Aus dem Institut für Pharmakologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Charakterisierung von Calnexin,
Myomegalin und AKAP9 als potentielle Bindungspartner der zyklischen Nukleotide
cCMP und cUMP
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Theresa Koenig
aus Hannover
Hannover 2018
am 13.03.2020
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Roland Seifert
1. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Andreas Pich
2. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Evgeni Ponimaskin
Tag der mündlichen Prüfung: 13.03.2020
Prüfungsausschussmitglieder:
Vorsitz: Prof. Dr. rer. nat. Harald Genth
1. Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Ralf Lichtinghagen
2. Prüfer: Prof. Dr. med. Stefan Engeli
i
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
Zyklische Purinnukleotide: zyklisches Adenosin-3′,5′-monophosphat (cAMP) und zyklisches Guanosin-3′,5′-monophosphat (cGMP) ... 1
Zyklische Pyrimidinnukleotide: zyklisches Cytidin-3′,5′-monophosphat (cCMP) und zyklisches Uridin-3′,5′-monophosphat (cUMP) ... 6
Zyklisches Cytidin-3′,5′-monophosphat (cCMP) ... 6
Zyklisches Uridin-3′,5′-monophosphat (cUMP)... 9
Identifizierung potentieller Targetmoleküle ...11
Calnexin ...11
Myomegalin ...12
AKAP9 ...14
Ziel der Arbeit ...15
2. Material und Methoden ...17
Material ...17
Chemikalien und Verbrauchsmaterialien ...17
Geräteliste ...17
Medien, Lösungen und Puffer ...19
Zelllinien ...21
Plasmide ...22
Agarosen ...22
Biotin-cNMPs ...24
Antikörper ...24
Proteinstandard ...26
Zusammensetzung der SDS-Gele für Western Blots ...27
Computersoftware ...27
Methoden ...28
Transformation von getaggter cDNA in Top10 E. coli Bakterien ...28
Isolation der cDNA aus E. coli ...28
Kultivierung von HEK293- und HeLa-Zellen ...29
ii
Bestimmung der Zellzahl ...29
Transiente Transfektion von HEK293- und HeLa-Zellen ...30
Herstellung von Zelllysaten ...31
Proteinbestimmung mittels BCA-Reagenz ...31
Probengenerierung und Durchführung von SDS-Gelelektrophorese und Western Blot ...32
Affinitätschromatographie mit Agarosen ...33
Affinitätschromatographie mit 4-[Biotin]-AH-cCMP & 5-[Biotin]-AA-cUMP ...35
RNA-Isolation ...36
Reverse Transkription...36
Quantitative Real Time-Polymerasekettenreaktion ...37
3. Ergebnisse ...38
Proteinüberexpression im Western Blot ...38
Affinitätschromatographie mit Agarosen ...44
Affinitätschromatographie mit Biotin-cNMPs ...56
Quantitative Real Time-Polymerasekettenreaktion ...60
4. Diskussion ...62
5. Ausblick ...70
6. Zusammenfassung ...72
7. Literaturverzeichnis ...73
8. Abkürzungsverzeichnis ...81
9. Abbildungsverzeichnis ...84
10. Anhang ...87
Lebenslauf ...87
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 7 und 8 PromO ...88
Publikationsverzeichnis ...89
Danksagung ...90
1
1. Einleitung
Zyklische Purinnukleotide: zyklisches Adenosin-3′,5′-monophosphat (cAMP) und zyklisches Guanosin-3′,5′-monophosphat (cGMP)
Die zyklischen Purinnukleotide zyklisches Adenosin-3′,5′-monophosphat (cAMP) und zyklisches Guanosin-3′,5′-monophosphat (cGMP) sind seit über 50 Jahren ein wichtiger Bestandteil der Forschung (1). Sie bilden die Gruppe der kanonischen „second messenger“, da sie die folgenden Kriterien erfüllen, die eine Klassifikation als „second messenger“ bedingen (2):
• In Folge einer Stimulation einer Zelle durch einen „first messenger“ steigt die Konzentration des „second messengers“ durch Aktivierung eines erzeugenden Enzyms oder durch die Aktivierung von Ionenkanälen an.
• „Second messenger“ bewirken eine Aktivierung spezifischer Effektorsysteme.
• Definierte Zellfunktionen werden daraufhin aktiviert.
• Beendet beziehungsweise limitiert wird die Stimulation der Signalkaskaden durch enzymatischen Abbau des „second messengers“ oder durch Ausschleusung aus der Zelle oder Einschleusen in Zellkompartimente.
• Zellpermeable Analoga der entsprechenden „second messenger“ bewirken den gleichen Effekt.
• Bakterien machen sich die „second messenger“-Signalwege zu Nutze, um einen Überlebensvorteil zu etablieren, indem sie über ihre Toxine die Wirkung eines „second messengers“ nachahmen.
„Second messenger“ sind von bedeutender biologischer Relevanz, da sie hoch konserviert und so in jeder Zelle vorhanden sind (3). Anhand der spezifischen Zielproteine eines „second messengers“ ist eine Beteiligung an einer Vielzahl physiologischer Funktionen nachvollziehbar.
cAMP ist der bekannteste und am besten erforschte „second messenger“. Einen Überblick über den cAMP-Signalweg bietet Abbildung 1. cAMP wird von Adenylylzyklasen gebildet, die in eine lösliche Adenylylzyklase (sAC) und neun verschiedene membranständige Adenylylzyklasen (mAC 1 bis 9) unterteilt werden. Die membranständigen Adenylylzyklasen werden durch die Gsα-Untereinheit eines G-Protein gekoppelten Rezeptors (GPCR) zur Bildung von cAMP aus Adenosin-5′-triphosphat (ATP) veranlasst, nachdem der GPCR durch einen „first messenger“ aktiviert wurde (4). „First messenger“ sind beispielsweise Hormone
2 oder Neurotransmitter, die den GPCR direkt stimulieren. Ein zusätzlicher direkter Stimulator der mACs mit Ausnahme der mAC9 ist Forskolin, ein pflanzliches Diterpen, welches in der Forschung eingesetzt wird, um hohe intrazelluläre cAMP-Konzentrationen zu erzeugen (5).
Auch die sAC kann zusätzlich aktiviert werden, allerdings nicht durch die Zugabe von Forskolin, sondern durch das Hinzufügen von Bikarbonat (6). Als weiterer cAMP-Generator wurde die lösliche Guanylylzyklase charakterisiert (7).
Der Anstieg der cAMP-Konzentration in der Zelle führt zur Phosphorylierung bestimmter Effektorproteine. Das Hauptzielprotein von cAMP ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA), die aus zwei katalytischen (C) und zwei regulatorischen (R) Untereinheiten zusammengesetzt ist. Die regulatorischen Untereinheiten liegen in verschiedenen Formen vor:
RI- und RII- sowie - und -Form. Die Bindung von cAMP erfolgt an die regulatorischen Untereinheiten (8). Auch die Proteinkinase G wird von cAMP aktiviert (9, 10). Als weitere Zielproteine sind die „exchange proteins directly activated by cAMP“ 1 und 2 (Epac 1 und 2) zu nennen, welche als „guanine nucleotide exchange factors“ die Bindung von GTP an die kleinen G-Proteine Rab 1 und Rab 2 katalysieren (11, 12). Auch Kationenkanäle, das heißt
„hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels“ (HCN-Kanäle) und „cyclic nucleotide-gated channels“ (CNG-Kanäle), sind bekannte Effektoren von cAMP (13, 14). All diese identifizierten Bindungspartner interagieren mit cAMP über ihre „cyclic nucleotide- binding domain“ (CNB-Domäne). Diese Domäne ist in Eukaryoten ubiquitär vorhanden und auch bei den cGMP-Targetproteinen aufzufinden (15).
Limitiert wird die Wirkung von cAMP durch verschiedene Phosphodiesterasen, die das zyklische Nukleotid zu Adenosinmonophosphat (AMP) abbauen. Von den elf bekannten Phosphodiesterasefamilien sind vor allem die PDEs 4, 7 und 8 cAMP-spezifisch, aber auch über die PDEs 1, 2, 3, 10 und 11 ist der Abbau von cAMP möglich (16). Ein zweiter Mechanismus, der die Wirkung von cAMP begrenzt, ist der Transport aus der Zelle in den Extrazellularraum. Dafür sind die „multidrug resistance proteins“ 4, 5 und 8 (MRP) verantwortlich (17, 18). Dort kann cAMP zu AMP, Adenosin oder Adenin verstoffwechselt werden (19).
Aus den genannten Zielstrukturen von cAMP lassen sich einige physiologische Funktionen ableiten: Beispielsweise wird der Aktivierung der Proteinkinase A durch cAMP und den darauffolgenden Phosphorylierungsschritten eine wichtige Funktion im Glykogenstoffwechsel zugeschrieben (20). Des Weiteren zeigen die cAMP-PKA-Interaktion und die Interaktion des zyklischen Nukleotids mit Epac einen synergistischen Effekt im Gefäßsystem bezüglich der Proliferationshemmung in glatten Muskelzellen (21). Zudem spielt die cAMP-Bindung an HCN- Kanäle im Herzen eine entscheidende regulatorische Rolle in Schrittmacherzellen durch
3 Beeinflussung des „hyperpolarization-activated current“ (if) (22). Dies sind nur ein paar der bereits bekannten Funktionen von cAMP, die jedoch die vielseitige physiologische Beteiligung dieses „second messengers“ demonstrieren können.
