Tierärztliche Hochschule Hannover
Experimentelle Untersuchungen zur antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin am isolierten Kaninchenherzen
INAUGURAL- DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Magdalena Sterneberg
aus Heidelberg
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Michael Fehr Klinik für Kleintiere
Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Prof. Dr. Peter Milberg
Abteilung für Rhythmologie, Department für Kardiologie und Angiologie,
Universitätsklinikum, Münster
1. Gutachter: - Prof. Dr. Michael Fehr
2. Gutachter: - Prof. Dr. Sabine Kästner
Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2016
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung………...1
2. Literaturübersicht………..3
2.1. Anatomische und Physiologische Grundlagen………..3
• Anatomischer Aufbau des Kaninchenherzens • Physiologie des ventrikulären Aktionspotentiales • Physiologie des atrialen Aktionspotentiales 2.2 Pathophysiologie………9
2.2.1 Grundlagen ventrikulärer Arrhythmien………...9
• Störungen der Repolarisation als Grundlage für Herzrhythmusstörungen • Das lange QT- Syndrom • Frühe Nachdepolarisationen (early afterdepolarizations, EADs) • Torsades de Pointes 2.2.2 Vorhofflimmern………...14
• Entstehung von Vorhofflimmern • Beteiligte Ionenkanäle und therapeutische Ansätze 2.3. Antazolin………...20
3. Material und Methode……….... 22
3.1. Versuchstiere………22
3.2. Präparation des Kaninchenherzens………..22
3.3. Langendorff- Versuch am isolierten Kaninchenherzen………..23
3.3.1. Versuchsapparatur………...24
• Wärmebad und Perfusionslösung • Elektrokardiogramm • Ableitung der monophasischen Aktionspotentiale (MAPs) • Intraventrikuläre Druckmessung 3.3.2. Versuchsprotokoll der ventrikulären Versuchsreihen………29
• AV- Block und Stimulation
• Frequenztreppe
• Refraktärzeitbestimmung
• Hochfrequenz- Stimulation
• Hypokaliämische Phase und Registrierung der Herzrhythmusstörungen
• Dosis- Wirkungs- Versuche mit Antazolin
• Provokationsversuche zur Simulation des LQT2
• Provokationsversuche zur Simulation des LQT3
3.4. Auswertung………..32
• Bestimmung der Repolarisationszeiten • Messung der QT- Zeiten 3.5 Statistik……….33
3.6. Vorhofversuche………..34
3.6.1. Versuchsaufbau………....34
3.6.2. Versuchsablauf………..36
• Stimulation und Stimulationsschwelle • Frequenztreppe • Effektive Refraktärzeit (aERP) • Hochfrequenz- Stimulation • Infusion von Acetylcholin und Isoproterenol • Infusion von Antazolin, Ivabradin, Vernakalant und Flecainid 3.6.3. Auswertung………39
• Bestimmung der Repolarisationszeiten der atrialen APD90 • Registrierung von Vorhofflimmern • Berechnung der Post- Repolarisations- Refraktärität (aPRR) • Ermittlung der Leitungszeit 3.6.4. Statistik………..40
4. Ergebnisse………41
4.1. Untersuchungen zu ventrikulären Arrhythmien……….. 41
4.1.1 Einfluss von Antazolin auf die Aktionspotentialdauer, das QT- Intervall, die Refraktärzeit und die Dispersion der Repolarisation……….41
4.1.2 Die antiarrhythmische Wirkung von Antazolin an einem Modell des LQT2Syndroms………..43
• APD90 und QT- Intervall
• Refraktärzeit und Dispersion
• Frühe Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes
4.1.3 Die Wirkung von Antazolin an einem Modell des LQT3-Syndroms…...53
• APD90 und QT- Intervall
• Refraktärzeit und Dispersion
• Frühe Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes
4.2 Untersuchungen zu Vorhofflimmern- Provokationsversuche mit Acetylcholin und Isoproterenol………58 4.2.1 Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin………..58
• Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit
• Auftreten von Vorhofflimmern
4.2.2 Vergleichende Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von
Ivabradin………...62
• Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit
• Auftreten von Vorhofflimmern
4.2.3 Vergleichende Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von
Vernakalant………..67
• Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit
• Auftreten von Vorhofflimmern
4.2.4 Vergleichende Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von
Flecainid………72
• Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit
• Auftreten von Vorhofflimmern
5. Diskussion………...76
5.1 Arrhythmogenese durch QT- Verlängerung………77
5.2 Einfluss von Antazolin auf die Arrhythmogenese durch QT- Verlängerung...79
5.3 Entstehungsmechanismus von Vorhofflimmern- Provokation mit Acetylcholin und Isoproterenol……….81
5.4 Atriale antiarrhythmische Effekte von Antazolin……….82
5.5 Vergleich der atrialen antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin mit
Vernakalant, Flecainid und Ivabradin………...84
• Vergleichende Analyse zwischen Antazolin und Vernakalant • Vergleichende Analyse zwischen Antazolin und Flecainid • Vergleichende Analyse zwischen Antazolin und Ivabradin 5.6 Limitationen der Studie………..88
5.7 Ausblick………89
6. Zusammenfassung……….92
7. Summary………..94
8. Abbildungsverzeichnis………...96
9. Tabellenverzeichnis………99
10. Literaturverzeichnis………..100
11. Abkürzungsverzeichnis………120
12. Danksagung………..122
1. Einleitung
Die kardiologische Forschung ist sowohl in der Human- als auch in der Veterinär- medizin von großer Bedeutung. In der Tiermedizin spielt insbesondere die stark zunehmende Anzahl an Tierhaltern mit einer tiefen emotionalen Bindung zu ihren Haustieren eine entscheidende Rolle. Viele Tierbesitzer sind mittlerweile dazu bereit, umfangreiche Behandlungs- und Untersuchungskosten für das Wohl des Tieres zu übernehmen. Darüber hinaus fördern viele Zuchtverbände die Verbesserung der genetischen Gesundheit der Tiere und fordern ihre Mitglieder zu teilweise umfangreichen regelmäßigen Untersuchungen auf, um dies zu gewährleisten. Dies führt dazu, dass Forschungsarbeiten mit kardiologischem Schwerpunkt immer weiter vorangetrieben werden.
Diese Arbeit kann einen entscheidenden Beitrag zur veterinärmedizinischen und humanmedizinischen antiarrhythmischen Forschung leisten. Gerade im Zusammen- hang mit plötzlichen Todesfällen werden beim Menschen lebensgefährliche Arrhythmien als häufige Ursache gesehen [1]. Dabei stehen nicht nur genetische Dispositionen, sondern auch medikamentöse Therapien im Vordergrund in deren Folge es zu ventrikulären polymorphen Tachykardien kommen kann. Da die Dokumentation von plötzlichen Todesfällen in der Veterinärmedizin weitaus weniger erfolgt, ist auch dort von einer großen Dunkelziffer auszugehen, sowohl spontan, als auch unter der eventuellen Behandlung mit unterschiedlichen Substanzen mit proarrhythmischem Potenzial. Auch die Behandlung von bereits bestehenden Arrhythmien stellen Ärzte und Tierärzte immer wieder vor Probleme. So steigt die Inzidenz von Vorhofflimmern im Tierreich [2] als auch beim Menschen [3] immer weiter an und es werden neue Substanzen gesucht, die diese Rhythmusstörung zuverlässig hemmen können.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, die mögliche antiarrhythmische Wirkung von Antazolin, einem Antihistaminikum der ersten Generation aufzuzeigen, um damit eine mögliche Therapieoption zur Behandlung lebensgefährlicher Arrhythmien sowie die Reduktion der proarrhythmischer Wirkungen durch andere Medikamente zu ermöglichen. Dabei wurden aus klinisch unauffälligen Kaninchen die Herzen entnommen und mit Hilfe der Langendorff- Apparatur retrograd perfundiert. Durch die Zugabe verschiedener Substanzen konnten Rhythmusstörungen wie Torsardes de Pointes oder Vorhof- flimmern provoziert werden und die Wirkung von Antazolin sowohl auf ventrikulärer als auch auf atrialer Ebene elektrophysiologisch untersucht werden.
Dieses Modell wurde in der Abteilung für experimentelle Rhythmologie am Universitätsklinikum Münster schon vielfach genutzt und ist etabliert. Das Kaninchenherz eignet sich dafür besonders, da die Ionenströme in den Herzmuskel- zellen des Kaninchens mit denen des Menschen vergleichbar sind [4]. Somit sind die
Ergebnisse sowohl für die Veterinärmedizin als auch für die Humanmedizin von Bedeutung und wurden als Kooperation zwischen der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und der Abteilung für Rhythmologie des Departments für Kardiologie und Angiologie des Untiversitätsklinikums Münster durchgeführt.
2. Literaturübersicht
2.1. Anatomische und Physiologische Grundlagen
Anatomischer Aufbau des Kaninchenherzens
Das Kaninchenherz befindet sich zwischen dem dritten und sechsten Interkostalraum, kranial im Thorax [5] und schlägt mit einer Herzfrequenz zwischen 150- 300 Schlägen pro Minute. Das Herzgewicht beträgt dabei 0,3% des Körpergewichtes [6].
