bei Eukaryonten. — Die mit 1, 2, 3 bezeichneten Blöcke stellen die Nukleotidsequenzen eines zu exprimierenden Gens dar. Im Transkriptionsschritt wird die gesamte zwischen A und B gelegene DNA-Sequenz durch die RNA-Polymerase II in hn-RNA (hochmolekulare nukleäre RNA), das primäre Transkriptionsprodukt, über- schrieben. Der Umbau der hn-RNA zur m-RNA zeigt mindestens drei Elemente:

1) „Splicing": An bestimmten Sequenzen (I) wird die hn-RNA endonukleoly- tisch gespalten und die Abschnitte 1, 2, 3 werden durch eine RNA-RNA-Ligase aneinandergespleißt.

11) Am 3'-Ende der m-RNA wird eine 100-200 Nukleotide lange Polyadenyl- säure-Kette angehängt.

111) Das 5'-Ende der m-RNA wird durch 7-Methyl GpppmNp . Sequenz („cap") modifiziert (9\1= methyliertes Nukleotid)

5

4 i

1 2 1 3 r\-f\i' poly A

3 ,

"cap"

m-RNA logischen Bereich ist die Lösung

des Problems korrekter Expression in E.coli von entscheidender Bedeu- tung.

Weiterhin ist es wichtig, sich klarzu- machen, daß in Bakterien nur die klonierte cDNA eukaryotischer Gene exprimiert werden kann. Unter cDNA versteht man eine DNA, die der messenger-RNA eines Genes komple- mentär ist. Solche cDNA-Präparatio- nen werden durch das Enzym reverse Transkriptase an der mRNA als Matrize synthetisiert. Würde man die chromosomale DNA dieser Gene in E.co/iklonieren, könnte nicht einmal funktionelle m-RNA entstehen, da E.coli nicht die Enzyme des „splicing"-Mechanismus besitzt (Abbil- dung 2).

Hier muß erwähnt werden, daß die Sequenzen einer sogenannten cRNA und die der chromosomalen DNA des gleichen Gens von Euka-

ryonten nicht identisch sind. Die Er- klärung für diese Diskrepanz liegt im Phänomen des „splicing". Das pri- märe Transkriptionsprodukt von Ge- nen in eukaryotischen Zellen wird vielfältig umgebaut, so daß bestimmte interne Sequenzen exzidiert werden und die entstehenden Bruchstücke wieder aneinanderge- spleißt werden (Abbildung 2). Die so entstehende mRNA enthält damit nur einen Teil der Sequenzen des ursprünglichen Genomabschnittes.

Auch in eukaryotischen Zellen konn- ten Gene heterologen Ursprungs zur Expression gebracht werden (6). Da- bei war das [3-Globin-Gen des Kanin- chens sehr genau an den späten

„Promotor" des SV40-Genoms an- gefügt worden und gemeinsam mit viralen Sequenzen von der RNA-Po- lymerase II der Affenzellen transkribiert worden (6). In anderen Experi- menten, so bei der Expression von Histon-Genen aus Drosophila mela-

nogaster (7) oder transfer-RNA-Ge- nen aus Hefe (8) enthielt die in SV40 klonierte heterologe DNA ihre eigenen Drosophila-, beziehungsweise Hefe-„Promotor"-Sequenzen.

Bei den bisher beschriebenen Expe- rimenten verwandte man als Hilfsor- ganismus für die Genklonierung und in einzelnen Fällen für die Genex- pression Bakterien, meist Escheri-

chia coli, da dessen Genetik und Molekularbiologie sehr genau bekannt sind. Zum Teil wurde auch die DNA tierischer Viren (SV40) als Vek- tor benützt.

In den letzten Jahren wurden in zu- nehmendem Maße auch Versuche beschrieben, die zum Ziel hatten, auf Säugerzellen-Chromosomen, DNA oder spezifische Gene direkt zu übertragen und diese Gene zur Ex- pression zu bringen. Diese mögli- cherweise sehr erfolgversprechen- den Ansätze sollen in dieser Über- sicht nur kurz erwähnt werden. Hier könnten sich Möglichkeiten zur Gentherapie erkennen lassen. Aller- dings ist bisher völlig ungeklärt, wie man in allen Zellen, zum Beispiel eines defekten Organs, ein fehlen- des Gen substituieren könnte.