Als zweites zyklisches Nukleotid in der Familie der kanonischen „second messenger“ ist zyklisches Guanosin-3′,5′-monophosphat (cGMP) anzuführen. cGMP wurde ein paar Jahre später als cAMP in hohen Konzentrationen im Urin entdeckt. Aus diesem Grund wurde es als im Urin messbarer Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen, die mit erhöhter Ausschüttung des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) im Herzen einhergehen, in Betracht gezogen (23). Denn ANP aktiviert über die membranösen Guanylylzyklasen den cGMP- Signalweg. Dieser Ansatz konnte sich jedoch nicht durchsetzen (23, 24).
Ähnlich wie cAMP wird auch cGMP durch eine membranständige Enzymfamilie bestehend aus sieben Guanylylzyklasen und einer zytosolischen Guanylylzyklase generiert (siehe Abbildung 2) (25). Die zytosolische beziehungsweise lösliche Guanylylzyklase (sGC) existiert in zwei Isoformen: und . Sie wird durch Stickstoffmonoxid (NO) aktiviert und katalysiert infolgedessen die Reaktion von Guanosin-5′-triphosphat zu zyklischem Guanosin-3′,5′- monophosphat unter Pyrophosphatabspaltung (26). Das Stickstoffmonoxid entstammt der Umwandlung von Arginin als Substrat der NO-Synthasen (27, 28). Therapeutische Ansätze durch Stimulation beziehungsweise Aktivierung der sGC werden später beispielhaft erläutert.
Einen anderen Aktivierungsweg zeigen die sieben membranösen beziehungsweise partikulären Guanylylzyklasen, die pGC-A bis -G benannt werden. pGC-A und -B sind auch bekannt als Rezeptoren des natriuretischen Peptids, da sie durch ANP, BNP oder CNP aktiviert werden können (28). Des Weiteren arbeiten einige der membranständigen Guanylylzyklasen auf eine ATP-abhängige Weise, denn ATP führt zu erhöhter enzymatischer Aktivität der pGC-A, -B, -C und -E (29).
Ähnlich wie die Bildung von cAMP durch die lösliche Guanylylzyklase kann cGMP durch die lösliche Adenylylzyklase generiert werden (30). Bikarbonat als sAC-Stimulator hat in Studien von Hasan et al., 2014 die intrazellulären cGMP-Level erhöht, wohingegen der sAC- Inhibitor KH7 diesen Effekt rückgängig machte (30).
Eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration hat über diverse Effektorproteine eine Aktivierung verschiedener Signalwege zur Folge. Als klassisches und am längsten bekanntes Zielprotein wird die cGMP-abhängige Proteinkinase (PKG) angeführt, welche in zwei Isoformen PKGI und PKGII vorliegt (31). In der Literatur werden die Isoformen auch als cGKI und II bezeichnet, wobei die cGKI nochmals in eine - und -Isoform eingeteilt werden kann (32). Alle Isoformen werden in humanem Gewebe exprimiert. Allerdings unterscheidet sich das
4 Organvorkommen der cGKI von dem der cGKII, was sich auf unterschiedliche Funktionen der beiden Isoformen auswirkt. Über die cGKI-Isoform ist cGMP als „second messenger“
maßgeblich an der Regulation des Tonus der glatten Muskulatur im Sinne einer Relaxation beteiligt. Außerdem ist die PKG über ihre erste Isoform in die Hemmung der Blutplättchenaggregation involviert (32). Im Gegensatz dazu spielt die Proteinkinase G über die cGKII zum Beispiel eine Rolle bei der enchondralen Ossifikation, das heißt dem Knochenaufbau (33).
Ein weiterer Effektor von cGMP ist die Proteinkinase A. Beide Untereinheiten (RI und RII) konnten durch cGMP mit hoher Effizienz und geringer Potenz aktiviert werden (9). Analog zu cAMP bindet cGMP über die CNB-Domäne an CNG- und HCN-Kanäle, wobei die Affinität verglichen mit cAMP zu ersteren höher und zu letzteren geringer ist (14).
Der Abbau von cGMP erfolgt durch Phosphodiesterasen durch Hydrolyse der 3′-zyklischen Phosphatbrücke, vor allem durch die PDEs 5, 6 und 9, aber auch durch die PDEs 1, 2, 10 und 11 (16). Ein weiterer Mechanismus zur Limitierung der cGMP-Level ist die Ausschleusung cGMPs in den Extrazellularraum durch MRP 4, 5 und 8 oder durch den organischen Anionentransporter 2 (OAT2) (17, 18, 34).
Die klinische und pharmakologische Relevanz des „second messengers“ cGMP lässt sich am Beispiel der pulmonalen Hypertonie erläutern: Zur Therapie können Aktivatoren der löslichen Guanylylzyklase (sGC) eingesetzt werden, die über eine Erhöhung von cGMP zur Vasodilatation führen. Dabei ist Riociguat als direkter sGC-Stimulator zu nennen, der nicht nur durch eine Vasodilatation zur Linderung der Beschwerden beiträgt, sondern auch langfristig das vaskuläre Remodeling weitestgehend verhindert (35, 36). Ein weiterer Einsatzbereich von sGC-Aktivatoren ist die Herzinsuffizienz, bei der Cinaciguat als Stickstoffmonoxid- unabhängiger sGC-Aktivator mit kardioprotektivem Effekt genannt werden kann (37). Ein bestehendes Problem durch das Eingreifen in den NO-sGC-Signalweg bei pektanginösen Beschwerden oder anderen kardiovaskulären Erkrankungen ist jedoch die langfristige Desensitisierung des NO-Rezeptors, der löslichen Guanylylzyklase (38). Das führt zu der Notwendigkeit einer ständigen Dosiserhöhung oder eines Wirkstoffwechsels bei betroffenen Patienten.
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Abbildung 2: Überblick über den cGMP-Signalweg
Dargestellt sind Generatoren inklusive des bakteriellen Toxins ExoY sowie Effektoren, Abtransport und Abbaumechanismen von cGMP.
Abbildung 1: Überblick über den cAMP-Signalweg
Dargestellt sind Generatoren inklusive bakterieller Toxine sowie Effektoren, Abtransport und Abbaumechanismen von cAMP.
6 Zyklische Pyrimidinnukleotide: zyklisches Cytidin-3′,5′-monophosphat
(cCMP) und zyklisches Uridin-3′,5′-monophosphat (cUMP)
Zyklisches Cytidin-3′,5′-monophosphat und zyklisches Uridin-3′,5′-monophosphat gehören zur Gruppe der nicht-kanonischen „second messenger“ und wurden lange Zeit nur wenig erforscht. Die Gründe dafür waren unter anderem, dass es keine Detektionsmöglichkeiten gab, die spezifisch und sensitiv genug waren, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten (39, 40).
Mit Etablierung der Massenspektrometrie als Messmethode wurde die spezifische Detektion der zyklischen Nukleotide vereinfacht (7, 41, 42). Trotzdem gelang der in vivo-Nachweis von cCMP und cUMP erst 2015 durch Bähre et al. (43). Die eingangs aufgeführten Kriterien für
„second messenger“ sind mittlerweile auch für cCMP und cUMP erfüllt.
Zyklisches Cytidin-3′,5′-monophosphat (cCMP)
Erste in vitro-Versuche mit cCMP wurden durch Bloch im Jahre 1974 durchgeführt, indem er es aus Leukämiezellen isolierte und die Effekte von cCMP auf das Zellwachstum untersuchte (44, 45). Seitdem wurden zunehmend Erkenntnisse über cCMP bezüglich Bildung, Effektoren und Abbau gewonnen. Es wurden zwei unterschiedliche Enzyme als Generatoren identifiziert:
die lösliche Adenylylzyklase, die bikarbonatabhängig katalytisch aktiv ist, und die lösliche Guanylylzyklase, die auf die Anwesenheit von Stickstoffmonoxid angewiesen ist. Eine Beteiligung der löslichen Adenylylzyklase bei der Generierung von cCMP konnte in Abgrenzung zur membranständigen Adenylylzyklase durch stimulierende und inhibitorische Agenzien bestätigt werden (30). Durch Stimulation mit bikarbonathaltigem Medium konnte eine Erhöhung der cCMP-Konzentration in HEK293- und B103-Zellen induziert werden, die durch Entzug des Bikarbonats oder Zugabe des sAC-Inhibitors KH7 reversibel war (30, 46). Eine mithilfe von Forskolin bewirkte Stimulation der membranständigen Adenylylzyklase zeigte in beiden Zelllinien keine Auswirkung auf die intrazelluläre cCMP-Konzentration, jedoch den erwarteten Anstieg der cAMP-Konzentration (30). Das heißt, dass die mAC nicht als cCMP- generierendes Enzym agiert. Die sGC kann als weiterer cCMP-Generator benannt werden. In transfizierten, sGC 11-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte ein cCMP-Anstieg durch Hinzufügen des NO-Donors SNP (Natrium-Nitroprussid) in Anwesenheit von IBMX, als unspezifischem Phosphodiesterase-Inhibitor (16, 47), erzeugt werden. Im Vergleich zu cAMP wurden wesentlich geringere Konzentrationen erreicht und der Konzentrationsanstieg fand zeitlich verzögert statt (42). Der sGC-Inhibitor ODQ (1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1- one), der sowohl die Stickstoffmonoxid-abhängige als auch die NO-unabhängige Aktivierung der löslichen Guanylylzyklase blockieren kann, inhibierte die cNMP-Akkumulation erfolgreich (42, 48). Auch in RFL-6-Zellen konnte der beschriebene Effekt des cCMP-Anstiegs mithilfe zweier verschiedener NO-Donoren, SNP und DEA/NO (Diethylammonium (Z)-1-(N,N- diethylamino)diazen-1-ium-1,2-diolat), reproduziert werden. In RFL-6-Zellen wurde die
7 endogene Aktivität der löslichen Guanylylzyklase untersucht. Dies ergab circa fünf Mal höhere cCMP-Konzentrationen in RFL-6-Zellen als in den transfizierten HEK293-Zellen. Außerdem fiel die Konzentration schneller wieder ab (42). Daraus lässt sich schließen, dass es Unterschiede in den Aktivitäten der endogenen im Vergleich zur überexprimierten sGC gibt.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist das Verhalten der sGC in Abhängigkeit eines Cofaktors: Mit Mangan als Cofaktor konnte eine Umwandlung von CTP beziehungsweise UTP in cCMP beziehungsweise cUMP nachgewiesen werden. Ein Umsatz von ATP und GTP erfolgte sowohl mit Mangan als auch mit Magnesium, jedoch war die Aktivität des Enzyms in Anwesenheit von Mangan wesentlich höher. Hier war die maximale Reaktionsgeschwindigkeit für die Konversion von GTP in cGMP am höchsten (7). Eine spezifische Cytidylylzyklase wurde bisher noch nicht gefunden. Es gibt jedoch bakterielle Toxine, denen eine Cytidylylzyklaseaktivität zugeschrieben wird, wie zum Beispiel dem Ödemfaktor (edema factor, EF) von Bacillus anthracis und CyaA des Bakteriums Bordetella pertussis (49).