Das sauerstoffarme Blut wird beim Kaninchen während der Diastole über die rechte und linke V. cava cranialis [5,7,8], die in den Koronarsinus münden, und der V. cava caudalis dem rechten Atrium des Herzens zugeführt. Wenn der Druck im rechten Vorhof den intraventrikulären Druck übersteigt, öffnet sich die Valva tricuspidalis und das Blut kann in den rechten Ventrikel einströmen [9]. Die Trikuspidalklappe ist beim Kaninchen im Gegensatz zum Menschen zweizipflig [5,10] und über die sogenannten Chordae tendineae mit dem Endokard verbunden, sodass die Klappen nicht während der Systole in die Vorhöfe gedrückt werden können. Nachdem sich die rechte Hauptkammer des Herzens gefüllt hat, strömt in der Systole das Blut über die Pulmonalklappe in die beim Kaninchen stark muskuläre Pulmonalarterie [5,10,11]. So wird das sauerstoffarme Blut in die Lunge weitergeleitet und mit Sauerstoff wieder angereichert. Dieses sauerstoffreiche Blut gelangt nun wiederum während der Diastole in den linken Vorhof und wird über die zweizipflige Mitralklappe in den linken Ventrikel weitergeleitet und erreicht von dort aus während der Systole über die Aortenklappe die Aorta [10].
Die Versorgung des Herzens selbst erfolgt über die Koronararterien, dabei wird das Kaninchenherz vorallem über die linke Koronararterie versorgt, sodass es anfälliger für Myokardischämien ist [8,12].
Physiologie des ventrikulären Aktionspotentiales
Das Herz ist im Gegensatz zum Skelettmuskel fähig, selbständig ohne äußere Reize zu kontrahieren und dieses selbst außerhalb des Organismus. Grundlage dafür sind die verschiedenen Ionenströme in den Herzmuskelzellen, die durch Kanalproteine und Transporter, welche die undurchlässige Lipiddoppelschicht der Zellwand durchziehen, ermöglicht werden [13,14,15,16]. Besonders in den Bereichen zwischen den einzelnen Herzmuskelfasern befinden sich in den sogenannten Glanzstreifen, Gebiete mit erhöhter Leitfähigkeit, welche die einzelnen Zellen zu einem funktionellen Synzytium verbinden. So ist eine Herzmuskelfaser nicht isoliert wie im Skelettmuskel [17].
Doch dies allein führt noch nicht zur vollständigen Autonomie des Herzens. Erst durch die verschiedenen Eigenschaften der Herzmuskelzellen kann dies erfüllt werden. So lassen sich Zellen des erregungsbildenden Systems im Herzen von denen des Arbeitsmyokardes unterscheiden [18], wobei die Zellen des Arbeitsmyokardes noch
weiter in endokardiale, epikardiale und sogenannte midmyokardiale (M-Zellen) unterteilt werden müssen. Die genannten Zelltypen unterscheiden sich hinsichtlich der Verteilung der Ionenkanäle [19,20].
Das Aktionspotential von Myokardzellen des Herzens lässt sich nach Kreating und Sanguinetti in fünf Phasen (0-4) unterteilen [13].
Die Phase 0 beinhaltet die schnelle Depolarisation der Muskelzelle durch einen raschen spannungs- und zeitgesteuerten Natriumeinstrom (INa) in die Zelle [14]. Dieser erfolgt aufgrund einer erhöhten extrazellulären Natriumkonzentration und der hohen negativen Ladung im Zellinneren entlang des elektrochemischen Gradienten [16,21].
Nahezu gleichzeitig erfolgt ebenfalls potential- und zeitgesteuert die Aktivierung von einem Kalziumkanal ICa-L (long-lasting), der zu einem Kalziumeinstrom führt, der wiederum Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Reticulum über Ryanodinrezeptoren freisetzt und so die Depolarisation weiter verstärkt [15,22]. Ein Natrium- Kalzium- Austauscher (NCX) unterstützt die Freisetzung von Kalzium in den intrazellulären Raum zusätzlich [23].
Mit der rasch einsetzenden Öffnung des Kaliumkanales Ito tritt die Phase 1 ein [21]. Es kommt zum Kaliumausstrom und damit zur kurzen und schnellen Repolarisation. Da der Kaliumkanal Ito endokardial seltener vorkommt [24], gibt es beim endokardialen Aktionspotential keine ausgeprägte Phase 1 im Gegensatz zum Aktionspotential der M- Zellen und der epikardialen Herzmuskelzellen [19].
Während der Phase 2 erfolgen so gut wie keine Nettoladungsverschiebungen [13,25], es besteht ein Gleichgewicht zwischen einem langsamen Kalziumeinstrom ICa-L [15,22]
und einem spannungsabhängigen Kaliumausstrom. Dieser erfolgt zum Großteil durch IKr(rapid=r) und IKs(slow=s) [26,27]. Diese Kanäle sind bei den verschiedenen Spezies und Individuen unterschiedlich häufig und inhomogen verteilt [14], somit eignet sich nicht jede Spezies als Modell für das humane Herz. Das Kaninchen stellt jedoch aufgrund vergleichbarer Ionenkanäle und vergleichbarer geschlechtsabhängiger Eigenschaften der Herzmuskelzellen ein geeignetes Modell dar [28].
Eine Mutation im HERG-Gen (human-ether-a-go-go related gene), mittlerweile als KCNH2-Gen bezeichnet [28,20], welches für die α- Untereinheit von IKr kodiert [15], führt so beispielsweise zu einer Form des Langen- QT- Syndromes (LQT2) [28,29]. Es wurden bereits genveränderte Kaninchen gezüchtet, die ebenfalls die Mutation im HERG-Gen oder im KVLQT1 aufweisen und so als Modell für das LQT1 und LQT2 dienen [30].
Darüber hinaus greifen viele Antiarrhythmika und andere Medikamente an diesem Kanal an und blockieren ihn [31,32], was gerade in der Plateauphase des Aktions- potentiales zu erheblichen Ladungsschwankungen und Herzrhythmusstörungen führen kann, da in dieser Phase kleine Veränderungen der Ladungsverteilung große Auswirkungen haben können [13].
Die Kaliumkanäle IKr und IKs führen in der Phase 3 zur weiteren Repolarisation [33].
Diese wird durch einen weiteren potenzialgesteuerten Kaliumausstrom IK1 noch verstärkt [14,22].
Dieser Kaliumausstrom IK1 hält auch das Ruhemembranpotential der Myokardzelle bei -80 bis -90mV [16,22] aufrecht. Das Ruhepotential entspricht damit einem Kaliumgleichgewichtspotential [21].
Mit Hilfe des Natrium-Kalzium-Austauschers (NCX) werden während der Diastole, im Austausch drei Natriumionen ins Zellinnere und ein Kalziumion nach außen, beziehungsweise zurück ins sarkoplasmatische Retikulum transportiert [34]. Darüber hinaus werden durch eine Natrium/Kalium Pumpe drei Natriumionen nach außen und zwei Kaliumionen ins Zellinnere transportiert [21] und somit die ursprünglichen Ladungsverhältnisse wieder hergestellt.
Das Aktionspotential und die Refraktärzeit der Herzmuskelzelle dauert durch die lange Plateauphase 200-400ms an und ist damit deutlich länger als das einer normalen Muskelzelle mit 2-4ms, was eine grundlegende Schutzfunktion gegen eine tetanische Erregung darstellt [16].
Abbildung 1: Ventrikuläres Aktionspotential
Das erregungsbildende System des Herzens besteht aus dem Sinusknoten, dem AV- Knoten, dem His-Bündel, der Tawara- Schenkel und den Purkinjefasern [12]. Dabei ist der Sinusknoten der primäre Rhythmusgeber; erst wenn dieser ausfällt, entsteht ein neuer Ersatzrhythmus von untergeordneter Stelle mit niedrigerer Schlagfrequenz [35].
Abbildung 2: Schrittmacherpotential
Das Aktionspotential der erregungsbildenden Zelle ist gekennzeichnet durch einen langsam depolarisierenden, hauptsächlich aus Natrium- und Kaliumionen bestehenden [36] Kationeneinstrom If (funny channel) [37], der durch eine Hyper- polarisation unter -40/-45 mV aktiviert wird [38] und einer starken Regulation durch das autonome Nervensystem unterliegt [36,39]. Dieser führt zu einem rhythmisch wiederkehrenden Präpotential, insbesondere weil in den Schrittmacherzellen ein stabilisierender Kaliumstrom IK1 im Gegensatz zu den kontrahierenden Herzmuskel- zellen nicht vorhanden ist [35]. Wenn das Präpotential die spezifischen Schwellen- werte erreicht, öffnen sich ein schnell inaktivierbarer (transienter) Kalziumkanal ICa-T
und ein länger fortdauernder Kalziumkanal ICa-L, die zum Einstrom von Kalziumionen und dadurch zur raschen weiteren Depolarisation der Zellmembran führen [40]. Dies entspricht der Phase 0 des Aktionspotentiales. Eine schnelle Repolarisation und eine Plateauphase gibt es bei den Zellen des erregungsbildenden Systems nicht, sondern es folgt direkt die Phase 3 durch einen Kaliumausstrom über IKr und IKs, wobei die Verteilung zwischen den Spezies und entlang des erregungsbildenden Systems variiert. So werden beispielsweise beim Kaninchen im Sinusknoten und AV- Knoten hauptsächlich IKr und in den Purkinjezellen beide Kaliumkanäle exprimiert [41].