Über die Konzepte, die technischen Grundlagen und Anwendungsgebie- te der Gentechnologie sind mehrere zusammenfassende Darstellungen erschienen (9, 10), deren Lektüre dem Leser nach dieser kurzen Ein- führung tieferen Einblick vermitteln kann. Auch über die potentiellen Ge- fahren, zum Beispiel die Übertra- gung von Genen, die zur Tumorent- stehung führen könnten, und die gebotenen Sicherheitsmaßnahmen beim Umgang mit heukombinierten Nukleinsäuren ist viel geschrieben worden. Ich empfehle dem Interes- sierten die Lektüre eines Artikels in der Zeitschrift Science (11), in dem Wissenschaftler aus eigener Initiati- ve zu einer gewissen Vorsicht rieten, bis ausgiebige Erfahrungen mit der neuen Technologie vorlägen. Auch die gegenwärtig zum Beispiel in den Vereinigten Staaten (12) oder in der Bundesrepublik Deutschland (13) und vielen anderen Ländern gülti- gen Richtlinien können Aufschluß

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geben über das Verantwortungsbe- wußtsein der auf diesem Gebiet ar- beitenden Wissenschaftler.

3. Entwicklung der Gentechnologie Nachdem wesentliche Mechanis- men der Molekularbiologie bei Pro- karyonten aufgeklärt worden waren, begannen viele Wissenschaftler mit dem Versuch, die am Modellorganis- mus E.coli erarbeiteten Erkenntnis- se auf Eukaryonten zu übertragen, deren Genom etwa 1000mal komplexer als das von Prokaryonten ist.

Bald stellte sich heraus, daß bei der Analyse der Eukaryontengenetik völ- lig neue Wege gegangen werden mußten.

Die ersten entscheidenden Experi- mente der /n-vitro-Verknüpfung von Nukleinsäuren unterschiedlicher Herkunft gelangen zwei Forscher- gruppen an der Stanford University (14, 15). Bei einem dieser Experi- mente (14) wurden spezifische Frag- mente der DNA des Bakteriophagen Ä, und der DNA des Affenvirus SV40 miteinander verbunden. Hier muß erwähnt werden, daß für die Durch- führung solcher Experimente die Entdeckung der Restriktionsendo- nukleasen aus Mikroorganismen eine der wichtigen Voraussetzungen gewesen ist (16, 17). In Stanford (18, 20), beziehungsweise San Francisco (19) wurden auch die ersten Experi- mente durchgeführt, in E.coliVekto- ren heterologe DNA einzubauen.

Hybrid-DNA wurde nach Transfor- mation von E.colikZellen in diesen Zellen repliziert beziehungsweise exprimiert (20). In schneller Folge wurden andere selbstreplizierende DNA-Moleküle, insbesondere des Bakteriophagen X und des Affenvi- rus SV40, als Vektoren fremder DNA für die Gentechnologie entwickelt (14, 21, 22).

Vielbeachtete Erfolge brachten auch Experimente, die es ermöglichten, eukaryotische Gene in Bakterien zur Expression zu bringen. In den letzten Jahren gelang in E.coli die Syn- these des Wachstumshormons (23), des Somatostatins (24), des menschlichen Insulins (5) und des Proinsu- lins der Ratte (4).

In jüngster Zeit ist man neue Wege gegangen und hat die DNA des Af- fenvirus SV40 als Vektor für Säuger- zellen entwickelt (22). Da in einer Affenzelle zwischen 10 5 und 10 6 Vi- rus-DNA-Moleküle synthetisiert werden, bietet dieses System gute Am- plifikationsmöglichkeiten.

4. Transfektion eukaryotischer Zellen mit heterologer DNA Seit langem ist bekannt, daß Säuger- zellen fremde DNA, zum Beispiel vi- rale DNA, nicht nur aufnehmen, son- dern auch in das zelluläre Genom integrieren und wenigstens teilweise exprimieren können (25, 26). In den letzten Jahren hat man gezielt Ver- suche durchgeführt, Säugerzellen mit Genen heterologen Ursprungs zu transformieren. So ist es gelun- gen, Mauszellen, die im Thymidinki- nase-Gen mutiert waren (TK -), durch Transfektion mit Herpesvirus-DNA, die ein virusspezifisches Thymidin- kinase-Gen trägt, zu TK+-Zellen zu transformieren (27). In den gleichen Versuchen konnte nachgewiesen werden, daß auch gleichzeitig zur Transfektion verwendete Bakterio- phagen-DNA mit in das zelluläre Ge- nom integriert wurde. Ähnliche Transformationsexperimente gelangen auch mit dem klonierten ß-Glo- bin-Gen des Kaninchens (28). Die beschriebenen Versuche legen die Vermutung nahe, daß Säugerzellen und vielleicht alle Zellen unter ge- eigneten Bedingungen jede Art von DNA heterologen Ursprungs aufzu- nehmen und ins Genom zu integrieren vermögen. Es ist noch völlig un- geklärt, welche Rolle diese Mecha- nismen bei der Evolution gespielt haben. Umgekehrt ist kürzlich am Beispiel virustransformierter Zellen gezeigt worden, daß DNA-Sequen- zen aus Säugerzellen auch verloren gehen können (29).