Als Effektorproteine für cCMP sind vor allem die Proteinkinase A mit den zwei Untereinheiten RI und RII sowie die Proteinkinase G über die I-Isoform anzuführen (9). cCMP zeigte zwar eine ähnliche Effizienz jedoch eine geringere Potenz bezüglich der Aktivierung der Proteinkinase A im Vergleich zu cAMP und cGMP. Dieses Ergebnis spiegelt sich für beide benannten Untereinheiten wider. Die Effizienz der PKGI ist verglichen mit cGMP für cCMP wesentlich geringer (circa 55 %), sodass für cCMP nur ein partieller Agonismus nachgewiesen werden konnte (9). Trotzdem sind effiziente physiologische Effekte von cCMP bekannt. Hier sind beispielsweise die über die PKG vermittelte Relaxation von Gefäßmuskulatur und die Inhibition der Thrombozytenaggregation zu nennen (50). Diese Effekte konnten sowohl durch die Stimulation der Proteinkinase G durch cGMP als auch durch cCMP in aortalem Gewebe nachgewiesen werden. Allerdings zeigte cGMP in niedrigen Konzentrationen einen stärkeren Effekt als cCMP (50). Verwendet wurde kein reines cCMP, da dieses nicht membranpermeabel ist, sondern das besser membrangängige Dibutyryl-cCMP (DB-cCMP) (51). DB-cCMP wird in der Zelle von unspezifischen Esterasen zu 4-MB-cCMP umgewandelt, welches daraufhin von unspezifischen, weniger aktiven Amidasen zu cCMP abgebaut wird. Somit liegt nach Zugabe von DB-cCMP hauptsächlich 4-MB-cCMP als aktiver Metabolit in der Zelle vor (51). Aufgrund unterschiedlicher Eigenschaften von 4-MB-cCMP im Vergleich zu cCMP, sollte die Erforschung physiologischer Funktionen von cCMP mithilfe von DB-cCMP kritisch betrachtet und heutzutage nicht mehr durchgeführt werden. Stattdessen bietet sich die Verwendung von cNMP-Acetoxymethylestern an, welche gut membranpermeabel sind und intrazellulär als einzigen freien Metaboliten das native zyklische Nukleotid freisetzen (52). Den Nachweis, dass der Einsatz von cCMP-AM spezifische Signale generiert, erbrachten Beckert et al., 2014 durch
„dynamic mass redistribution“-Messungen (DMR) (53). cCMP-AM erzeugte ein Signal,
8 welches von den anderen cNMP-AMs unterschieden werden konnte und so für die spezifische Freisetzung des zyklischen Nukleotids sprach.
Einen neuen Ansatz zur Identifikation spezifischer cCMP-Effektorproteine verwendete A.
Hammerschmidt 2012 (54). Mithilfe von Agarosematrizes, an die das zyklische Nukleotid gekoppelt war, wurden affinitätschromatographische Versuche durchgeführt und mittels Gelelektrophorese und „Western Blotting“ oder mittels Massenspektrometrie (LC-MS) analysiert. Die RI- und die RII-Untereinheit der PKA konnten mit dieser Methode als Bindungspartner von cCMP bestätigt (54) und die PKG identifiziert werden (unveröffentlichte Daten). Ein Hinweis auf weitere Bindungspartner von cCMP wie Calnexin, Myomegalin und AKAP9 ergab sich mithilfe der Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie (55, 56).
Die Überprüfung dieser möglichen Bindungspartner mittels Affinitätschromatographie und
„Western Blotting“ ist Bestandteil dieser Arbeit und wird im Verlauf dargestellt.
Ein weiterer Bindungspartner von cCMP ist Epac, das wenig effizient und niedrigpotent aktiviert wird (53). Außerdem wurden die HCN-Kanäle 2 und 4 und Kationenkanäle in olfaktorischen Zilien als Zielmoleküle identifiziert (57, 58).
Eine Limitierung der intrazellulären cCMP-Konzentration wird einerseits über den Abbau durch die PDE7A1 und andererseits über den Transport nach extrazellulär durch MRP5 erreicht. Der Abbau durch die PDE7A1 stellt einen niedrigaffinen aber hochkapazitiven Abbaumechanismus für intrazelluläre cCMP-Konzentrationen mit einem KM-Wert von circa 135 µM dar (59). Die physiologische Relevanz dieses Abbauprozesses ist noch nicht abschließend geklärt. Es wird über eine Rolle im Entgiftungsprozess von Zellen nach bakterieller Infektion diskutiert (59).
MRP5 transportiert cCMP dahingegen ATP-abhängig über die Plasmamembran in den Extrazellularraum (60). Weitere MRP wurden für andere zyklische Nukleotide, nicht aber für cCMP gefunden. Der Transportmechanismus über MRP5 dient der Zelle ähnlich wie der Abbau durch die PDE7A1 möglicherweise zum Schutz gegen bakterielle Toxine, da diese als cCMP- und auch cUMP-Generatoren wirken. Hohe intrazelluläre Konzentrationen werden somit vermutlich vermieden (60).
Die Konzentration von cCMP beläuft sich in HEK293-Zellen auf circa 30 µM, kann aber durch Akkumulation in bestimmten Zellkompartimenten, wie dem Zellkern, auch höhere Konzentrationen annehmen (59). Damit ist vor allem bei niedrigen cAMP- und cGMP- Konzentrationen eine physiologische Relevanz von cCMP möglich. Einen Hinweis auf die Rolle von cCMP im Organismus gibt auch das Vorkommen in verschiedenen Organsystemen.
cCMP lässt sich in Milz, Bauchspeicheldrüse und dem weiblichen Reproduktionssystem nachweisen, sodass eine funktionelle Bedeutung im Bereich des Immunsystems, im endokrinen oder exokrinen System und den weiblichen Geschlechtsorganen denkbar ist (43).
9 Des Weiteren liegt eine mögliche Funktion von cCMP in der cCMP-induzierten Apoptose (61).
In S49-Lymphomzellen konnte mithilfe des membranpermeablen cCMP-Analogons cCMP-AM ein Effekt erzielt werden, der auch in kinasenegativen Zellen nachgewiesen werden konnte.
Bei diesen Zellen ist die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A auf Proteinebene nicht nachweisbar (62). Da die kinasenegativen S49-Lymphomzellen außerdem keine Expression der PKG und der HCN-Kanäle 2 und 4 aufweisen, können diese Proteine als Effektoren für die Apoptoseinduktion durch cCMP ausgeschlossen werden. Auch die Aktivierung von Epac kommt als Signalweg nicht in Frage. Dies bedeutet, dass bisher ungeklärt ist, über welchen direkten Effektor Apoptose induziert wird. Bewiesen werden konnte jedoch, dass der Effekt von cCMP über den intrinsischen Weg abläuft und caspaseabhängig mit einer Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien einhergeht. Möglicherweise ist das zyklische Nukleotid auch an der Initiierung von Stress am endoplasmatischen Retikulum (ER) und darüber ebenfalls am programmierten Zelltod beteiligt (61, 63). Eine Zusammenfassung des cCMP- Signalweges ist in Abbildung 3 dargestellt.
Zyklisches Uridin-3′,5′-monophosphat (cUMP)
Ähnlich wie bei cCMP bestand lange Zeit kein Interesse am zyklischen Uridin-3′,5′- monophosphat, da cAMP und cGMP eine deutlich höhere physiologische Relevanz zeigten.
Der in vivo-Nachweis von cUMP gelang in Lunge, Serum, Urin und Faeces von Mäusen nach
Abbildung 3: Überblick über den cCMP-Signalweg
Dargestellt sind Generatoren inklusive bakterieller Toxine sowie Effektoren, Abtransport und Abbaumechanismen von cCMP. In blau erkennbar ist der in dieser Arbeit detektierte Bindungspartner. Außerdem zu sehen, ist der Effekt einer Behandlung mit cCMP-AM.
10 deren Infektion mit dem ExoY-überexprimierenden Bakterium Pseudomonas aeruginosa. Als Folge auf die Infektion und die damit einhergehende Freisetzung des Toxins ExoY kam es zu einer Erhöhung der cUMP-Konzentration und zum ersten erfolgreichen in vivo-Nachweis von cUMP (43). ExoY zeigt Nukleotidylzyklaseaktivität und führt zu massiven intrazellulären Konzentrationsanstiegen von cUMP und cGMP (64). Die Bakterientoxine CyaA von Bordetella pertussis und Ödemfaktor (EF) von Bacillus anthracis sind ebenfalls zur Generation von cUMP fähig (49).