Das Präpotential nimmt ausgehend vom Sinusknoten über die restlichen Anteile des erregungsbildenden Systems an Steilheit ab, somit wird eine Ordnung der Erregungs- bildung erreicht [42].
Physiologie des atrialen Aktionspotentiales
Abbildung 3: Atriales Aktionspotential
Die Phase 0 wird in den atrialen Myozyten durch den Einstrom von Natriumionen über INa und den Einstrom von Kalziumionen über ICa-L ausgelöst [43]. ICa-L stellt auch den wichtigsten Kationeneinstrom während der Plateauphase des Aktionspotentials dar und wird im Gegensatz zum Ventrikel über second messenger wie Serotonin [44] und in Abwesenheit von ß-adrenerger Stimulation, von Phosphodiesterasen reguliert [45,46]. Während Phasen von Vorhofflimmern [47] bzw. durch eine Dilatation der Vorhöfe [48] wird der Kalziumeinstrom über ICa-L reduziert und somit sowohl die atriale Aktionspotentialdauer (aAPD) als auch die Refraktärzeit verkürzt und die Schaffung von Reentry- Mechanismen begünstigt [49]. Die Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, welche in den Vorhofmyozyten deutlich weniger ausgeprägt ist als in ventrikulären Herzmuskelzellen, wird ebenfalls durch den Einstrom von Kalzium über ICa-L getriggert [50]. Die Repolarisation während der Phase 1 findet überwiegend über den kalziumabhängigen Chlorideinstrom Ito2 statt [51]. Die
weitere Repolarisation erfolgt über einen vorhofspezifischen, frequenzabhängigen KaliumausstromIKur (ultra- rapid) [52], Ito1 [41] und beim Menschen auch über IKr und IKs [53] statt. Während der Phase 2 halten sich der Kalziumeinstrom und Kalium- ausstrom die Waage.
Wie auch im Ventrikel ist das Ruhepotential von -80mV [43] ein Kaliumgleichgewichts- potential, welches über einen Kaliumausstrom durch IKAcH, IK1, welcher sich von dem ventrikulären IK1 in mehreren Eigenschaften unterscheidet [54], sowie durch IKATP
aufrecht erhalten wird [55].
2. 2 Pathophysiologie
2.2.1 Grundlagen ventrikulärer Arrhythmien
Jedes Jahr sterben circa 300‘000 Amerikaner am plötzlichen Herztod, der durch ventrikuläre Tachyarrhythmien verursacht wird. Viele Betroffene haben im Vorfeld kardiale Grunderkrankungen, aber es sterben auch immer wieder Personen ohne vorhergehende Symptomatik [1]. Da es bisher nicht möglich ist diese Arrhythmien vorherzusagen und vorzubeugen, laufen viele experimentelle Untersuchungen zur Aufklärung von Faktoren und Grundlagen, die zu diesen Herzrhythmusstörungen führen.
Der plötzliche Herztod aufgrund von Herzrhythmusstörungen betrifft jedoch nicht nur die Humanmedizin, sondern ist auch in der Veterinärmedizin von großem Interesse [56,57]. Insbesondere trifft dies auf die dilatative Kardiomyopathie zu, in deren Folge es immer wieder zu tödlichen Arrhythmien kommen kann.
Störungen der Repolarisation als Grundlage für Herzrhythmus- störungen
Die Repolarisationsphase stellt die vulnerable Phase des Aktionspotentials dar. So können schon geringe Veränderungen der Ionenvorgänge zu großen Potentialschwankungen führen, die nach Beendigung der absoluten Refraktärzeit zu neuen Erregungen führen können [20]. Eine Blockierung der für die Repolarisation erforderlichen Kaliumkanäle IKr und IKs (loss of function), beziehungsweise ein fehlendes Schließen der Natriumkanäle INa (gain of function) [13] führt zur Verlängerung der Repolarisation und somit zu einer Verlängerung des Aktionspotentiales und der QT-Zeit im EKG [29].
Da IKr und IKs in der Ventrikelmuskulatur inhomogen verteilt sind [58], kommt es bei Blockaden dieser Kanäle eventuell zu einer Dispersion der Repolarisation in der Ventrikelwand. So ist beispielsweise IKs midmyokardial weniger häufig vertreten als epi- und endokardial, wohingegen IKr in den bisherigen Studien gleichmäßiger verteilt ist; dies führt dazu dass sogenannte M-Zellen besonders anfällig für APD- Verlängerungen sind [59]. Dieses kann die Entstehung von ventrikulären Arrhythmien fördern, indem ein Reentry der Erregung möglich wird. Wenn beispielsweise die Erregung unidirektional auf nicht erregbares Gebiet trifft, kann die Erregung andere Wege nehmen, da Bereiche daneben beziehungsweise dahinter schon wieder erregbar sein können aufgrund unterschiedlicher Repolarisationszeiten [13]. Das Intervall vom Scheitelpunkt der T-Welle bis zu deren Ende kann als Maß für die Dispersion der Repolarisation im EKG verwendet werden [60].
Normalerweise wird diese Gefahr noch durch die sogenannte Repolarisationsreserve gesenkt, indem die nötigen Ionenkanäle im Überfluss exprimiert werden, beziehungsweise bei der Blockade eines essentiellen Ionenkanales wie beispielsweise IKr eine vermehrte Expression von Ersatzkanälen [61] stattfindet.
Bestehen jedoch weitere Faktoren wie beispielsweise Hypokaliämie [62,63], Bradykardie [64] und das weibliche Geschlecht [28], die zu einer Verlängerung der QT- Zeit und zu einer Verringerung der Repolarisationsreserve führen, so kann die Entstehung von Reentry-Mechanismen zusätzlich gefördert werden [29].
Allerdings führen nicht alle Medikamente, die eine Verlängerung der QT- Zeit bewirken, wie beispielsweise Amiodaron [65,66], zu schwerwiegenden Arrhythmien.
Erst wenn zusätzlich eine Dispersion der Repolarisation durch eine unterschiedliche Verteilung der blockierten Kanäle und eine Verringerung der Repolarisationsreserve stattfindet, kann dies als prädiktiver Faktor für lebensbedrohliche Herzrhythmus- störungen gewertet werden [67].
Schließlich führt eine gleichmäßige Verlängerung der Repolarisation und damit der absoluten Refraktärzeit über das gesamte Myokard zu einem Schutz vor abnormalen Erregungen, worin auch die Berechtigung für den jahrelangen Einsatz von Antiarrhythmika der Klasse ǀǀǀ begründet liegt.
Das lange QT- Syndrom
Als QT-Zeit bezeichnet man im EKG die Strecke zwischen dem Beginn des QRS- Komplexes und dem Ende der T-Welle. Am Besten eignet sich zum Ablesen der QT- Zeit die 2. Ableitung nach Einthoven [68]. Da die QT-Zeit von der Herzfrequenz abhängig ist, wird sie frequenzkorrigiert und dann als QTc bezeichnet [69].
Eine QT-Zeit von mehr als 500ms ist beim Menschen als pathologisch anzusehen und ist häufig mit lebensbedrohlichen Arrhythmien verbunden [70].
Das lange QT-Syndrom (LQTS) kann sowohl hereditär als auch erworben sein. Beim angeborenen LQTS bestehen Genmutationen, die zu fehlerhaften Expressionen der Ionenkanäle führen, die für die Repolarisation während des Aktionspotentials nötig sind. So kommt es zur Verlängerung der Aktionspotentiale und in der Summe auch zur Verlängerung der QT-Zeit [71]. Aufgrund der bestehenden Dispersion der Re- polarisation durch die inhomogene Verteilung der Ionenkanäle im Herzen [58] kann es zu lebensgefährlichen Arrhythmien vom Torsade de Pointes-Typ kommen, ins- besondere bei bestehenden Risikofaktoren wie Hypokaliämie [62,63] oder medi- kamenteller Therapie mit Substanzen, die ebenfalls die QT-Zeit verlängern [72].
Es lassen sich mittlerweile 15 Syndrome vom autosomal-dominanten Romano-Ward Typ und zwei Syndrome vom selteneren, mit Innenohrschwerhörigkeit einher- gehenden Jervell and Lange-Nielsen Typ unterscheiden, die auf verschiedenen Mutationen beruhen [70]. Die Unterformen LQT1-3 sind jedoch am häufigsten [73].
Abbildung 4: Einteilung der kongenitalen QT Syndrome aus: Genetic and Clinical Advances in Congenital Long QT Syndrome [74]
Das LQT1 beruht auf einer Mutation im KCNQ1 Gen, welches für den Kaliumkanal Kv7.1 codiert, den einwärtsgerichteten Ionenstrom IKs bewirkt und häufig zu Arrhythmien während körperlicher Belastung oder emotionalem Stress führt. Die Rhythmusstörungen treten hier typischerweise während des Schwimmens auf [75].
Das LQT2 wird durch eine Mutation im KCNH2 (HERG) Gen, welches für den einwärtsgerichteten Gleichrichterstrom IKr codiert, ausgelöst und kann sowohl in Ruhe als auch unter Belastung und postpartal Synkopen hervorrufen [75].
