Versuchsapparatur

Abbildung 12: Schema der Langendorff- Versuchsapparatur

Wärmebad und Perfusionslösung

Die Zusammensetzung der Krebs- Henseleit-Lösung (KHB), die das Herz während des Versuches mit ausreichend Sauerstoff, Elektrolyten und Nährstoffen versorgt, ist in Tabelle 1 beschrieben. Die nötigen Inhaltsstoffe werden mit einer elektrischen Waage (Sartorius BP 210 S, Göttingen) abgewogen und in 10 Liter deionisiertes Wasser gegeben. In einem weiteren Lösungsansatz wird die hypokaliämische Krebs- Henseleit-Lösung hergestellt. Nachdem die Chemikalien gelöst sind, wird die gesamte Lösung noch mit Faltenfiltern (Whatman GE Healthcare, Buckinghamshire UK) gefiltert.

Tabelle 1: Zusammensetzung der verwendeten Krebs-Henseleit-Lösung

Substanz C [mmol/l]

Die Perfusionslösung wird durch eine Kreiselpumpe ( Ecoline VC-MS/CA 8-6; Ismatec SA Labortechnik- Analytik, Glattbrugg-Zürich, Schweiz) mit 52ml/min und einem konstanten Perfusionsdruck von 90mmHg durch die Versuchsapparatur befördert, dabei durchläuft das Perfusat einen Wärmeaustauscher, der die Lösung auf 37°C erwärmt. Die Perfusionsgeschwindigkeit wird vor dem Versuch mit einem Messzylinder überprüft.

Um eine Luftembolie im Myokard durch Luftblasen in der Lösung zu verhindern, wird die Nährlösung in eine Glaskammer gepumpt, die als Gasfalle funktioniert und so die eventuellen Luftblasen entfernt.

Das Kaninchenherz wird mit der Aorta an einer Glaskapillare mit chirurgischem Nahtmaterial (Ethicon Vicryl 3,5 Ph.Eur.0, Norderstedt) befestigt und Bindegewebs-reste werden entfernt.

Über diese Glaskanüle läuft die Lösung retrograd durch die Aorta ascendens weiter in die Koronargefäße und versorgt so das Myokard mit allen wichtigen Nährstoffen, Elektrolyten und Sauerstoff. Dieser wird der Lösung in Form von Cabogen 5, einem Gemisch aus 95% Sauerstoff und 5% Kohlenstoffdioxid, bereits im Vorratsbehälter zugesetzt und so die Lösung damit gesättigt. Nachdem die Krebs-Henseleit-Lösung das Myokard durchflossen hat, sammelt sich diese im rechten Ventrikel und wird über die Arteria pulmonalis in das Wärmebad entlassen. Darin eingetaucht befindet sich das Herz. Das doppelwandige Wärmebad wird ebenfalls auf 37°C erwärmt und die Temperatur vor und während des Versuches mittels eines digitalen Thermometers überprüft. Das Wärmebad beinhaltet einen Ablauf, über den die verbrauchte Lösung ablaufen kann.

Abbildung 13: An der Langendorff- Apparatur befestigtes, isoliertes und retrograd perfundiertes Kaninchenherz

Über Perfusoren (Perfusor® Secura, Braun Melsungen AG) können der Krebs-Henseleit-Lösung schon zu Beginn Medikamente zugesetzt werden, die dann mit der Nährlösung das Herz durchfließen. Dies wird über Dreiwegehähne gesteuert. Ebenso kann die normale Krebs-Henseleit-Lösung durch eine hypokaliämische Lösung ersetzt werden, um Arrhythmien zu induzieren.