Zudem kann cUMP durch die lösliche Adenylylzyklase und die lösliche Guanylylzyklase gebildet werden. Die membranständigen Formen dieser Enzyme (mAC und pGC) dienen, wie auch von cCMP bekannt ist, nicht als Generatoren der zyklischen Pyrimidinnukleotide (30, 41).
Gezeigt wurde die sGC-Aktivität für cUMP durch Einsatz der aufgereinigten sGC 11, die cUMP nur mit Mangan als Cofaktor NO-abhängig generiert (7). Der cUMP-generierende Effekt der sAC ist bikarbonatabhängig und wird durch den sAC-Inhibitor KH7 inhibiert (30).
Als Zielstrukturen von cUMP sind wie bei den anderen beschriebenen zyklischen Nukleotiden die Proteinkinasen A und G sowie die HCN-Kanäle 2 und 4 anzuführen (9, 57). Ähnlich wie cCMP ist cUMP ein vollständiger Aktivator der PKA, jedoch nur ein partieller Agonist der PKG mit jeweils moderater Potenz (9). Über die physiologischen Effekte, die über die genannten Zielproteine von cUMP vermittelt werden, ist bisher wenig bekannt. Der methodische Ansatz einer Butyrylierung, die bei cCMP durch Erzeugen des DB-cCMP eine bessere Membrangängigkeit bewirkte, konnte für cUMP aufgrund des Fehlens einer reaktiven Gruppe in der Struktur nicht realisiert werden. Dahingegen scheint cUMP-AM eine gute und spezifische Vorstufe zu sein, um Effekte von cUMP untersuchen zu können (52, 53). Durch cUMP-AM erzeugte DMR-Signaturen sind spezifisch und unterschiedlich zu denen von cCMP- AM, allerdings nicht so effektiv inhibierbar wie die von cCMP-AM. Auch eine Kombination von PKA- und PKG-Inhibitoren führte nicht zu einer vollständigen Unterdrückung der Signale.
Deshalb wird über weitere Signalwege von cUMP diskutiert, die unabhängig von PKA und PKG ablaufen (2, 53). Beispielsweise kann cUMP-AM in Kombination mit dem MRP-Inhibitor Probenecid Apoptose in HEL- und K562-Zellen induzieren (63).
cUMP wird von drei verschiedenen Phosphodiesterasen abgebaut. Dazu zählen die PDE3A, die vor allem in Kardiomyozyten vorkommt, und die PDE3B, die in Rattenadipozyten gefunden wurde (65-68). Außerdem katalysiert die PDE9A den Abbau von cUMP zu UMP (2, 66). Des Weiteren kann cUMP aus der Zelle über MRP 4 und 5 ausgeschleust werden (60). Einen Überblick über den cUMP-Signalweg zeigt Abbildung 4.
11 Identifizierung potentieller Targetmoleküle
Calnexin (Chaperon), Myomegalin („phosphodiesterase-interacting protein“) und AKAP9 („A- kinase anchoring protein”) sind drei Proteine, die als putative direkte oder indirekte Bindungspartner von cCMP und cUMP in Betracht gezogen werden (55). Erste Hinweise auf Interaktionen zwischen den genannten Proteinen und cCMP beziehungsweise cUMP wurden mithilfe von Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie erbracht. Dazu wurden cCMP- und cUMP-Agarosen eingesetzt und die mögliche Bindung der zyklischen Pyrimidinnukleotide an Calnexin, Myomegalin und AKAP9 in Geweben und Zelllinien verschiedener Spezies (human und Maus) untersucht (69). Die massenspektrometrischen Ergebnisse werden in dieser Arbeit überprüft und bestätigte Bindungspartner charakterisiert.
Calnexin
Calnexin ist ein integrales Typ -Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums (ER), welches ein Molekulargewicht von circa 90 kDa hat. Es wurde 1991 zunächst als p88 von Degen und Williams beschrieben und unabhängig davon unter dem Namen IP90 als potentielles molekulares Chaperon entdeckt (70, 71). Letztlich stellte sich heraus, dass es sich bei beiden beschriebenen Molekülen um Calnexin handelte (72, 73). Eine Assoziation zu MHC Klasse -Molekülen und inkompletten Proteinkomplexen von T- und B-Zellrezeptoren und weiteren neu gebildeten Proteinen ließen eine Funktion als molekulares Chaperon vermuten
Abbildung 4: Überblick über den cUMP-Signalweg
Dargestellt sind Generatoren inklusive bakterieller Toxine sowie Effektoren, Abtransport und Abbaumechanismen von cUMP. In blau erkennbar ist der in dieser Arbeit detektierte Bindungspartner.
12 (70, 72). Die längere Verweildauer falsch gefalteter Proteine an Calnexin im ER-Lumen unterstützte diese Hypothese (74). Außerdem konnte beim Krankheitsbild der zystischen Fibrose Calnexin als Qualitätskontrollsystem identifiziert werden, welches nur den Wildtyp-, nicht aber den mutierten CFTR-Rezeptor zu seinem eigentlichen Wirkort entlässt (75). Weitere identifizierte Bindungspartner von Calnexin sind Calcium, Magnesium-ATP, Zink, Immunglobulin Y und andere glykosylierte sowie nicht-glykosylierte Substrate (76-79).
Calnexin weist in seiner Aminosäuresequenz eine starke strukturelle Ähnlichkeit mit einem anderen calciumbindenden Protein namens Calreticulin auf (80, 81). Neben vier Hauptdomänen ohne Nukleotidbindungsdomäne (CNB-Domäne) besitzt Calnexin eine Lektinbindungsstelle und bildet wie Calreticulin einen Komplex mit der Oxidoreduktase ERp57 (76, 82). Dieser Komplex bindet Proteine und überprüft deren richtige Ausbildung der Faltung, bevor sie über den sekretorischen Weg aus dem endoplasmatischen Retikulum in Richtung Golgi-Apparat entlassen werden (83).
Auch wenn Calnexin hauptsächlich im ER lokalisiert ist, wird ein kleiner Anteil an die Zelloberfläche transportiert. Zunächst wurde dieser Effekt in unreifen Lymphozyten, später auch in anderen Zelllinien beobachtet (84). Dass Calnexin eine essentielle Rolle im Organismus von Säugetieren spielt, zeigten Studien mit Calnexin-defizienten Knockout- Mäusen. Diese waren nicht nur kleiner, sondern lebten auch wesentlich kürzer: Circa die Hälfte der Mäuse starb in den ersten 48 Stunden nach der Geburt. Außerdem zeigten sie deutliche motorische Unsicherheiten, wie beispielsweise ein ataktisches Gangbild. Dies stand im Zusammenhang mit dem Fehlen stark myelinisierter Nervenfasern bei den Mäusen ohne Calnexin (85).
Eine weitere Funktion von Calnexin betrifft die Apoptose. Calnexin wird von rekombinanter Caspase auf einen Apoptosestimulus hin gespalten. Das hierbei entstehende Spaltprodukt hemmt wiederum die Apoptose (86). Die Regulation der ER-Stress-induzierten Apoptose durch Calnexin ist unabhängig von dessen Funktion als Chaperon, hängt aber mit einer Interaktion mit Bap31 zusammen (87). Bap31 ist ein Protein des endoplasmatischen Retikulums, welches durch proteolytische Spaltung zur Apoptoseinduktion führt (88).
Alles in allem wurden für Calnexin viele verschiedene Bindungspartner identifiziert. Als Hauptfunktion ist die Rolle als molekulares Chaperon am endoplasmatischen Retikulum zu nennen, die mit der Interaktion korrekt- und fehlgefalteter Proteine einhergeht.
Myomegalin
Myomegalin (MMGL) ist ein bisher sehr wenig erforschtes Protein, sodass in der PubMed- Datenbank des NCBI unter dem Suchbegriff „Myomegalin“ zurzeit weniger als zwanzig Artikel zu finden sind (Stand Oktober 2018). Ein anderer Name für das 2324 Aminosäuren
13 umfassende Protein Myomegalin ist „phosphodiesterase-4D-interacting protein“ (PDE4DIP) entsprechend einer oftmals beobachteten Kolokalisation beider Moleküle an Zentrosomen und Golgi-Apparat (89). Eine 20-prozentige strukturelle Überschneidung zu den schweren Ketten des Myosinmoleküls wurde festgestellt, die jedoch nicht die ATP-Bindungsdomäne umfasst.
Des Weiteren weist Myomegalin ein Leuzinzipper-Modul auf, welches sich identisch bei Zentrosomin, einem Protein des Zentrosoms der Drosophila melanogaster, findet (89). Die Gewebeverteilung von Myomegalin beschränkte sich in den ersten Forschungsergebnissen auf das Herz, die Skelettmuskulatur und das Hodengewebe in verschiedenen „Splice“- Varianten, die bis zu 250 kDa umfassten (89, 90). Die Isoform 8 wurde später in verschiedenen Epithelzellen (HEK293 und HeLa) und Fibroblasten nachgewiesen (90). In Bezug auf die Regulation der Herzkontraktilität wurde die Isoform 4 als „A-kinase anchoring protein“ (AKAP) identifiziert, da sie alle Kriterien inklusive der Bindung der Proteinkinase A zur Klassifikation als AKAP erfüllt (91). Durch die Bindung der PKA als cAMP-Effektor und der PDE4D als cAMP- abbauendes Enzym trägt Myomegalin einen Teil zur Koordination des cAMP-Signalwegs bei.
Weitere Bindungspartner sind das kardiale Myosinbindungsprotein C (cMyBPC), das durch die PKA nach -adrenerger Stimulation phosphoryliert wird, und andere Proteine der Sarkomerstrukturen im Herzen (91). MMGL 4 wird ein kardioprotektiver Effekt zugeschrieben, indem es cMyBPC vor dem Abbau schützt und für eine normale Integrität ins Sarkomer sorgt (91).