Das LQT3 entsteht durch eine Mutation im SCN5A Gen [76] und führt im Gegensatz zu den LQT1 und LQT2 zu einer Verstärkung der Expression des Natriumkanales (gain of function) und somit zu einem verstärkten Natriumausstrom und so folglich zur Verlängerung der Repolarisation [71]. Synkopen treten bei diesem Typ vor allem in Ruhe und in der Nacht auf [75]. Die Häufigkeit von lebensgefährlichen Arrhythmien ist bei Frauen mit dem LQT1 und LQT2 deutlich häufiger als bei Männern mit den gleichen genetischen Defiziten, während beim LQT3 häufiger männliche Personen betroffen sind [70].
Das erworbene LQTS kann durch den Einsatz von Medikamenten, welche die Kaliumkanäle IKr und/ oder IKs blockieren, beziehungsweise die Aktivität von INa
steigern, hervorgerufen werden. Insbesondere IKr ist ein Kanal, der von vielen
Medikamenten aufgrund seiner Struktur mit aromatischen Aminosäuren und deren Seitenketten sowie zwei Prolinresiduen in der Helix blockiert wird [77]. So bewirken viele Antiarrhyhthmika der Klasse ǀa und ǀǀǀ, Antihistaminika und Antibiotika eine Verlängerung der QT-Zeit [72]. Eine Verlängerung der Repolarisation reicht jedoch nicht aus, um gefährliche Arrhythmien auszulösen. Dafür müssen zusätzliche Faktoren vorhanden sein, die eine Dispersion der Repolarisation [58] und eine Verringerung der Repolarisationsreserve [29] bewirken.
In dieser Arbeit wurde das LQT2 durch die Gabe von Sotalol, einem Antiarrhythmikum der Klasse ǀǀǀ, welches den Ionenstrom durch IKr blockiert [78] und Erythromycin, einem Makrolidantibiotikum, welches ebenfalls IKr hemmt, simuliert [79,80]. Die Gabe von Veratridine, einem Alkaloid, führt über die Hemmung der Inaktivierung von INa zur QT- Verlängerung und entspricht damit dem LQT3 [81].
Frühe Nachdepolarisationen (early afterdepolarizations, EADs)
Cranefield nutzte im Jahre 1977 erstmals den Begriff der early afterdepolarizations (EADs) für neue Depolarisationen während der Repolarisationsphase des Aktions- potentiales [82]. Abzugrenzen sind diese von den späten Nachdepolarisationen (delayed afterdepolarizations, DADs), die erst nach der vollständigen Repolarisation, also während der Phase 4 des Aktionspotentials stattfinden [83].
EADs führen häufig zu Arrhythmien vom Torsade de Pointes Typ im Zusammenhang mit dem erworbenen und kongenitalen QT Syndrom [13,84], insbesondere wenn weitere Faktoren wie Hypokaliämie [84], Hypomagnesämie [85] und Bradykardie [64]
bestehen, welche die Entwicklung von Herzrhythmusstörungen begünstigen.
Grundlage für das Entstehen von EADs sind oszillierende Potentialschwankungen während der Plateauphase bzw. der 3. Phase des Aktionspotentials [86] und eine Hemmung des Ausstromes von Kationen bzw. eine Förderung von positiven einwärtsgerichteten Ionenströmen, welche die positive Ladung im Zellinneren fördern und damit die APD verlängern [87].
Wenn unter diesen Voraussetzungen eine zusätzliche Reaktivierung von Kationenkanälen erfolgt, beispielsweise durch eine Reaktivierung von ICa-L [88,89]oder INa [20] bzw. durch die vermehrte Aktivität des Natrium-Kalzium-Austauschers (NCX) [90] und damit der Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes, kann es zur erneuten Depolarisation kommen, bevor die vorhergehende Erregung beendet war.
Abbildung 5: Repräsentatives Beispiel früher Nachdepolarisationen am isolierten Kaninchenherzen
Torsades de Pointes
Dessertenne definierte 1966 erstmals den Begriff Torsades de Pointes (TdP) [91] um die polymorphen ventrikulären Tachyarrhythmien zu beschreiben, bei denen die Kammerkomplexe um die isoelektrische Linie rotieren und eine typische Spitzenumkehr der QRS-Komplexe auftritt [92]. Damals wurden die beschriebenen Arrhythmien noch nicht mit einem verlängerten QT-Intervall in Verbindung gebracht.
Erst um 1970 wurde die Verlängerung der QT-Zeit durch verschiedene Medikationen als Ursache für das Auftreten von TdP als sicher angesehen [29].
Grundvoraussetzung für das Auftreten von TdP ist eine Dispersion der Repolarisation [58], eine Reduktion der Repolaristionsreserve [29] und das Auftreten von EADs als Auslöser [20]. Dabei reicht eine QT-Verlängerung durch Medikamente wie beispielsweise Antiarrhythmika der Klasse ǀa und ǀǀǀ, Antibiotika wie Erythromycin, beziehungsweise Antihistaminika wie Terfenadine oder Psychopharmaka [72] nicht aus, sondern es müssen weitere Faktoren vorhanden sein, die die repolarisierende Kanäle beeinträchtigen [85,93-95]. So wurde zum Beispiel bei einigen Afroamerikanern und einer kaukasischen Familie eine Mutation festgestellt, welche zu einer Veränderung der Aktivierung des Natriumkanales führt, womit es häufiger zu Arrhyhthmien bei diesen Personen im Zusammenhang mit einer Blockierung des IKr- Kanales kommt [29].
Viele Medikamente werden darüber hinaus über das Enzymsystem P450 verstoffwechselt. Kommt es zu einer Blockade oder kompetitiven Hemmung mit einem anderen Stoff um dieses System, steigt der Plasmaspiegel des Medikamentes im Blut und dies kann in vielen Fällen zu einem erhöhten Risiko für das Auftreten von TdP führen [96]. So steigt die Anzahl von TdPs unter der Anwendung von Sotalol mit steigenden Wirkstoffspiegeln [97,98]. Ebenso kann es zu einer Erhöhung der Plasmaspiegel bestimmter Stoffe kommen, wenn die Leber- bzw. Nierenfunktion beeinträchtigt ist [99].
Abbildung 6: Repräsentatives Beispiel einer Torsades de Pointes- Episode am isolierten Kaninchen- herzen
2.2.2 Vorhofflimmern
Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung beim Menschen und die Prävalenz steigt laut epidemiologischer Studien immer weiter an [3]. Die Ursache für die zunehmende Häufigkeit liegt wohl im demographischen Wandel der Gesellschaft, da das Auftreten von Vorhofflimmern mit zunehmendem Alter ansteigt [100]. Die Pathogenese ist noch immer nicht vollständig aufgeklärt, Risikofaktoren stellen jedoch Bluthochdruck, das männliche Geschlecht, Diabetes mellitus Typ 2, bestimmte
genetische Faktoren, Klappenerkrankungen des Herzens sowie andere chronische Herzerkrankungen und ein erhöhtes Lebensalter dar [101].
Abbildung 7: Repräsentatives Beispiel einer induzierten Vorhofflimmerepisode am isolierten Kaninchen- herzen
Entstehung von Vorhofflimmern
Vorhoffimmern ist eine sehr komplexe Herzrhythmusstörung und es sind diverse Mechanismen an der Entstehung beteiligt. Als grundlegender Mechanismus wird heute die Entstehung sogenannter Rotoren angesehen, indem eine Erregungswelle auf ein Hindernis, beispielsweise durch die Heterogenität oder Fibrose des Gewebes, trifft.
Dabei entstehen durch den Rotor neue Erregungswellen, die ebenfalls zur Entstehung neuer Rotoren führen können [102]. Bereits 1962 wurde von Gordon Moe die „multiple wavelet“ Hypothese aufgestellt, in der die Entstehung von Vorhofflimmern in Rotoren und vielen gleichzeitig auftretenden Wellen begründet liegt [103]. Diese Hypothese wurde 1977 von Allessie durch die „leading circle“ Theorie zunächst abgelöst, die im Gegensatz zu den Ergebnissen von Moe nicht auf Computersimulationen beruhte, sondern anhand von Experimenten am Kaninchenherzen aufgestellt wurde [104]. Ein wesentlicher Unterschied zwischen
beiden Hypothesen ist, dass bei der „leading circle“ Hypothese das Zentrum des Erregungsringes refraktär ist, da sich die Erregung zentripetal ausbreitet, während bei der Rotorhypothese von einem erregbaren Zentrum ausgegangen wird und damit die Rotoren nicht lokal fixiert sind, sondern beweglich [105]. Außerdem ist bei der Theorie von Rotoren die Kurvatur der Spirale von Bedeutung hinsichtlich der Geschwindigkeit der Erregungsausbreitung. So breiten sich die Wellen um so schneller aus, je konkaver die Struktur des Rotors ist, während die Gesamtgeschwindigkeit mit zunehmender Kurvatur abnimmt, sodass die Depolarisationswelle im Rotorenkern die umliegenden Zellen nicht mehr erregen kann [106]. Dadurch entsteht ein elektrisches Potential zwischen dem Kern und dem umliegenden Gewebe, welches zu einer APD Verkürzung der kernnahen Myozyten führt und damit zur Stabilisierung des Rotors [107].