Elektrokardiogramm

Während des gesamten Versuches erfolgte eine elektrokardiographische Ableitung mittels einer dafür entwickelten Elektrodenplattform der Firma Hugo Sachs. Diese beinhaltet eine Vielpol-EKG-Ableitung aus Silber/Silberchlorid, welche die Extremitätenableitung nach Einthoven und Goldberger sowie sechs Brustwand-ableitungen am isolierten Kaninchenherzen simuliert. Die Elektroden sind über ein Kugellager mit der Plattform verbunden, welche so im Wasserbad positioniert werden, dass sich die Elektroden mit den Gummihalterungen dicht um das Herz befinden, ohne dieses direkt zu berühren. Es werden also lediglich die elektrischen Ströme in der Krebs-Henseleit-Lösung gemessen. Die Signale werden über einen Standard-verstärker mit einem 0,1-300 Hz- Filter verstärkt und über eine elektrophysiologische Anlage der Firma Bard (Lab System Pro EP Recording System Version 2.4.47.0 C.R.

Bard, Inc. 1986-1996, Salt Lake City, USA) aufgezeichnet.

Ableitung der monophasischen Aktionspotentiale

Abbildung 14: Ableitungsstellen der monophasischen Aktionspotentiale

Die Ableitung der monophasischen Aktionspotentiale (MAPs) erfolgte standardisiert mittels vier epikardialen Ableitungskathetern (EP Technologies, Mountain View, CA, USA) auf der linken Herzseite sowie weiteren drei Kathetern auf der rechten Herzseite (Abbildung 14). Diese wurden senkrecht auf dem Myokard platziert und deren Position nur geringfügig zur Optimierung der Signale verändert. Nur selten musste deren Stellung aufgrund lokaler Myokardischämien großzügiger verändert werden. Die Katheter waren mit Metallröhrchen stabilisiert und über einen Federmechanismus mit der Langendorff-Anlage verbunden, so konnten sie mit konstantem Druck den Herzbewegungen folgen [160,161].

Ein weiterer beweglicher Ableitungskatheter wurde über den linken Vorhof vorsichtig über die Mitralklappe in die linke Hauptkammer bis zur Herzspitze vorgeführt und leitete somit endokardiale Signale ab. Folglich konnten so die Depolarisation und Repolarisation sowie die regionalen Unterschiede der Monophasischen Aktionspotentiale abgeleitet und ausgewertet werden. Dafür wurden die Signale verstärkt und gefiltert (0,1-300 Hz) und mit Hilfe der Bard-Anlage mit einer Rate von 1kHz und einer 12 bit-Auflösung gespeichert. Die Stimulation (Universal Heart Stimulator UHS 20S, Biotronik Berlin) des Myokards erfolgte über den epikardialen Katheter, der sich mittig auf dem rechten Ventrikel befand (MAP2).

Die Erfassung der monophasischen Aktionspotentiale wird bereits vielfach zur Erfassung von Veränderungen der Repolarisation am Herzen, sowohl in vitro [160,162,163], als auch in vivo in Tiermodellen [164] und beim Menschen [165]

verwendet.

Intraventrikuläre Druckmessung

Um kontinuierlich den linksventrikulären Druck zu messen, wurde ein an einer Glaskanüle befestigter Latexballon vorsichtig über ein kleines Loch im linken Atrium in den linken Ventrikel gebracht und mit destilliertem Wasser gefüllt. Die Glaskanüle wurde mit Klebestreifen an der Langendorff- Apparatur befestigt, sodass das Herz dadurch zusätzlich im Wasserbad stabilisiert wurde. Der Latexballon befand sich in einem geschlossenen System mit einem integrierten Druckaufnehmer, welcher vor dem Versuch geeicht wurde.

3.3.2 Versuchsprotokoll der ventrikulären Versuchsreihen

Abbildung 15: Schema zum zeitlichen Ablauf der Ventrikelversuche

AV- Block und Stimulation

Um das Herz in bestimmten Frequenzen stimulieren zu können, musste die Überleitung über den AV-Knoten geblockt werden und ein junktionaler Ersatzrhythmus eintreten. Dafür wurde ein weiteres kleines Loch in das rechte Atrium geschnitten, um mit einer chirurgischen Pinzette das Septum in der Gegend des AV-Knotens, der sich in der Ventilebene des Herzens befindet, zu komprimieren. Dies erfolgte unter EKG Kontrolle, bis die Zykluslänge konstant auch ohne Kompression mehr als 900ms betrug.