Die Myomegalin-Isoform 8, die in Epithelzellen und Fibroblasten am cis-Golgi gefunden wurde, interagiert dort mit AKAP9 (auch AKAP450) und der Proteinkinase A (90, 92). Sie ist für die Organisation des Golgi-Apparates und den Transport von Proteinen vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi von essentieller Bedeutung (90). Des Weiteren geht Myomegalin Bindungen mit -Tubulinkomplex sowie mit „end-binding protein“ 1 und 3 (EB 1 und 3) ein.
Abgesehen von der Isoform 8 enthalten einige Isoformen ähnlich wie das „CDK5 regulatory subunit-associated protein 2“ (CDK5RAP2), ein -Tubulinkomplex-Bindungsprotein, die konservierte CM1-Domäne. Darüber wird die Bindung an -Tubulinkomplex vermittelt und die Mikrotubuli-Bildung stimuliert (92-94).
Zusammenfassend kann für Myomegalin festgehalten werden, dass es eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Multiproteinkomplexen vor allem in Kardiomyozyten spielt und somit eine essentielle Bedeutung für cAMP-abhängige Signalwege hat (91, 95). Myomegalin ist ein wichtiges Protein für die Organisation des Golgi-Apparates und des Mikrotubuli-Netzwerkes (89, 92).
14 AKAP9
AKAPs sind „A-kinase anchoring proteins“, die als Gemeinsamkeit die Verankerung der Proteinkinase A über eine hochkonservierte Bindungsdomäne haben (96, 97). Sie bewirken durch die Bildung von Multiproteinkomplexen die räumliche und zeitliche Koordination von Enzymaktivitäten, indem sie Generatoren, Effektoren und degradierende Enzyme an einem Ort zueinander bringen. Dies führt zur Kompartimentierung und bedeutet, dass cAMP-Pools direkt an ihrem Wirkort hergestellt und auf diesen beschränkt werden. So können spezifische cAMP-Signalwege eingeleitet und physiologische Funktionen kontrolliert werden (98). Viele AKAPs sind ubiquitär vorhanden, wohingegen einige spezialisierte auch nur in bestimmten Zelllinien nachgewiesen werden können (99). Fehlfunktionen von AKAPs können diverse pathophysiologische Folgen haben. Es wurden Assoziationen zu Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Diabetes mellitus, einer HIV-Infektion sowie zu verschiedenen Karzinomen beobachtet und AKAPs somit als potentielle Zielstrukturen von Arzneimitteln erkannt (97).
Als erste AKAP wurde 1982 von Theurkauf und Vallee das Mikrotubuli-assoziierte Protein 2 entdeckt (100). Mittlerweile gibt es viele verschiedene Isoformen, die zum Teil wenig strukturelle Gemeinsamkeiten - abgesehen von der Bindung der PKA - besitzen (101). Auch die Nomenklatur ist sehr uneinheitlich und bezieht sich nur in einigen Fällen auf das Molekulargewicht, da ein paar Moleküle bei ihrer Benennung bereits charakterisiert aber noch nicht als AKAP klassifiziert waren. Die Lokalisation in der Zelle variiert ebenfalls: Im Zellkern sind wenig AKAPs zu finden, was mit der Tatsache vereinbar ist, dass auch die regulatorischen Untereinheiten der Proteinkinase A dort nicht lokalisiert sind (99). Die Yotiao als kleinste
„Splice“-Variante der AKAP9 (250 kDa) befindet sich beispielsweise in der Plasmamembran (102). Es gibt fünf weitere, längere „Splice“-Varianten der AKAP9, die in Zentrosomen und Golgi lokalisiert sind (99, 101). AKAP9 ist eine RII-spezifische, kanonische AKAP, das heißt sie bindet an die „docking and dimerization domain“ der RII-Untereinheit der Proteinkinase A (103). Diese Bindung kann zum Beispiel durch den PKA-Inhibitor Ht31, ein „human thyroid anchoring protein“, inhibiert werden, der eine Kompetition um die RII-Untereinheit bewirkt (104). Ht31 ist ein Fragment der AKAP-Lbc, welches hauptsächlich die amphipathische Helix als Bindungsstelle der AKAP an die PKARII umfasst (99). Die meisten anderen AKAPs sind ebenfalls RII-spezifisch. Es gibt jedoch auch dual-spezifische AKAPs, die sowohl die RII- als auch die RI-Untereinheit der PKA binden. Es sind bisher nur wenige RI-spezifische AKAPs wie das „sphingosine kinase type-1 interacting protein“ und die smAKAP gefunden worden (105, 106).
Auch die Gewebeverteilung der AKAPs ist unterschiedlich. Die Yotiao wird zum Beispiel im Gehirn und im Herzen exprimiert (102, 107). Als Bindungspartner sind neben der
15 Proteinkinase A die Proteinphosphatase 1, die Phosphodiesterase 4D3, die NMDA-Rezeptor- Untereinheit NR1, der Inositol-1,4,5-trisphosphatrezeptor IP3R und die Kaliumkanal- Untereinheit KCNQ1 bekannt (102, 107-110). Eine CNB-Domäne zur Bindung zyklischer Nukleotide wurde bisher nicht identifiziert. Es wurde eine Assoziation zu den Adenylylzyklasen 1, 2, 3 und 9 beobachtet, wobei davon nur die AC9 in Kardiomyozyten exprimiert wird (107).
Durch das Zusammenbringen verschiedener Effektoren wie Adenylylzyklasen, Proteinkinasen und Phosphodiesterasen werden Regelkreise über Rückkopplungsmechanismen aufgestellt und die Akkumulation von cAMP begrenzt (107, 111). So reduziert die PDE4D3 die cAMP- Konzentration in der Nähe des KCNQ1-Kaliumkanals, um die Phosphorylierung des Kanals durch die Proteinkinase A zu beschränken.
Auch pathophysiologisch wird der Bindung der Yotiao an die Kaliumkanal-Untereinheit KCNQ1 eine Bedeutung beigemessen. Es handelt sich bei der Bindungsstelle am Kanal um ein Leuzinzipper-Motiv. Durch PKA-Phosphorylierung des Kanals in Folge einer Sympathikus- aktivierung über -Adrenozeptoren steigt der IKs, der langsame auswärtsgerichtete Kalium- Ionenstrom („slow outward potassium ion current“), an. Dies unterstützt vor allem bei steigender Herzfrequenz, das heißt bei positiver Chronotropie, die schnellere Repolarisation.
Im Falle einer Mutation im Leuzinzipper des Kanals (G589D) oder in der Yotiao- Bindungsdomäne (S1570L) findet die Phosphorylierung schlechter oder gar nicht statt und die Repolarisation beginnt verzögert. Dadurch verlängert sich das Aktionspotential und es kann zum Long-QT-Syndrom kommen. Die betroffenen Patienten haben ein erhöhtes Risiko für Kammerflimmern und den plötzlichen Herztod (108, 112). Allgemein sind die Interaktionen zwischen der Proteinkinase A und AKAPs bei Herzinsuffizienz verändert. Im Fall der Yotiao konnte eine verminderte Bindung der PKA gezeigt werden (113).
Ziel der Arbeit
Das Ziel dieser Arbeit ist es, Calnexin, Myomegalin und AKAP9 als putative Zielmoleküle von cCMP und cUMP zu untersuchen und näher zu charakterisieren. Basierend auf den massenspektrometrischen Daten von M. Neumann und S. Wolter wurden diese drei Proteine ausgewählt, um eine Bindung mittels anderer Methodik zu verifizieren (55, 56, 69). Es wurden cCMP- und cUMP-Agarose sowie entsprechende Biotin-gekoppelte Moleküle eingesetzt und eine Bindung dieser an Calnexin, Myomegalin und AKAP9 mithilfe von Gelelektrophorese und
„Western Blotting“ untersucht.
Durch die Kopplung der zyklischen Nukleotide an die Agarosen oder an Biotin, welches an Strep-Tactin®-Gel gebunden wurde, befinden sich diese an einer stationären Phase. Moleküle, die nicht direkt oder indirekt - beispielsweise über die zyklischen Nukleotide - an die Agarosen beziehungsweise an das Biotin-Strep-Tactin®-Gel binden, werden durch mehrmalige
16 Waschschritte eliminiert. Die direkte Bindung an die Agarose soll mithilfe der Negativkontrolle Ethanolamin-Agarose überprüft werden. Für die Biotin-cNMPs wird Biotin als Negativkontrolle verwendet. Allerdings kann durch die geplante Versuchsmethodik nicht unterschieden werden, ob der untersuchte Bindungspartner direkt oder indirekt an das zyklische Nukleotid bindet.
Etwaige bekannte oder unbekannte Kopplungsmoleküle, die mit cCMP/cUMP und dem Targetmolekül Multiproteinkomplexe bilden, können so nicht identifiziert werden. Die folgende Grafik soll verdeutlichen, welche Bindungsoptionen in dieser Arbeit untersucht werden (siehe Abbildung 5). Im Vergleich dargestellt ist die direkte Bindung von cNMP an das untersuchte Zielmolekül (Calnexin, Myomegalin oder Yotiao) zu einer indirekten Bindung durch Bildung eines Multiproteinkomplexes. Beteiligt an der Bildung eines Multiproteinkomplexes kann sowohl ein bekanntes Kopplungsmolekül wie die PKA oder ein unbekannter Bindungspartner sein. Die Abbildung zeigt die Bindungsmodelle mit Agarose als stationäre Phase. Mit Biotin ergeben sich die gleichen Bindungsoptionen.