Durch Allessie selbst wurde schließlich im Jahre 1985 der experimentelle Nachweis für die „ multiple wavelet“ Hypothese erbracht [108].
Die Entstehung eines Rotors kann experimentell beispielsweise durch das S1- S2 Protokoll erreicht werden [109]. Dabei wird kurz nach dem ersten Stimulus (S1) ein zweiter Stimulus (S2) gesetzt, dessen Erregungsfront senkrecht zu der von S2 gerichtet ist. Durch die teilweise blockierte Erregungsfortleitung von S2 am Kreuzungspunkt kommt es zur Ausbildung einer rotierenden Erregungsspirale [110].
Dieser Vorgang ist in Abbildung 9 veranschaulicht. Im ersten Bild ist die Erregungswelle von S1 links im Bild als weißer Streifen erkennbar. Die Erregungsfront von S2 befindet sich bei 185ms als weißer Balken am unteren Bildrand. Die Ausbildung des Rotors beginnt bei 260ms.
Rotoren wurden mittlerweile nicht nur in Tiermodellen dargestellt [111,112], sondern auch in menschlichem Gewebe als wichtiger pathogenetischer Faktor in der Entstehung von Vorhofflimmern und Kammerflimmern erkannt [113]. Es ist jedoch immer noch umstritten, ob ein einzelner Rotor wie in der „mother rotor“ Hypothese [112] ausreicht, um eine fibrillatorische Erregungsausbreitung hervorzurufen, oder ob mehrere Wellen wie in der „multiple wavelet“ Hypothese dafür notwendig sind [114].
Mittlerweile wird davon ausgegangen, dass beide Hypothesen ihre Berechtigung haben und an der Entwicklung von Vorhofflimmern beteiligt sind [102].
Abbildung 8: Schematische Darstellung der „Leading circle Hypothese“ nach Pandit und Jalife (2013) [105]
Abbildung 9: Schematische Darstellung der Entstehung von Rotoren (modifiziert aus [115])
Abbildung 10: Schematische Darstellung eines Rotors (modifiziert aus [105])
Beteiligte Ionenkanäle und therapeutische Ansätze
Die multifaktorielle Entstehung von anfallsartigem und chronischem Vorhofflimmern lässt auf eine unterschiedliche Bedeutung und Beteiligung vieler verschiedener Ionenkanäle schließen, welche noch nicht vollständig aufgeklärt sind.
Bereits nachgewiesen ist ein Anstieg von IK1 bei Patienten mit chronischem Vorhofflimmern, welches zu einer Hyperpolarisation und im Zusammenhang mit der gesteigerten Aktivität von INa zu einer Verkürzung der Aktionspotentialdauer führt [116,117,118]. Dieser Zusammenhang zwischen der Überexpression von IK1 und Vorhofflimmern wurde durch die Entwicklung von transgenen Mäusen mit einer verstärkten Expression von IK1, die in experimentellen Versuchen ein häufigeres und länger bestehendes Vorhofflimmern im Gegensatz zu Wildtyp- Mäusen zeigten, noch weiter belegt [119]. Die Blockade von IK1, beispielsweise mit Chloroquin führt zu einer Terminierung des Vorhofflimmerns [120]. Die Ergebnisse bezüglich des Klasse ǀ- Antiarrhythmikums Flecainid, welches INa hemmt, sind widersprüchlich. Laut Filgueiras-Rama et al. führt Flecainid in zwei von fünf Fällen zu einem Übergang des Vorhofflimmerns in eine Tachykardie der Vorhöfe und nicht zum Beenden des Vorhofflimmerns [120]. Jedoch wird in diesen Versuchen die atriale Fibrillation durch eine vermehrte Dehnung der Vorhöfe provoziert. In anderen Studien führt Flecainid zu einer deutlichen Hemmung des Vorhofflimmerns [121] und wird bei herzgesunden Patienten von der Europäischen Gesellschaft für Kardiologie zur medikamentösen Therapie ausdrücklich empfohlen [122].
Dies zeigt, dass die Blockade verschiedener Ionenkanäle einen wesentlichen Aspekt der medikamentösen Therapie des Vorhofflimmerns darstellt.
Bisher werden überwiegend Natriumkanalblocker wie das auch hier verwendete Flecainid, Kaliumkanalblocker wie Sotalol und Substanzen, die gleichzeitig mehrere verschiedene Ionenkanäle hemmen, wie beispielsweise Amiodaron eingesetzt. Diese sind zwar effektiv hinsichtlich der Behandlung von Vorhofflimmern, wirken sich jedoch auch auf die ventrikuläre Repolarisation aus und können ventrikuläre Herzrhythmusstörungen begünstigen [123]. So sind Substanzen, welche Natrium- kanäle blockieren, im Falle von Koronarerkrankungen und strukturellen Herz- erkrankungen kontrainduziert, da sie die Erregungsleitung erheblich verlangsamen.
Kaliumkanalblocker verlängern die QT-Zeit und fördern so die Entwicklung von TdP und die multifokal wirkenden Substanzen sind assoziiert mit einer toxischen Wirkung an verschiedenen Organsystemen [124].
So gewinnen Substanzen, die spezifisch an atrialen Ionenkanälen wie beispielsweise IKur, IK-ACh oder If wirken, zunehmend an Bedeutung. Auch INa- Blocker, die überwiegend in den Atrien wirken, wie zum Beispiel Ranolazin, stehen im Mittelpunkt der antiarrhythmischen Forschung. So führt Ranolazin zu einer Verlängerung der Aktionspotentialdauer und zu einer Verlängerung der Post-Repolarisations- Refraktärität [125] und könnte somit als ein vorhofspezifisches Klasse ǀ Anti-
arrhythmikum bezeichnet werden. Ranolazin wirkt jedoch nicht nur auf INa, sondern blockiert auch IKr und führt so zu einer Verlängerung der APD90. Die Effektivität Vorhofflimmern zu stoppen, ist mit dieser zweiten Eigenschaft IKr zu blockieren gekoppelt, da alleinige INa Blocker wie Lidocain nicht effektiv wirken [124]. Ähnliche Eigenschaften ließen sich jedoch auch am ventrikulären Myokard nachweisen [126]. Die Gesamtmenge des Ionenstromes IK-ACh kann bei Patienten mit chronischem Vorhofflimmern sowohl erhöht [127] als auch erniedrigt [128] sein. Betrachtet man jedoch nur den IK-ACh, der nicht muskarinerg bzw. vagal aktiviert wird, ist dieser im Falle von chronischem Vorhofflimmern sowohl beim Menschen [129] als auch beim Hund [130] erhöht. Obwohl die selektive Blockade von IK-ACh experimentell zu einer APD- Verlängerung führt und Vorhofflimmern unterdrückt [131], sind derzeit keine selektiven IK-ACh Blocker klinisch verfügbar [124].
Die experimentellen Ergebnisse hinsichtlich IKur sind sehr unterschiedlich. So führt eine Reduktion von IKur an klinisch unauffälligen Vorhöfen lediglich zu einer Verkürzung der frühen Repolarisationsphase aber nicht der späten (APD70 und APD90). Im Gegensatz dazu führt eine Blockierung bei krankhaft veränderten Atrien zu einer Verlängerung der APD70 und APD90 [132]. Viele Medikamente die IKur blockieren wie beispielsweise das neue Antiarrhythmikum Vernakalant, bewirken jedoch eine Verlängerung der Refraktärzeit insbesondere der Post-Repolarisations-Refraktärität, sowohl bei gesunden als auch bei erkrankten Atrien. Die Ursache hierfür liegt darin, dass viele Substanzen wie Vernakalant nicht nur IKur, sondern auch INa und IKr im Vorhof hemmen [133]. Dabei ist die spezifisch atriale Wirkung der Blockierung von IKr
frequenzabhängig. Bei niedrigen Frequenzen besteht eine überwiegend ventrikuläre Wirkung, währenddessen bei höheren Frequenzen die Wirkung zunehmend selektiv die Vorhöfe betrifft [124]. Vernakalant wird auch hier verwendet, um dessen Wirkungsweise mit der von Antazolin vergleichen zu können.
Ein weiterer Ionenkanal, der im Fokus der antiarrhyhtmischen Vorhoftherapie steht, ist der sogenannte funny-channel If. Dieser nicht selektive Ioneneinstrom, der über- wiegend im Sinusknoten, im AV- Knoten und im Myokard der Pulmonalvenen vorkommt [134], spielt eine ebenfalls entscheidende Rolle in der Genese von Vorhofflimmern, welches häufig seinen Ursprung in den Pulmonalvenen hat [135], und mit einer erhöhten Aktivität des If in Verbindung steht [134]. Insbesondere im Falle von Herzinsuffizienz [136] und vermehrtem linksatrialen Füllungsdruck kommt es zu einem verstärkten Ionenstrom If [137] sowie unter starker sympathischer Aktivität über cAMP zur direkten Förderung von If [138].
In dieser Arbeit wird Ivabradin, ein selektiver If-Inhibitor, eingesetzt, um den hemmenden Effekt von Ivabradin auf Vorhofflimmern und dessen Wirkungsweise im Langendorff- perfundierten Kaninchenherzen darzustellen und mit der Wirkung von Antazolin zu vergleichen.