Frequenztreppe

Das Kaninchenherz wurde nun für jeweils eine Minute mit sieben verschiedenen Frequenzen und einer Impulslänge von 2ms stimuliert. Begonnen wurde mit 900ms, dann wurde die Frequenz in Schritten von 100ms reduziert, bis zu einer Zykluslänge von 300ms. Da das Kaninchenmyokard sich erst an die einzelnen Frequenzstufen anpassen musste, wurden lediglich die Signale der letzten 10s der aufgezeichneten Minute markiert und für die folgende Auswertung verwendet. Danach schlug das Herz wieder in seinem eigenen Ersatzrhythmus ohne Stimulation.

Refraktärzeitbestimmung

Die effektive Refraktärzeit wurde ebenfalls auf allen sieben Frequenzstufen bestimmt, indem nach jedem fünften Impuls (S1) in der vorgegebenen Zykluslänge ein weiterer

Impuls (S2) kurz danach erfolgte. Die Stimulation für diesen Impuls wurde in Schritten von 10ms immer näher an den vorangegangen gesetzt, bis das Kammermyokard dem Impuls nicht mehr mit einer Erregung folgte. Dann befand sich das Herz in der Refraktärzeit, welche für jede stimulierte Herzfrequenz notiert wurde.

Wenn Kammerflimmern während der Refraktärzeitbestimmung auftrat, wurde nach der notwendigen Defibrillation die Stimulation für fünf Minuten pausiert, um dem Herz eine Erholungszeit zu gewähren.

Hochfrequenz- Stimulation

Nach der Bestimmung der Refraktärzeiten erfolgte für fünf Sekunden eine Stimulation mit 1000 Impulsen pro Minute. Danach wurde eine Minute zur Regeneration abgewartet und dieser Vorgang noch zweimal wiederholt. Diese Vorgehensweise erhöhte die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Flimmerepisoden. Trat Kammerflimmern nach einem "Burst“ auf, so wurde die Regenerationszeit nach der Defibrillation, auf fünf Minuten verlängert.

Hypokaliämische Phase und Registrierung der Herzrhythmus-störungen

Für fünf Minuten wurde die bisherige KHB- Lösung mit 5,8mM K⁺ über einen Dreiwegehahn durch die hypokaliämische KHB- Lösung mit 1,5mM K⁺ ersetzt.

Dadurch kam es vermehrt zum Auftreten von frühen Nachdepolarisationen (EADs) und Herzrhythmusstörungen, wie beispielsweise Torsades de Pointes [166]. Diese wurden qualitativ und quantitativ erfasst. Dabei wurden Nachdepolarisationen, welche die Repolarisation der vorhergehenden Erregung durchbrechen, als EADs verzeichnet [167] und polymorphe Kammertachykardien mit mehr als fünf Schlägen, die um die Nullinie rotieren und selbstlimitierend sind, als Torsades de Pointes [168,169].

Darüber hinaus wurden Episoden mit Kammerflimmern verzeichnet. Wenn dieses nicht selbstterminierend war, wurde es mit Hilfe eines Defibrillators (Cardial Pacemaker Inc. VENTAK ECD Cpi Model 2815; St. Paul, USA) gestoppt. Danach wurde dem Herz wieder eine fünfminütige Regenerationszeit gewährt.

Nach der Phase mit der kaliumarmen KHB-Lösung wurde der Dreiwegehahn wieder umgelegt und für fünf Minuten wieder normale Nährlösung eingeleitet, ohne dass eine weitere Stimulation des Herzens erfolgte.