Die Charakterisierung spezifischer direkter oder indirekter Effektorproteine von cCMP und cUMP ist hilfreich, um Rückschlüsse auf die bisher noch nicht vollständig geklärte biologische Funktion dieser beiden Nukleotide ziehen zu können. Sie ist somit ein wichtiger Ansatz hinsichtlich der Klärung der biologischen Relevanz von cCMP und cUMP.
Abbildung 5: Mögliche Bindungsmodelle zwischen Agarose, cNMP und den untersuchten Zielmolekülen
17
2. Material und Methoden
Material
Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
Sämtliche Chemikalien wurden von folgenden Firmen bezogen:
Avantor (J. T. Baker), Deventer, Niederlande
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Cell Signaling, Leiden, Niederlande
Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Deutschland
IBA- Solutions for Life Sciences, Göttingen, Deutschland
MACHEREY-NAGEL, Düren, Deutschland
Novus Biologicals, Wiesbaden, Deutschland
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
SERVA, Heidelberg, Deutschland
Sigma Aldrich, München, Deutschland
Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
Die cNMP-Agarosen und die Biotin-cNMPs wurden vom Biolog Life Science Institut, Bremen, Deutschland generiert und bereitgestellt.
Geräteliste
Tabelle 1: Geräteliste
Gerät Hersteller
Autoklaviergerät Autoclav Zirbus HST 4-5-6, Bad Grund, Deutschland Blot-Scanner C-Digit 3600, LI-COR Biotechnology, Lincoln,
Nebraska, USA
Brutschrank Hera cell 240, Heraeus, Thermo Scientific, Bremen, Deutschland
Elektrophoresekammer Hoeferkammer2050 MIDGET Elektrophoresis Unit, LKB, Bromma, Schweden
Elektrophoresekammerdeckel Mighty Small II SE250/260, Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Deutschland
Kühlschrank Liebherr Comfort, Kirchdorf, Deutschland
MACSQuant Miltenyi Biotec, Auburn, USA
Mikroskope Laborlux 11, Leitz, Wetzlar, Deutschland GS, London, Großbritannien
18 NanoDrop 1000, Spektralphotometer, peqlab Biotechnologie
GmbH, Radnor, Pennsylvania, USA
OD-Messgerät Ultrospec 10 – Cell density meter, Amersham Biosciences, Amersham, Großbritannien pH-Meter inoLab® wtw ph level 1, Weilheim, Deutschland
Pipetten Research, Reference, Eppendorf, Wesseling-
Berzdorf, Deutschland
Transferpette S, Brand, Wertheim, Deutschland StepOnePlus qPCR-Gerät StepOnePlus Real-Time PCR-System, Applied
Biosystems, Waltham, Massachusetts, USA Mikroplatten-Leser Synergy 4, BioTek, Winooski, Vermont, USA Rotierer Intelli-Mixer, NeoLab®,LTF Labortechnik,
Wasserburg, Deutschland
Intelli-Mixer, SkyLine RM-2L, ELMI, Riga, Lettland Schüttler The Belly Dancer, Stovall life science Inc,
Greensboro, North Carolina, USA
SDS-Gelgießkammer Mighty Small TM SE245 Dual Gel Caster, HIS Hoefer Scientific, Holliston, Massachusetts, USA
Sterilbank Lamin Air HB2472, Thermo Scientific, Bremen, Deutschland
Netzgerät Elektrophoresis Power Supply EPS 301, Amersham
Pharmacia Biotech, Amersham, Großbritannien Thermoblock Thermostat 5320, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf,
Deutschland
Thermocycler advanced primus 96, peqlab Biotechnologie GmbH, Radnor, Pennsylvania, USA
Thermomixer Thermomixer compact, Eppendorf, Wesseling- Berzdorf, Deutschland
Tiefkühlschrank Liebherr Comfort, Kirchdorf, Deutschland
Vakuumpumpe PC2004 Vario, Vacuubrand, Wertheim, Deutschland
Vortexer Reax 1, Heidolph, Schwabach, Deutschland
Waage Adventurer OHAUS, Greifensee, Schweiz
Electronic balance Chyo MP-3000, GLW, Würzburg, Deutschland
Wasserbad 1008, GFL, Burgwedel, Deutschland
19 Westernblot-Apparatur Pegasus S, S/N 07-12/2011, PHASE, Lübeck,
Deutschland
Zentrifugen Biofuge fresco, Heraeus, Kendro Laboratory Products, Hanau, Deutschland
Sigma Laborzentrifugen, Modell 1-14, 4K15 und 6K10, München, Deutschland
Avanti Centrifuge J-26XP, Beckman Coulter, Brea, Kalifornien, USA
Medien, Lösungen und Puffer Kulturmedium:
DMEM („Dulbecco’s Modified Eagle Medium”) High Glucose 4,5 g/l + L-Glutamin
1 mM Natriumpyruvat-Lösung (100 mM)
1 % (v/v) MEM-Lösung aus nicht essentiellen Aminosäuren (100x)
1 % (v/v) L-Glutamin + Penicillin/Streptomycin (200x)
10 % (v/v) fetales Kälberserum (FKS)
Zellpräparation:
Tabelle 2: Pufferzusammensetzungen
Bindungspuffer
Bindungspuffer für Biotin-Assay mit Magnesium oder Mangan
Optional plus
1 mM Magnesiumchlorid (MgCl2)
Alternativ: 1 mM Mangan(II)chlorid (MnCl2) 5 mM Tris(hydroxymethyl-)aminomethan (TRIS) pH 7,5
230 mM Natriumchlorid (NaCl) 0,5 mM Dithiothreitol (DTT) 10 % (v/v) Glycerol
50 µg/ml bovines Serumalbumin (BSA) 4 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Destilliertes H2O
HaltTM Protease Inhibitor Cocktail (100x)
20 Triton-Lysepuffer einfach konzentriert aus
zweifach konzentrierter Stammlösung
Optional plus
10 mM Tris(hydroxymethyl-)aminomethan (TRIS) pH 7,05
30 mM Natriumpyrophosphat (NaPPi) 1 % (v/v) Octoxinol 9 (Triton® x-100) 2 mM Natriumorthovanadat (Na3VO4) 50 mM Natriumfluorid (NaF)
20 mM β-Glycerophosphat Destilliertes H2O
HaltTM Protease Inhibitor Cocktail (100x)
FACS-Bindungspuffer 10 mM Hepes pH 7,4
140 mM Natriumchlorid (NaCl) 25 mM Calciumchlorid (CaCl2) Destilliertes H2O
Tabelle 3: Proteinbestimmung mittels BCA-Reagenz
Bicinchoninsäure-Lösung (BCA-Lösung) 500 μl Pierce® BCA Protein Assay Reagent B 25 ml Pierce® BCA Protein Assay Reagent A Das Volumen reicht für eine 96-Loch-Platte.
Tabelle 4: Substanzen für SDS-Gelelektrophorese und Western Blot
10x Elektrodenpuffer (pH 8,3) 25 mM TRIS 190 mM Glycin
0,1 % (m/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) Destilliertes H2O
Anodenpuffer 10 % (v/v) Roti®-Block A 10x
20 % (v/v) Methanol Destilliertes H2O
Kathodenpuffer 10 % (v/v) Roti®-Block K 10x
20 % (v/v) Methanol Destilliertes H2O 10x Tris-Buffered-Saline mit Tween 20
(TBS-T)
200 mM TRIS 15 mM NaCl
1 % (v/v) Tween 20 Destilliertes H2O
21
„WesternSureTM PREMIUM
Chemiluminescent Substrate“ im Verhältnis 1:1 auf Blotmembran
„WesternSureTM PREMIUM Stable Peroxide Solution“
„WesternSureTM PREMIUM Luminol Enhancer Solution“
Zelllinien
Astrozyten: Es wurden neonatale Rattenzellen verwendet, die zwischen dem ersten und dritten Tag nach der Geburt von der Abteilung für Neuroimmunologie der Medizinischen Hochschule Hannover isoliert wurden.
B103: Hierbei handelt es sich um Neuroblastomzellen aus der Ratte, welche von Dr. E. Zoref- Shani (Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel) zur Verfügung gestellt wurden.
Fibroblasten: Murine 3T3-L1-MBX-Fibroblasten wurden von der Firma ATCC („American Type Culture Collection“, Manassas, Virginia, USA) bezogen.
HEL 92.1.7: HEL-Zellen wurden als humane AML-Zelllinie eingesetzt (ATCC, Manassas, Virginia, USA).
HeLa: HeLa-Zellen sind humane Zervixkarzinomzellen von ATCC, Manassas, Virginia, USA.
HEK293: Die verwendeten humanen embryonalen Nierenzellen sind HEK293-Zellen, die aufgrund der Expression des IL-1-Rezeptors IL-1-sensitiv sind. Diese Zellen wurden von K.
Matsumoto aus Japan (Nagoya Universität) zur Verfügung gestellt.
J774A1: Bei diesen Zellen handelt es sich um eine murine Monozyten-Tumorzelllinie, die vom Institut für Toxikologie der MHH zur Verfügung gestellt wurde.
K562: Dies sind Zellen einer humanen CML-Zelllinie, Leukämiezellen der myeloischen Reihe (ATCC, Manassas, Virginia, USA).
NIH3T3: Die NIH3T3-Zellen sind embryonale Fibroblasten aus der Maus, die von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorgansimen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland) bezogen wurden.
S49 Wildtyp und kinasenegativ: Hierbei handelt es sich um Lymphomzellen aus der Maus. Bei den kinasenegativen Zellen ist die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A auf Proteinebene nicht nachweisbar. Sie wurden von „cell culture facility“, San Francisco, USA bezogen.