2.3 Antazolin
Abbildung 11: Strukturformel von Antazolin
Antazolin ist ein Antihistaminikum der ersten Generation mit chinidin-ähnlichen anti- arrhythmischen Eigenschaften [139-141] und einer zusätzlichen anticholinergischen Wirkung [142,143].
Dutta stellte erstmals 1948 im tierexperimentellen Modell die antiarrhythmischen Eigenschaften von Antazolin fest [143] und es folgten weitere experimentelle Nach- weise und Patientendaten, die eine Hemmung von verschiedenen Arrhythmieformen durch Antazolin bestätigten [144-147]. So unterdrückt Antazolin sowohl ventrikuläre als auch atriale Extrasystolen und Tachykardien, hemmt Arrhythmien aufgrund von Digitalisintoxikationen und verhindert Kammerflimmern während hypothermischer Phasen [148]. Zu erklären ist dies durch eine Verlängerung des Aktionspotentiales, einer Hemmung der Kontraktilität des Myokardes, einer Verringerung der Leitungs- geschwindigkeit im Atrium und durch eine Erhöhung der atrialen Refraktärzeit, wohin- gegen die atrioventrikuläre Überleitung verbessert wird [142,149].
Die überwiegend mehr als 40 Jahre alten Veröffentlichungen basieren dabei größtenteils auf Erfahrungsdaten und weniger auf fundierten wissenschaftlichen Studien.
Hinsichtlich der antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin in Phasen von Vorhof- flimmern sind die bisherigen Ergebnisse widersprüchlich. So sprachen viele Ergeb- nisse klar gegen eine derartige Wirkungsweise [145], wohingegen andere diese These unterstützten [150-152].
In Polen wird Antazolin-hydrochlorid bereits seit vielen Jahren zur Behandlung von Vorhofflimmern eingesetzt [142,153]. Dabei stellt es insbesondere aufgrund seiner schnellen Wirkungsweise, der kurzen Halbwertszeit von drei Stunden [140,149] und den selten vorkommenden Nebenwirkungen wie Hypotonie, Benommenheit, Übelkeit und Erbrechen [145], ein geeignetes Medikament dar. Durch die zuletzt initiierte
AnPAF Studie [142] sollen nun schließlich die fehlenden klinischen Daten in Form einer randomisierten, doppelblinden Studie mit einer Kontrollgruppe erbracht werden.
Nach dem erfolgreichen Abschluss der AnPAF Studie könnte dies eine Erweiterung der Leitlinien zur Behandlung von Vorhofflimmern bedeuten, da die bisherigen Antiarrhythmika aus der Klasse ǀA,ǀC und ǀǀǀ wie beispielsweise Flecainid und Amio- darone sowie der neuere Wirkstoff Vernakalant, die derzeit eingesetzt werden [154,155], auch zum Teil erhebliche Nachteile mit sich bringen. Diese sind einerseits das ebenfalls häufig bestehende proarrhythmische Potential, die zum Teil geringe Effizienz oder die hohen Kosten wie im Falle von Vernakalant [142].
Im Gegensatz dazu stellt Antazolin ein sehr kostengünstiges, mit wenigen Nebenwirkungen einhergehendes Medikament dar, wenngleich es nicht für Patienten, die an Hypotonie, chronischer Herzinsuffizienz mit einem verringerten Auswurf- volumen oder koronaren Herzerkrankungen leiden, geeignet ist, da Antazolin das Schlag- und Auswurfvolumen reduziert und zu Hypotonien führen kann [152].
Das Ziel dieser Arbeit ist es, die antiarrhythmische ventrikuläre und atriale Wirkungs- weise von Antazolin in experimentellen Untersuchungen auf Organebene aufzuzeigen, da diese grundlegenden Untersuchungen bisher nicht durchgeführt worden sind.
Dadurch wird ein weiterer Grundstein auf dem Weg zum therapeutischen Einsatz von Antazolin zur Behandlung lebensgefährlicher Arrhythmien, sowie zur Reduktion der proarrhythmischen Wirkungen durch andere Medikamente gelegt. Auch wird es in dieser Arbeit möglich, die Wirkung von Antazolin direkt mit anderen antiarrhythmisch wirkenden Substanzen zu vergleichen und Vor- beziehungsweise Nachteile auf- zuzeigen.
3. Material und Methode
3.1 Versuchstiere
Für die Versuchsreihen wurden insgesamt 116 weibliche Kaninchen der Rasse "Weiße Neuseeländer“ verwendet. Die Tiere hatten ein durchschnittliches Gewicht von 3,8 Kilogramm. Weibliche Tiere wurden verwendet, da sich bereits gezeigt hat, dass elektrophysiologische Geschlechtsunterschiede bestehen. So haben Frauen post- pubertär ein längeres QTc-Intervall als Männer [28,156] und eine höhere Wahrschein- lichkeit für das Auftreten von medikamenteninduzierten Torsades de Pointes [157].
Somit konnte mit einem häufigeren Auftreten von Arryhthmien unter der Verwendung von ausschließlich weiblichen Tieren gerrechnet werden.
Die Kaninchen waren in der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung des Univer- sitätsklinikums Münster unter standardisierten Bedingungen untergebracht. Die Tiere befanden sich einzeln in Kunststoffkäfigen, die Raumtemperatur betrug 20°C, die Luftfeuchte 60% und der Tag-Nacht-Zyklus betrug 12h:12h. Wasser und Futter stand ad libitum zur Verfügung. Die Betreuung der Versuchstiere erfolgte durch ausgebildete Pflegekräfte. Diese waren für die Fütterung, Pflege und tägliche Kontrolle der Kaninchen zuständig. Vor den Versuchen wurde eine klinische Allgemeinunter- suchung der Kaninchen durchgeführt, um einen guten Gesundheitszustand bei allen verwendeten Kaninchen zu gewährleisten.
3.2 Präparation des Kaninchenherzens
Den Kaninchen wurde nach der klinischen Untersuchung über die V. auricularis superficialis, die sich am lateralen Ohrrand befindet, ein venöser Zugang mit einem Butterfly gelegt. Darüber erfolgte eine Prämedikation mit 1000IE/kg Heparin (Heparin- Natrium 25000 ratiopharm GmbH, Ulm) um eine Thrombosebildung im Herzen zu ver- hindern. Danach wurden 5ml Thiopental (Thiopental-Natrium 0,5g, Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg) langsam intravenös injiziert, bis eine Erschlaffung der Muskulatur und der Ausfall des Kornealreflexes eintrat. Nachdem so die vollständige, tiefe Narkose festgestellt wurde, durchtrennte man die V. jugularis um das Tier zu entbluten und dadurch den Tod herbei zu führen.
Die Kaninchen wurden dann in Rückenlage fixiert und die Bauchdecke durch eine Hilfsperson auf Spannung gehalten.
So konnte mit einer Geflügelschere der Peritonealraum direkt kaudal des Arcus costae eröffnet werden.
Nun erfolgte die Eröffnung des Brustraumes. Mit einer Metzenbaumschere wurde das Zwerchfell entlang des Rippenbogens abgeschnitten, die Rippen mittels der Geflügelschere senkrecht durchtrennt und der ventrale Anteil des Thorax zurück-
geklappt, sodass man mit freier Sicht auf das Kaninchenherz blicken konnte. Das Perikard wurde eingeschnitten und entfernt und der Aortenbogen aufgesucht. Dieser wurde kranial durchtrennt und das Herz durch einen kraniokaudalen Schnitt entlang der Luftröhre aus der Körperhöhle präpariert.
Das Herz wurde sogleich danach in ein Becherglas mit körperwarmer Nährlösung überführt, um möglichst schnell ein körperähnliches Milieu zu schaffen und das Herz zu entbluten.
Durchschnittlich wurden für die Präparation der Herzen circa 90 Sekunden benötigt.
3.3 Langendorff- Versuch am isolierten Kaninchenherzen
Der Aufbau des Langendorff-Versuches am isolierten Kaninchenherzen ist bereits mehrfach beschrieben worden [4,158,159]. Verwendet wurde hierfür die Langendorff- Apparatur der Firma Hugo Sachs Elektronik (Medical Research Instrumentation, March- Hugstetten, Typ843/1 Size 5). So konnte das Kaninchenherz retrograd über die Aorta ascendens unter kontrolliertem Perfusionsdruck, konstanter Temperatur und Lösung perfundiert werden und eine Messung der monophasischen Aktionspotentiale (MAPs) und die elektrokardiographische Ableitung unter standardisierten Beding- ungen erfolgen.
3.3.1 Versuchsapparatur
Abbildung 12: Schema der Langendorff- Versuchsapparatur
Wärmebad und Perfusionslösung
Die Zusammensetzung der Krebs- Henseleit-Lösung (KHB), die das Herz während des Versuches mit ausreichend Sauerstoff, Elektrolyten und Nährstoffen versorgt, ist in Tabelle 1 beschrieben. Die nötigen Inhaltsstoffe werden mit einer elektrischen Waage (Sartorius BP 210 S, Göttingen) abgewogen und in 10 Liter deionisiertes Wasser gegeben. In einem weiteren Lösungsansatz wird die hypokaliämische Krebs- Henseleit-Lösung hergestellt. Nachdem die Chemikalien gelöst sind, wird die gesamte Lösung noch mit Faltenfiltern (Whatman GE Healthcare, Buckinghamshire UK) gefiltert.