Dosis- Wirkungsversuche mit Antazolin

Nachdem das Versuchsprotokoll zunächst unter Ausgangsbedingungen erfolgte, wurde nun dieses mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen von Antazolin wiederholt.

Dafür musste zunächst je eine Lösung mit 10μM, 20μM und 30µM Antazolin -hydrochloride (Antazoline -hydrochloride SIGMA- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) hergestellt werden. Das Antazolin wurde zunächst aufgrund der schlechten Löslichkeit in Dimethylsulfoxid gelöst und dann mit deionisiertem Wasser weiter verdünnt, bis die gewünschten Konzentrationen erreicht wurden. Über einen seitlichen Zugang wurde schließlich das Antazolin in das Perfusat geleitet und nach einer Einlaufzeit von 15 Minuten das Versuchsprotokoll erneut durchgeführt. Diese Vorgehensweise wiederholte sich für alle Konzentrationsstufen.

Ziel dieser ersten Vorversuche war es, eine geeignete Antazolinkonzentration für die weiteren Kombinationsversuche zu finden. Insbesondere sollte die gewählte Konzentrationsstufe zu deutlichen Veränderungen der Aktionspotentiallänge, Ref-raktärzeiten und QT-Länge führen, bei einer stabilen weiteren Herzkontraktion über den gesamten Versuchsablauf.

Provokationsversuche zur Simulation des LQT2

Es wurde jeweils eine Versuchsreihe mit Sotalol und eine mit Erythromycin durchgeführt um das LQT2, durch eine Blockade von IKr, zu simulieren und eine antiarrhythmische Wirkung für Antazolin nachzuweisen. Dabei wird durch eine Verlängerung der Repolarisation und einer Verringerung der Repolarisationsreserve ein häufigeres Auftreten von Arrhythmien wie Torsades de Pointes oder EADs provoziert. Dafür wurde eine 100 micromolare Sotalollösung (Sotalolhydrochlorid Carinopharm GmbH, Elze) beziehungsweise eine 300 micromolare Erythromycin-lösung (Erythromycinlactobionat Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg) hergestellt.

Nach der Durchführung des Versuchsprotokolles unter Ausgangsbedingungen wurde entweder die Sotalollösung oder die Erythromycinlösung über einen seitlichen Zugang dem Perfusat zugegeben. Die Einlaufzeit betrug 15 Minuten, danach wurde das Versuchsprotokoll erneut wiederholt. Durch die fünfminütige hypokaliämische Phase wurde die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Arrhythmien wie Torsades de Pointes oder EADs noch weiter gesteigert [170].

Schließlich wurde eine 20 micromolare Antazolinlösung zusätzlich zu Sotalol beziehungsweise Erythromycin infundiert. Die Einlaufzeit betrug auch hier erneut 15 Minuten und das Versuchsprotokoll wurde ein drittes Mal durchgeführt.

Provokationsversuche zur Simulation des LQT3

Es wurde eine 0,5 micromolare Veratridinlösung (SIGMA- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) hergestellt, indem das Veratridin zunächst in Dimethylsulfoxid gelöst und schließlich mit deionisiertem Wasser auf die passende Konzentration weiter verdünnt wurde. Der Versuchsablauf bestand auch bei diesen Versuchen aus drei Teilen.

Zunächst wurde das Versuchsprotokoll unter Ausgangsbedingungen durchgeführt.

Danach erfolgte eine 15-minütige Einlaufzeit der Veratridinlösung, um durch eine Blockierung der Hemmung des Ionenstromes INa, das LQT3 zu simulieren [81] und Arrhythmien zu provozieren. Schließlich wurde zusätzlich zur Veratridinlösung eine 20 micromolare Antazolinlösung infundiert und nach einer Einlaufzeit von 15 Minuten auch hier das Versuchsprotokoll durchgeführt. So konnte die Wirkung von Antazolin im Zusammenhang mit dem LQT3 festgestellt werden.