22 Plasmide
Tabelle 5: Für die Transfektion verwendete cDNA
Vektor Protein Hersteller
pcDNA3.1 +-DYK CANX Calnexin GenScript, Piscataway, USA pcDNA3-FLAG (114) FLAG-Tag InvitrogenTM, Thermo Fisher
Scientific, Bremen, Deutschland pcDNA3.1 +-DYK PDE4DIP Myomegalin GenScript, Piscataway, USA pCMV5myc-Yotiao
pCMV5myc-Yotiao (1-808) pCMV5myc-Yotiao (1-958) pCMV5myc-Yotiao (953-1171) pCMV5myc-Yotiao (808-1645)
Yotiao und Yotiao- Konstrukte
Von C. Dessauer (Houston, Texas, USA) bekommen (107)
Die Sequenz DYK bezeichnet den FLAG-Tag und besteht aus den folgenden Aminosäuren:
DYKDDDDK (D: Asparaginsäure, K: Lysin, Y: Tyrosin).
Agarosen
Für die Versuche wurden vier unterschiedliche Agarosen, welche vom Biolog Life Science Institut zur Verfügung gestellt wurden, eingesetzt.
1. Zyklisches N4-(6-Aminohexyl)- Cytidin-3′,5′-monophosphat, immobilisiert an Agarose-Gel (4-AH-cCMP-Agarose):
Das cCMP wurde über die 4-NH-Gruppe des Pyrimidinrings an die Agarose gekoppelt. Als Linker zwischen den beiden Komponenten fungiert eine Aminohexylgruppe (siehe Abbildung 6a). Die Ligandendichte beträgt circa 6 µmol pro Milliliter Gel. Die restlichen aktiven NHS- Gruppen wurden nach der Kopplung von cCMP mit Ethanolamin umgesetzt.
2. Zyklisches 5-Aminoallyl- Uridin-3′,5′-monophosphat, immobilisiert an Agarose-Gel (5-AA- cUMP-Agarose):
Als Verbindungsgruppe zwischen dem zyklischen Uridinmonophosphat und der Agarose fungiert eine Aminoallylgruppe, welche am fünften Kohlenstoffatom des Pyrimidinrings das Wasserstoffatom substituiert (siehe Abbildung 6b). Auch hier beträgt die Belegungsdichte 6 µmol cUMP pro Milliliter Gel und der Umsatz der restlichen aktiven NHS-Gruppen erfolgte ebenfalls nach der Kopplung von cUMP mit Ethanolamin.
23 3. Zyklisches 2′-O-(6-Aminohexylcarbamoyl)- Adenosin-3′,5′-monophosphat, immobilisiert an Agarose-Gel (2′-AHC-cAMP-Agarose):
cAMP wurde über die 2′-Hydroxygruppe der Ribose an die Agarose gekoppelt. Als Verbindung fungiert eine Aminohexylcarbamoylgruppe (siehe Abbildung 6c). Die Ligandendichte beträgt 6 µmol pro Milliliter Gel.
4. Ethanolamin-Agarose (EtOH-NH-Agarose):
Als Negativkontrolle wurde Ethanolamin-Agarose eingesetzt, um unspezifische Bindungspartner zu identifizieren (siehe Abbildung 6d). Die Ligandendichte dieser Agarose beträgt 20 µmol pro Milliliter Gel.
Abbildung 6: Strukturformeln der verwendeten Agarosen
4-AH-cCMP-Agarose (a), 5-AA-cUMP-Agarose (b), 2′-AHC-cAMP-Agarose (c), Ethanolamin-Agarose (d)
24 Biotin-cNMPs
1. Zyklisches N4-(6-[Biotinyl] aminohexyl)- Cytidin-3′,5′-monophosphat (4-[Biotin]-AH-cCMP):
Die Kopplung von Biotin und cCMP erfolgte analog zur cCMP-Agarose über eine Aminohexylgruppe als Verbindung zwischen den beiden Molekülen. Diese ist am Pyrimidinring von cCMP über die 4-NH-Gruppe gebunden (siehe Abbildung 7a).
2. 5-(3-[Biotinyl] aminoallyl)- Uridin-3′,5′-monophosphat (5-[Biotin]-AA-cUMP):
Auch cUMP wurde über den Pyrimidinring mit Biotin verbunden. Als Linker fungiert eine Aminoallylgruppe, welche sich am fünften Kohlenstoffatom des zyklischen Nukleotids befindet (siehe Abbildung 7b).
Die Biotin-cNMPs wurden mit einer Stoffmenge von 1 µmol zur Verfügung gestellt. Durch Lösen der Festsubstanz in 200 µl destilliertem Wasser wurde eine Stoffmengenkonzentration von 5 mM generiert. Als Kontrolle wurde Biotin der Firma Sigma Aldrich verwendet (500 µM in H2O).
Antikörper Primärantikörper:
Tabelle 6: Bezeichnungen und Verdünnungen der Primärantikörper
Antikörper-Bezeichnung Hersteller Beschreibung α-Tubulin 1:500 (sc-8035) Santa Cruz
Biotechnology
Monoklonaler Maus-Antikörper gegen α-Tubulin
Abbildung 7: Strukturformeln der verwendeten Biotin-gekoppelten zyklischen Nukleotide 4-[Biotin]-AH-cCMP (a) und 5-[Biotin]-AA-cUMP (b)
a) b)
25 Calnexin-Antikörper 1:500
(NB100-1965)
Novus Biologicals Polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der Calnexin erkennt
Calnexin (H70) 1:500 (sc- 11397)
Santa Cruz Biotechnology
Polyklonaler Kaninchen-Antikörper vom Typ IgG, der gegen die ersten 70 Aminosäuren von humanem Calnexin gerichtet ist
c-myc-Antikörper 1:500 (132500)
Thermo Fisher Scientific
Muriner monoklonaler IgG-Antikörper gegen das c-myc-Protein
FLAG-Antikörper
DYKDDDDK-Tag 1:1000 (14793S)
Cell Signaling Monoklonaler Kaninchen-Antikörper, der sich gegen FLAG-Tags mit der Aminosäuresequenz DYKDDDDK richtet
Myomegalin-Antikörper/
Anti-PDE4DIP 1:250 (HPA012678)
Sigma Aldrich Polyklonaler IgG-Antikörper aus dem Kaninchen gegen Myomegalin
NFB p65 1:500 (sc-372) Santa Cruz Biotechnology
Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen NFB p65
PKARIα 1:500 (sc- 136231)
Santa Cruz Biotechnology
Muriner monoklonaler Antikörper, der gegen PKARIα gerichtet ist
PKARIIα 1:500 (sc-908) Santa Cruz Biotechnology
Polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der PKARIIαerkennt
PKG-Antikörper 1:1000 (ADI-KAP-PK005-D)
Enzo Life Sciences Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen die Proteinkinase G
Alle Antikörper wurden in 5 ml 1x Roti®-Block (10x Roti®-Block 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt) mit 5 mM Natrium-Azid angesetzt.
Sekundärantikörper:
Tabelle 7: Bezeichnungen und Verdünnungen der Sekundärantikörper
Antikörper-Bezeichnung Hersteller Beschreibung
„Horse Anti-mouse IgG, HRP- linked Antibody“ 1:2500 (7074S)
Cell Signaling An Meerettichperoxidase gekoppelter IgG-Antikörper aus dem Pferd, der an die Fc-Region von Maus-IgG bindet
26
„Goat Anti-rabbit IgG, HRP- linked Antibody“ 1:2500 (7076S)
Cell Signaling An Meerettichperoxidase gekoppelter IgG-Antikörper aus der Ziege, der an die Fc-Region von Kaninchen-IgG bindet
Die Sekundärantikörper wurden in 20 ml 1x Roti®-Block angesetzt.
Proteinstandard
Als Proteinstandard für SDS-Gelelektrophorese und Western Blot wurde der „PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder“ der Firma Thermo Fisher Scientific für Proteine von 10 bis 250 kDa Molekulargewicht verwendet (siehe Abbildung 8).
Abbildung 8: Verwendeter Proteinstandard für SDS-Gelelektrophorese und Western Blot
„PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder“, 10 bis 250 kDa
27 Zusammensetzung der SDS-Gele für Western Blots
Tabelle 8: Zusammensetzung der SDS-Gele
Bezeichnung Chemikalie 7,5 % (m/v) SDS-Gel
10 % (m/v) SDS-Gel
12,5 % (m/v) SDS-Gel Trenngel 1,5 M TRIS (pH 8,5)
1 % (m/v) SDS
Acrylamid (AA/BisAA mit 15 % (v/v) Glycerol) Destilliertes H2O TEMED
(Tetramethylethylendiamin) 40 % (m/v)
Ammoniumpersulfat (APS)
2,5 ml 1 ml 2,5 ml
4 ml 20 µl
10 µl
2,5 ml 1 ml 3,34 ml
3,16 ml 20 µl
10 µl
2,5 ml 1 ml 4,17 ml
2,33 ml 20 µl
10 µl
Dichtungsgel Trenngel-Mix ohne TEMED und APS
TEMED
40 % (m/v) APS
1 ml
3 µl 3 µl Sammelgel
5 % (m/v)
1 M TRIS (pH 6,8) 1 % (m/v) SDS
Acrylamid (AA/BisAA mit 15 % (v/v) Glycerol) Destilliertes H2O TEMED
40 % (m/v) APS
380 µl 300 µl 500 µl
1,82 ml 7,5 µl 7,5 µl
Computersoftware
Gen5TM Version 2.06 (Mikroplatten-Leser)
GraphPad Prism 6
Image Studio Digits Version 5.2 (Blot-Scanner)
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28 Methoden
Transformation von getaggter cDNA in Top10 E. coli Bakterien
Da in bisherigen Studien kein Nachweis einer Bindung von cCMP oder cUMP an das endogene Protein der zu untersuchenden Bindungspartner (Calnexin, Myomegalin oder Yotiao) gelang, soll die Bindung im Rahmen dieser Arbeit mithilfe von überexprimiertem Protein nachgewiesen werden. Die Proteinüberexpression in den Zellen erfolgte durch transiente Transfektion. Die DNA für die Transfektion wurde durch Transformation von Bakterien mit der entsprechenden Plasmid-DNA hergestellt. Mithilfe der Maxiplasmid- Präparation konnte die DNA anschließend aus den Bakterien isoliert und für die Transfektion eingesetzt werden.