Tabelle 1: Zusammensetzung der verwendeten Krebs-Henseleit-Lösung
Substanz C [mmol/l]
NaCl NaHCO3 Glucose×H2O Na- Pyruvat MgSO4×7 H2O CaCl2×2 H2O KH2PO4
KCl (5,8mmol) KCl (1,5mmol)
118,00 24,88 5,55 2,00 0,83 1,80 1,18 4,70 0,33
Die Perfusionslösung wird durch eine Kreiselpumpe ( Ecoline VC-MS/CA 8-6; Ismatec SA Labortechnik- Analytik, Glattbrugg-Zürich, Schweiz) mit 52ml/min und einem konstanten Perfusionsdruck von 90mmHg durch die Versuchsapparatur befördert, dabei durchläuft das Perfusat einen Wärmeaustauscher, der die Lösung auf 37°C erwärmt. Die Perfusionsgeschwindigkeit wird vor dem Versuch mit einem Messzylinder überprüft.
Um eine Luftembolie im Myokard durch Luftblasen in der Lösung zu verhindern, wird die Nährlösung in eine Glaskammer gepumpt, die als Gasfalle funktioniert und so die eventuellen Luftblasen entfernt.
Das Kaninchenherz wird mit der Aorta an einer Glaskapillare mit chirurgischem Nahtmaterial (Ethicon Vicryl 3,5 Ph.Eur.0, Norderstedt) befestigt und Bindegewebs- reste werden entfernt.
Über diese Glaskanüle läuft die Lösung retrograd durch die Aorta ascendens weiter in die Koronargefäße und versorgt so das Myokard mit allen wichtigen Nährstoffen, Elektrolyten und Sauerstoff. Dieser wird der Lösung in Form von Cabogen 5, einem Gemisch aus 95% Sauerstoff und 5% Kohlenstoffdioxid, bereits im Vorratsbehälter zugesetzt und so die Lösung damit gesättigt. Nachdem die Krebs-Henseleit-Lösung das Myokard durchflossen hat, sammelt sich diese im rechten Ventrikel und wird über die Arteria pulmonalis in das Wärmebad entlassen. Darin eingetaucht befindet sich das Herz. Das doppelwandige Wärmebad wird ebenfalls auf 37°C erwärmt und die Temperatur vor und während des Versuches mittels eines digitalen Thermometers überprüft. Das Wärmebad beinhaltet einen Ablauf, über den die verbrauchte Lösung ablaufen kann.
Abbildung 13: An der Langendorff- Apparatur befestigtes, isoliertes und retrograd perfundiertes Kaninchenherz
Über Perfusoren (Perfusor® Secura, Braun Melsungen AG) können der Krebs- Henseleit-Lösung schon zu Beginn Medikamente zugesetzt werden, die dann mit der Nährlösung das Herz durchfließen. Dies wird über Dreiwegehähne gesteuert. Ebenso kann die normale Krebs-Henseleit-Lösung durch eine hypokaliämische Lösung ersetzt werden, um Arrhythmien zu induzieren.
Elektrokardiogramm
Während des gesamten Versuches erfolgte eine elektrokardiographische Ableitung mittels einer dafür entwickelten Elektrodenplattform der Firma Hugo Sachs. Diese beinhaltet eine Vielpol-EKG-Ableitung aus Silber/Silberchlorid, welche die Extremitätenableitung nach Einthoven und Goldberger sowie sechs Brustwand- ableitungen am isolierten Kaninchenherzen simuliert. Die Elektroden sind über ein Kugellager mit der Plattform verbunden, welche so im Wasserbad positioniert werden, dass sich die Elektroden mit den Gummihalterungen dicht um das Herz befinden, ohne dieses direkt zu berühren. Es werden also lediglich die elektrischen Ströme in der Krebs-Henseleit-Lösung gemessen. Die Signale werden über einen Standard- verstärker mit einem 0,1-300 Hz- Filter verstärkt und über eine elektrophysiologische Anlage der Firma Bard (Lab System Pro EP Recording System Version 2.4.47.0 C.R.
Bard, Inc. 1986-1996, Salt Lake City, USA) aufgezeichnet.
Ableitung der monophasischen Aktionspotentiale
Abbildung 14: Ableitungsstellen der monophasischen Aktionspotentiale
Die Ableitung der monophasischen Aktionspotentiale (MAPs) erfolgte standardisiert mittels vier epikardialen Ableitungskathetern (EP Technologies, Mountain View, CA, USA) auf der linken Herzseite sowie weiteren drei Kathetern auf der rechten Herzseite (Abbildung 14). Diese wurden senkrecht auf dem Myokard platziert und deren Position nur geringfügig zur Optimierung der Signale verändert. Nur selten musste deren Stellung aufgrund lokaler Myokardischämien großzügiger verändert werden. Die Katheter waren mit Metallröhrchen stabilisiert und über einen Federmechanismus mit der Langendorff-Anlage verbunden, so konnten sie mit konstantem Druck den Herzbewegungen folgen [160,161].
Ein weiterer beweglicher Ableitungskatheter wurde über den linken Vorhof vorsichtig über die Mitralklappe in die linke Hauptkammer bis zur Herzspitze vorgeführt und leitete somit endokardiale Signale ab. Folglich konnten so die Depolarisation und Repolarisation sowie die regionalen Unterschiede der Monophasischen Aktionspotentiale abgeleitet und ausgewertet werden. Dafür wurden die Signale verstärkt und gefiltert (0,1-300 Hz) und mit Hilfe der Bard-Anlage mit einer Rate von 1kHz und einer 12 bit-Auflösung gespeichert. Die Stimulation (Universal Heart Stimulator UHS 20S, Biotronik Berlin) des Myokards erfolgte über den epikardialen Katheter, der sich mittig auf dem rechten Ventrikel befand (MAP2).
Die Erfassung der monophasischen Aktionspotentiale wird bereits vielfach zur Erfassung von Veränderungen der Repolarisation am Herzen, sowohl in vitro [160,162,163], als auch in vivo in Tiermodellen [164] und beim Menschen [165]
verwendet.
Intraventrikuläre Druckmessung
Um kontinuierlich den linksventrikulären Druck zu messen, wurde ein an einer Glaskanüle befestigter Latexballon vorsichtig über ein kleines Loch im linken Atrium in den linken Ventrikel gebracht und mit destilliertem Wasser gefüllt. Die Glaskanüle wurde mit Klebestreifen an der Langendorff- Apparatur befestigt, sodass das Herz dadurch zusätzlich im Wasserbad stabilisiert wurde. Der Latexballon befand sich in einem geschlossenen System mit einem integrierten Druckaufnehmer, welcher vor dem Versuch geeicht wurde.
3.3.2 Versuchsprotokoll der ventrikulären Versuchsreihen
Abbildung 15: Schema zum zeitlichen Ablauf der Ventrikelversuche
AV- Block und Stimulation
Um das Herz in bestimmten Frequenzen stimulieren zu können, musste die Überleitung über den AV-Knoten geblockt werden und ein junktionaler Ersatzrhythmus eintreten. Dafür wurde ein weiteres kleines Loch in das rechte Atrium geschnitten, um mit einer chirurgischen Pinzette das Septum in der Gegend des AV-Knotens, der sich in der Ventilebene des Herzens befindet, zu komprimieren. Dies erfolgte unter EKG Kontrolle, bis die Zykluslänge konstant auch ohne Kompression mehr als 900ms betrug.
Frequenztreppe
Das Kaninchenherz wurde nun für jeweils eine Minute mit sieben verschiedenen Frequenzen und einer Impulslänge von 2ms stimuliert. Begonnen wurde mit 900ms, dann wurde die Frequenz in Schritten von 100ms reduziert, bis zu einer Zykluslänge von 300ms. Da das Kaninchenmyokard sich erst an die einzelnen Frequenzstufen anpassen musste, wurden lediglich die Signale der letzten 10s der aufgezeichneten Minute markiert und für die folgende Auswertung verwendet. Danach schlug das Herz wieder in seinem eigenen Ersatzrhythmus ohne Stimulation.
Refraktärzeitbestimmung
Die effektive Refraktärzeit wurde ebenfalls auf allen sieben Frequenzstufen bestimmt, indem nach jedem fünften Impuls (S1) in der vorgegebenen Zykluslänge ein weiterer
Impuls (S2) kurz danach erfolgte. Die Stimulation für diesen Impuls wurde in Schritten von 10ms immer näher an den vorangegangen gesetzt, bis das Kammermyokard dem Impuls nicht mehr mit einer Erregung folgte. Dann befand sich das Herz in der Refraktärzeit, welche für jede stimulierte Herzfrequenz notiert wurde.
Wenn Kammerflimmern während der Refraktärzeitbestimmung auftrat, wurde nach der notwendigen Defibrillation die Stimulation für fünf Minuten pausiert, um dem Herz eine Erholungszeit zu gewähren.
Hochfrequenz- Stimulation
Nach der Bestimmung der Refraktärzeiten erfolgte für fünf Sekunden eine Stimulation mit 1000 Impulsen pro Minute. Danach wurde eine Minute zur Regeneration abgewartet und dieser Vorgang noch zweimal wiederholt. Diese Vorgehensweise erhöhte die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Flimmerepisoden. Trat Kammerflimmern nach einem "Burst“ auf, so wurde die Regenerationszeit nach der Defibrillation, auf fünf Minuten verlängert.