5. Theoretische und praktische Bedeutung der Gentechnologie Die Entwicklung der Gentechnolo- gie ist von theoretischer und prakti- scher Bedeutung. Die Isolierung und Charakterisierung eukaryotischer Gene und Untersuchungen über die Regulation eukaryotischer Gene

sind eine wichtige Voraussetzung zum Verständnis der Funktion des eukaryotischen Genoms. Diese Er- kenntnisse sind zweifellos noch in einer Anfangsphase, aber es werden laufend neue Prinzipien der Mole- kularbiologie von Eukaryonten entdeckt. Man kann noch nicht voraus- sagen, wie schnell diese Ergebnisse in die Analyse medizinischer Proble- me Eingang finden werden. Ohne die entsprechenden molekularbiolo- gischen Grundlagen würde das Ver- ständnis der Ursachen komplexer Krankheiten, wie zum Beispiel bös- artiger Geschwülste, der Immun- krankheiten, vieler Erbkrankheiten, latenter Virusinfektionen usw. weiterhin auf einer eher empirisch-phä- nomenologischen Ebene verbleiben müssen.

Einige wichtige Gene, die bisher kloniert und in E. coli zur Expression gebracht worden sind, sollen nochmals kurz erwähnt werden. Es sind dies Somatostatin (24), Insulin (4, 5), das Wachstumshormon der Ratte (23) und die Hüllproteine des Hepati- tis-B-Virus (30). Das letztere Produkt könnte für die Herstellung eines DNA-freien Impfstoffes gegen Hepa- titis B von Bedeutung sein. Mehrere Laboratorien arbeiten daran, die Ge- ne für ACTH und Interferon in E. coli in das aktive Hormon beziehungsweise den aktiven Wirkstoff umzu- setzen.

6. Potentielle Gefahren und Sicherheitsrichtlinien

Von extrem konstruierten Gefah- renszenarios abgesehen ist man heute zu dem Schluß gekommen, daß es bei Verwendung von E.coli- Vektoren keine nachweisbaren Ge- fahren der Gentechnologie gibt, die die Gefährlichkeit der Spendermole- küle übersteigen. Andere Vektoren sind noch nicht so gründlich untersucht worden. Die sehr sorgfältig ausgearbeiteten Sicherheitsrichtli- nien, insbesondere die in den USA und England gültigen, waren in den ersten Jahren nach Entwicklung der neuen Technologie notwendig und sinnvoll. Auch in der Bundesrepu- blik Deutschland sind derartige Richtlinien entwickelt und befolgt

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worden. Die gezielte Verabreichung von Polyomavirus-DNA in E.coli- Plasmiden oder im Phagen X an Hamster ergab sogar eine niedrigere lnzidenz von Tumorraten in diesen Hamsterpopulationen, als wenn Po- lyomavirus selbst verabfolgt wurde (31). Der negative Ausgang dieser und ähnlicher gezielter Versuche hat es ermöglicht, daß die Sicher- heitsmaßnahmen in den USA we- sentlich vereinfacht werden konn- ten. Es wäre wünschenswert, sich auch in der Bundesrepublik Deutschland dieser Entwicklung an- zuschließen. Das Bundesministe- rium für Forschung und Technolo- gie plant zwar zur Zeit, diese Art der Forschung durch ein sogenanntes Gentechnologiegesetz zu reglemen- tieren. Derartige Überlegungen müs- sen aber nochmals mit Besonnen- heit geprüft und in Zukunft dem letzten internationalen Erfahrungsstand angepaßt werden. Politische Erwä- gungen sollten bei der Einbringung einer solchen Gesetzesvorlage, mit der die Bundesrepublik als einziger Staat eine extrem legalistische Re- gelung treffen würde, keine Rolle spielen. Die Gentechnologie scheint nach jetziger Erkenntnis jedenfalls keine Gefährdungen mit sich zu bringen. Trotzdem ist es geboten, diesen Erkenntnisstand laufend zu überprüfen und zu erweitern.