Für die Transformation mit dem Vektor pcDNA 3.1 +-DYK CANX mit Ampicillinresistenz (Calnexin: Originalplasmid der Firma GenScript) wurde das „TransformAidTM Bacterial Transformation Kit“ (Thermo Fisher Scientific) nach Anleitung verwendet. Zunächst wurden die zu transformierenden Bakterien vorbereitet, indem eine Übernachtkultur in C-Medium gemäß dem Protokoll „Preparation of Bacteria from Overnight Bacterial Culture“ hergestellt wurde. Als Bakterienstamm wurden Top10 E. coli-Bakterien eingesetzt. Am nächsten Tag wurde die Transformation mithilfe des Kits durchgeführt. Es wurde eine DNA-Menge von 100 pg verwendet. Die LB-Platten plus Ampicillin wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert und anschließend bei 4 °C aufbewahrt.
Die cDNA der Plasmide für die Proteine Myomegalin und Yotiao sowie für die Yotiao- Konstrukte wurde in chemisch kompetente Zellen transformiert. Bezogen wurde die Myomegalin-DNA ebenfalls von GenScript als Vektor pcDNA 3.1 +-DYK PDE4DIP. Die cDNA des Yotiao-Gens und die cDNA der Yotiao-Fragmente wurden von Frau Prof. Dr. Dessauer (Houston, Texas, USA) zur Verfügung gestellt.
Es wurden 50 µl One Shot® Top10 E. coli-Bakterien (InvitrogenTM) pro Transformationsansatz auf Eis aufgetaut und mit 1 µl DNA (Yotiao: 5 ng/µl, Myomegalin: 1 ng/µl) versetzt. Alle weiteren Schritte erfolgten nach Angaben des Herstellers zur Transformation mittels Hitzeschock. Nach nächtlicher Inkubation der LB-Platten mit Ampicillin wurden diese bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.
Isolation der cDNA aus E. coli
Von den bewachsenen LB-Platten wurden mit einer ausgeglühten Metallöse einzelne Kolonien (1 bis 3) in LB- Medium überimpft, welches wie die Platten mit Ampicillin versetzt war. Zunächst wurde eine Vorkultur in 5 ml LB-Medium mit einer Ampicillin-Konzentration von 0,1 mg/ml angelegt und diese nach 4 bis 6 stündiger Inkubation bei 37 °C und 180 rpm in einen sterilen
29 1000 ml Kolben mit 300 ml LB-Medium und gleicher Ampicillin-Konzentration vollständig übertragen. Am Folgetag wurde die optische Dichte gegen LB-Medium als Referenzlösung bestimmt, um eine möglichst optimale Bakteriendichte vor Zentrifugation und somit eine hohe Plasmidausbeute zu erreichen. Dies ist laut Vorschrift bei einer optischen Dichte von 3 bis 6 mit dem Optimum bei 4 zu erwarten. Bei ausreichender optischer Dichte wurden, um die transformierten Bakterien langfristig aufzubewahren, Glycerolstocks angelegt. Dazu wurde ein Teil der LB-Medium/Bakteriensuspension zu einem gleichen Teil mit Glycerol vermischt und in einem Eppendorfgefäß bei -80 °C eingefroren. Im weiteren Verlauf wurde nach der „Low- copy plasmid purification“-Vorschrift gearbeitet und die Lösungen des „Nucleo Bond® Xtra Maxi Kits“ der Firma MACHEREY-NAGEL für die Maxiplasmidpräparation verwendet. Die pelletierte DNA wurde zuletzt in sterilem, destilliertem Wasser resuspendiert. Je nach Größe der Pellets wurden Volumen von 100 bis 200 µl Wasser eingesetzt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte am NanoDrop Spektralphotometer. Bei Konzentrationen über 4000 ng/µl wurde weiteres Wasser hinzugefügt.
Kultivierung von HEK293- und HeLa-Zellen
Für die Transfektion, die im Folgenden durchgeführt wurde, wurden adhärente HEK293- und HeLa-Zellen kultiviert. Die aus dem Flüssigstickstoff aufgetauten Zellen wurden zunächst in 10 ml Kulturmedium (siehe Abschnitt 2.1.3.) aufgenommen und pelletiert (10 Minuten, RT, 2500 x g), um das zum Einfrieren hinzugefügte DMSO zu eliminieren. Nach Suspendierung der Pellets in 20 ml frischem Medium wurden die Zellen in eine T75cm²-Flasche überführt und bei 37 °C und 5 % (v/v) CO2 bis zum nächsten Passagieren im Brutschrank, dessen Luft mit Wasserdampf gesättigt war, gelagert. Alle 3 bis 4 Tage, wenn der Boden der T75cm²-Flasche zu 80 bis 90 % bewachsen war, wurden die Zellen im Verhältnis 1:20 verdünnt. Dazu wurde das alte Medium abgenommen und die Zellen in 20 ml frischem Kulturmedium durch Klopfen (HEK293) beziehungsweise Abschaben (HeLa) abgelöst. Von der Zellsuspension wurde 1 ml in eine neue Flasche (T75cm²) überführt und auf 20 ml mit Medium aufgefüllt. Zum Aussäen der Zellen in 6-Loch-Platten wurde eine zusätzliche T75cm²- oder T175cm²-Flasche 3 bis 4 Tage vor der Aussaat ebenfalls im Verhältnis 1:20 angesetzt.
Bestimmung der Zellzahl
Die zu transfizierenden HEK293-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion in 6-Loch- Platten mit einer Zellzahl von 4*105 Zellen pro Milliliter in 2 ml Medium pro Loch ausgesät. Bei den HeLa-Zellen wurden 2*105 Zellen pro Milliliter in 2 ml eingesetzt. Zunächst wurde die Zellzahl pro Milliliter bestimmt. Dazu wurden die Zellen einmal mit 10 ml 1x PBS gewaschen.
Anschließend wurden 3 ml Trypsin in die T75cm2-Flasche beziehungsweise 4 ml Trypsin in T175cm2-Flaschen hinzugegeben und durch einmaliges Schwenken über den Zellrasen
30 verteilt. Nach vierminütiger Inkubation im Brutschrank (37 °C, 5 % (v/v) CO2) wurde die Reaktion durch das Trypsin, das heißt die Spaltung extrazellulärer Proteine, durch Zugabe von Kulturmedium (17 ml in T75cm² Flasche und 26 ml in T175cm² Flasche) beendet. Die Zellen konnten im Folgenden leichter abgelöst werden und bildeten weniger Zellhaufen. Zum Auszählen wurden 20 µl der Zellsuspension aus der Flasche entnommen und im Verhältnis 1:2 mit Trypanblau versetzt. Dies diente der Unterscheidung von lebenden und toten Zellen.
Danach wurde die Zellzahl aller lebenden Zellen mithilfe einer „Neubauer improved“- Zählkammer bestimmt und die Menge an Zellsuspension ausgerechnet, die eingesetzt werden muss, um die gewünschte Zellzahl zu erhalten. Zur Bestimmung der Zellzahl pro Milliliter wurde folgende Formel angewendet:
Lebendzellzahl = Zahl der gezählten Lebendzellen
Anzahl der gezählten Großquadrate× Verdünnungsfaktor × Kammerfaktor Der Verdünnungsfaktor betrug in diesem Fall 2, der Kammerfaktor 10.000 pro Milliliter.
Die entnommene Menge an Zellen gemäß der gewünschten Zellzahl wurde so mit Medium aufgefüllt, dass jeweils 2 ml pro Loch eingesetzt werden konnten. Die Zellen wurden bis zur Transfektion 24 Stunden im Brutschrank inkubiert.
Transiente Transfektion von HEK293- und HeLa-Zellen
Um eine Überexpression des gewünschten Proteins, welches für die Bindungsassays eingesetzt werden sollte, zu erhalten, wurden die HEK293- oder HeLa-Zellen mit FLAG- oder myc-getaggter cDNA transient transfiziert. Für die Transfektionen wurde das „K2® Transfection System- Transfection Kit for Mammalian Cells“ von Biontex Laboratories GmbH (München, Deutschland) bestehend aus einem K2® Multiplier und einem K2® Transfektionsreagenz verwendet.
Nachdem unter dem Mikroskop überprüft wurde, ob in den Löchern ein dichter Zellrasen entstanden war, wurden die Zellen zwei Stunden vor Zugabe des DNA-Reagenz-Gemisches mit 20 µl K2® Multiplier pro Loch vorbereitet. Anschließend wurden Lösung A und Lösung B hergestellt. Für Lösung A wurde die isolierte cDNA in serumfreiem Medium verdünnt.
Eingesetzt wurden jeweils 4 µg DNA in 130 µl serumfreiem Medium pro Loch. Lösung B beinhaltete das Transfektionsreagenz, welches ebenfalls in serumfreiem Medium aufgenommen wurde. Das Reagenz wurde im Vergleich zur DNA im Verhältnis 1:4 eingesetzt, also 12 µl Reagenz bei 4 µg DNA in gleicher Menge serumfreiem Medium. Anschließend wurde Lösung A zu Lösung B gegeben und durch einmaliges hoch- und herunterpipettieren gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 15 bis 20 Minuten wurde das Gemisch vollständig zu den Zellen gegeben und die Platte vorsichtig geschwenkt, um die Transfektionslösung