Hypokaliämische Phase und Registrierung der Herzrhythmus- störungen
Für fünf Minuten wurde die bisherige KHB- Lösung mit 5,8mM K+ über einen Dreiwegehahn durch die hypokaliämische KHB- Lösung mit 1,5mM K+ ersetzt.
Dadurch kam es vermehrt zum Auftreten von frühen Nachdepolarisationen (EADs) und Herzrhythmusstörungen, wie beispielsweise Torsades de Pointes [166]. Diese wurden qualitativ und quantitativ erfasst. Dabei wurden Nachdepolarisationen, welche die Repolarisation der vorhergehenden Erregung durchbrechen, als EADs verzeichnet [167] und polymorphe Kammertachykardien mit mehr als fünf Schlägen, die um die Nullinie rotieren und selbstlimitierend sind, als Torsades de Pointes [168,169].
Darüber hinaus wurden Episoden mit Kammerflimmern verzeichnet. Wenn dieses nicht selbstterminierend war, wurde es mit Hilfe eines Defibrillators (Cardial Pacemaker Inc. VENTAK ECD Cpi Model 2815; St. Paul, USA) gestoppt. Danach wurde dem Herz wieder eine fünfminütige Regenerationszeit gewährt.
Nach der Phase mit der kaliumarmen KHB-Lösung wurde der Dreiwegehahn wieder umgelegt und für fünf Minuten wieder normale Nährlösung eingeleitet, ohne dass eine weitere Stimulation des Herzens erfolgte.
Dosis- Wirkungsversuche mit Antazolin
Nachdem das Versuchsprotokoll zunächst unter Ausgangsbedingungen erfolgte, wurde nun dieses mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen von Antazolin wiederholt.
Dafür musste zunächst je eine Lösung mit 10μM, 20μM und 30µM Antazolin - hydrochloride (Antazoline hydrochloride SIGMA- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) hergestellt werden. Das Antazolin wurde zunächst aufgrund der schlechten Löslichkeit in Dimethylsulfoxid gelöst und dann mit deionisiertem Wasser weiter verdünnt, bis die gewünschten Konzentrationen erreicht wurden. Über einen seitlichen Zugang wurde schließlich das Antazolin in das Perfusat geleitet und nach einer Einlaufzeit von 15 Minuten das Versuchsprotokoll erneut durchgeführt. Diese Vorgehensweise wiederholte sich für alle Konzentrationsstufen.
Ziel dieser ersten Vorversuche war es, eine geeignete Antazolinkonzentration für die weiteren Kombinationsversuche zu finden. Insbesondere sollte die gewählte Konzentrationsstufe zu deutlichen Veränderungen der Aktionspotentiallänge, Ref- raktärzeiten und QT-Länge führen, bei einer stabilen weiteren Herzkontraktion über den gesamten Versuchsablauf.
Provokationsversuche zur Simulation des LQT2
Es wurde jeweils eine Versuchsreihe mit Sotalol und eine mit Erythromycin durchgeführt um das LQT2, durch eine Blockade von IKr, zu simulieren und eine antiarrhythmische Wirkung für Antazolin nachzuweisen. Dabei wird durch eine Verlängerung der Repolarisation und einer Verringerung der Repolarisationsreserve ein häufigeres Auftreten von Arrhythmien wie Torsades de Pointes oder EADs provoziert. Dafür wurde eine 100 micromolare Sotalollösung (Sotalolhydrochlorid Carinopharm GmbH, Elze) beziehungsweise eine 300 micromolare Erythromycin- lösung (Erythromycinlactobionat Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg) hergestellt.
Nach der Durchführung des Versuchsprotokolles unter Ausgangsbedingungen wurde entweder die Sotalollösung oder die Erythromycinlösung über einen seitlichen Zugang dem Perfusat zugegeben. Die Einlaufzeit betrug 15 Minuten, danach wurde das Versuchsprotokoll erneut wiederholt. Durch die fünfminütige hypokaliämische Phase wurde die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Arrhythmien wie Torsades de Pointes oder EADs noch weiter gesteigert [170].
Schließlich wurde eine 20 micromolare Antazolinlösung zusätzlich zu Sotalol beziehungsweise Erythromycin infundiert. Die Einlaufzeit betrug auch hier erneut 15 Minuten und das Versuchsprotokoll wurde ein drittes Mal durchgeführt.
Provokationsversuche zur Simulation des LQT3
Es wurde eine 0,5 micromolare Veratridinlösung (SIGMA- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) hergestellt, indem das Veratridin zunächst in Dimethylsulfoxid gelöst und schließlich mit deionisiertem Wasser auf die passende Konzentration weiter verdünnt wurde. Der Versuchsablauf bestand auch bei diesen Versuchen aus drei Teilen.
Zunächst wurde das Versuchsprotokoll unter Ausgangsbedingungen durchgeführt.
Danach erfolgte eine 15-minütige Einlaufzeit der Veratridinlösung, um durch eine Blockierung der Hemmung des Ionenstromes INa, das LQT3 zu simulieren [81] und Arrhythmien zu provozieren. Schließlich wurde zusätzlich zur Veratridinlösung eine 20 micromolare Antazolinlösung infundiert und nach einer Einlaufzeit von 15 Minuten auch hier das Versuchsprotokoll durchgeführt. So konnte die Wirkung von Antazolin im Zusammenhang mit dem LQT3 festgestellt werden.
3.4. Auswertung
Bestimmung der Repolarisationszeiten
Aus den letzten 10 Sekunden der Aufnahmezeiten wurden jeweils für eine Frequenz- stufe 16 MAP Signale ausgeschnitten und in das Programm Rabbit Pulse V7,2 (Patrick Schwienteck, Universtität Bielefeld) übertragen. Das Programm erkennt in der Regel die einzelnen MAP Signale, diese Erkennung von Anfang und Ende der Aktions- potentiale wurde überprüft und gegebenenfalls korrigiert.
Wenn die Signale die nötigen Anforderungen erfüllten, indem sich die Amplitude und die Aktionspotentialdauer nicht mehr als 20% unterschieden und die Nullinie stabil war, wurde vom Programm die APD90 und die APD50 bestimmt. Dabei handelt es sich, wie in Abbildung 16 dargestellt, um die Zeit, die von der maximalen Depolarisation bis zur 50-prozentigen bzw. 90-prozentigen Repolarisation vergeht. Die Werte wurden in Exceltabellen konvertiert und die Mittelwerte bestimmt.
Außerdem wurden ebenfalls die Zeiten für die maximalen und minimalen MAPs und die dazugehörigen Standardabweichungen bestimmt, um ein Maß für die Dispersion der Repolarisation zu haben.
Abbildung 16: Schematische Darstellung der Messung von APD50 und APD90
Messung der QT- Zeiten
Die Messung der QT- Zeiten erfolgte manuell an der Anlage. Die Werte wurden dann in Exceltabellen übertragen und die Mittelwerte bestimmt.
3.5. Statistik
Die gewonnen Daten wurden zunächst in einem Datenprogramm (Microsoft Excel) zusammengefasst und mit dem statistischen Auswertungsprogramm SSPS 22.0 für Windows ausgewertet. Es wurde der Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung durchgeführt. Die Testung auf Signifikanz der nicht- parametrischen Variablen wie die Aktionspotentialdauer, die Dispersion der Repolarisation und die QT-Dauer wurden mittels des Wilcoxon-Testes durchgeführt. Das Auftreten von frühen Nachdepolari- sationen und Torsade de Pointes wurden mit dem Fisher-Test und dem Chi-Quadrat- Test analysiert und mit deskriptiven Statistiken übersichtlich dargestellt. Ein Wert von p< 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
3.6. Vorhofversuche
Die Grundlagen zu den Versuchstieren, zur Präparation und der Langendorff- Apparatur unterscheiden sich kaum von den Ventrikelversuchen (siehe Kapitel 3.1- 3.3), sodass im Folgenden nur auf die Unterschiede eingegangen wird.
3.6.1. Versuchsaufbau
Während für die Ventrikelversuche insgesamt sieben epikardiale und ein endokardialer Ableitungskatheter verwendet wurden, befand sich während der Vorhofversuche lediglich jeweils ein bipolarer Kontaktelektroden-Katheter epikardial mittig auf der rechten und linken Ventrikelseite, um die Ventrikelerregung kontinuierlich überprüfen zu können.
Darüber hinaus befand sich jedoch eine Ableitungsklemme mit zwei Ableitungs- elektroden auf dem rechten und eine auf dem linken Vorhof. Damit konnten vier atriale MAP-Ableitungen aufgezeichnet werden. Ein weiterer flexibler Katheter, der sich während der Ventrikelversuche endokardial befand, wurde lediglich auf den linken Vorhof aufgesetzt und als Stimulationskatheter verwendet.
Es erfolgten wie bei den Ventrikelversuchen lediglich feine Justierungen der Elek- troden zur Signaloptimierung und nur größere Neupositionierungen bei auftretender Myokardschädigung.
Abbildung 17: Katheterplatzierung Vorhofversuche
Abbildung 18: Kaninchenherz an der Langendorff-Anlage nach der Katheterplatzierung