7. Zukünftige Entwicklungen Die praktischen Anwendungsmög- lichkeiten der Gentechnologie für die Herstellung von Hormonen, Impfstoffen und anderen Produkten könnten in Zukunft von großer Be- deutung sein. Wichtig scheinen mir diese Methoden aber vor allem als Hilfsmittel in der molekularbiologi- schen Grundlagenforschung. Ein einfaches Beispiel soll diese Aussa- ge erläutern. Die Behandlung des Diabetes mellitus mit Insulin stellt eine lebenserhaltende Substitu- tionstherapie, aber keine kausale

Behandlung dar. Die Grundlage einer kausalen Therapie kann vielleicht einmal das Verständnis der In- sulin-Genregulation sein: Warum wird das Insulin-Gen in den (3-Zellen der Langerhansschen Inseln im Pan-

kreas des Diabetikers nicht mehr geregelt exprimiert und Insulin in ausreichender Menge produziert?

Menschliches Insulin kann vielleicht in absehbarer Zukunft in größeren Mengen im Bakterium E.colisynthe- tisiert werden. Vielleicht wird man auch in der Lage sein, hochspezifi- sche Impfstoffe gegen bestimmte Strukturproteine von Viren herzustellen und damit ungefährliche Vi- russchutzimpfungen durchführen.

Auf lange Sicht -wird es aber von noch größerer Bedeutung für die Medizin sein, unser Verständnis der Funktion des menschlichen Genoms zu vertiefen. Insbesondere Probleme der Genregulation werden für die Lösung medizinischer Probleme von entscheidender Wichtigkeit sein. Ei- ne der Herausforderungen für die Medizin der Zukunft ist die Erklä- rung und Behandlung von Krankhei- ten auf molekularer Ebene. Auch diesem Ziel könnte die Grundlagen- forschung durch die Gentechnolo- gie nähergebracht worden sein.

Literatur

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Anschrift des Verfassers:

Professor Dr. med.

Walter Doerfler Institut für Genetik der Universität zu Köln Weyertal 121 5000 Köln 41

Pathophysiologie des neurogenen Lungenödems

Der Autor unterscheidet nach dem wahrscheinlichen Ort der Hirnläsion zwei Formen des neurogenen Lungenödems:

Bei Schädigung hypothalami- scher Strukturen kommt es zur Aus- bildung eines Permeabilitätslungen- ödems (hoher Eiweißgehalt der Ödemflüssigkeit). Wie fortlaufende Registrierungen der Hämodynamik zeigen, geht dem Lungenödem eine exzessive Blutdrucksteigerung im großen und kleinen Kreislauf voraus (Mitteldruck höher als 250 mmHg, beziehungsweise höher als 50 mmHg). Obwohl sich die Kreislauf- werte rasch normalisieren, persi- stiert das Lungenödem, wahrschein- lich bedingt durch eine bleibende Permeabilitätsänderung der alveo- kapillären Membran bei Überdeh- nung der Kapillarendothelien wäh- rend der exzessiven Blutdruckstei- gerung. Tierexperimentell konnte nachgewiesen werden, daß die Blut- drucksteigerung nach Hypothala- musläsion auf einer massiven Frei- setzung von Katecholaminen be- ruht. Bei prophylaktischer Gabe von Alpha-Blockern läßt sich die Blut- drucksteigerung und das Lungen- ödem verhindern. Die Gabe von Alpha-Blockern nach Beginn der Ödementwicklung hat auf das Lun- genödem keinen Einfluß mehr.

fp

Bei Schädigung des Nucleus tractus solitarius entwickelt sich ein sogenanntes hypertensives Lungen- ödem durch Aufhebung der zentra- len Barorezeptorreflexe. Diese Form des Lungenödems ist auch gekennzeichnet durch eine massive Steige- rung des Systemblutdrucks mit kon- sekutivem Anstieg des linksventriku- lären enddiastolischen Füllungs- drucks. Der Blutdruck erreicht je- doch nicht die exzessiven Werte wie bei hypothalamischer Schädigung.

Im Gegensatz zum hypothalamisch ausgelösten Lungenödem persi- stiert die Blutdrucksteigerung wäh- rend der gesamten Phase der Ödem- entwicklung; diese Form des neurogenen Lungenödems läßt sich zu je-