Basierend auf massenspektrometrischen Messungen in vorherigen Arbeiten wurden die drei Proteine Calnexin, Myomegalin und Yotiao als potentielle Bindungspartner von cCMP und cUMP mithilfe von cCMP- und cUMP-gekoppelten Agarosen identifiziert (116). In dieser Arbeit sollten die drei genannten Proteine als Zielstrukturen überprüft und deren direkte oder indirekte Bindung näher charakterisiert werden. Da der Nachweis der Bindung an das endogene Protein bisher nicht gelang, wurden für diese Arbeit HEK293- und HeLa-Zellen mit den entsprechenden Plasmiden transient transfiziert und affinitätschromatographische Versuche mit Lysaten der protein-überexprimierenden Zellen durchgeführt. Zusätzlich zu den cNMP-Agarosen wurde cCMP- und cUMP-Biotin verwendet, da die Vermutung bestand, dass durch das kleinere Kopplungsmolekül Biotin - verglichen mit den Agarosen - Effekte der sterischen Hinderung verringert werden könnten. Neben Calnexin und Myomegalin wurde auch die Yotiao als kleinste „Splice“-Variante der AKAP9 untersucht.
Die Proteinüberexpression nach transienter Transfektion wurde im Western Blot analysiert.
Dazu wurden jeweils 100 µg Protein zur Gelelektrophorese eingesetzt und die Inkubationszeiten für 24 und 48 Stunden verglichen. Für alle drei zu untersuchenden Bindungspartner Calnexin, Myomegalin und Yotiao konnte die Überexpression im Western Blot dargestellt werden. Nach 48 Stunden war keine wesentlich stärkere Proteinexpression als nach 24 Stunden sichtbar, weshalb 24 Stunden als Inkubationszeit für die Transfektion gewählt wurde.
Calnexin:
Das Vorhandensein einer Bindung zwischen Calnexin und cCMP beziehungsweise cUMP wurde mithilfe von cCMP- und cUMP-gekoppelten Agarosen überprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Bindung zwischen Calnexin und den genannten zyklischen Pyrimidinnukleotiden mit dieser Methode nicht verifiziert und Calnexin somit als Bindungspartner nicht bestätigt werden konnte (siehe Abbildung 16). Bezüglich der Methode ist jedoch kritisch anzumerken, dass die Agarosen sehr große Moleküle sind, da sie als Biopolymere ausD-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose bestehen. So wird möglicherweise die Interaktion der Bindungspartner erschwert. Je nachdem, wo sich die Bindungsstelle an cCMP oder cUMP befindet, ist diese durch sterische Hinderung nicht zu erreichen. Die Versuche wurden allerdings analog mit Biotin-gekoppeltem cCMP beziehungsweise cUMP, welches jeweils an Strep-Tactin®-Gel gebunden wurde, wiederholt (siehe Abbildung 28). Durch diese Kopplung wurde versucht den Effekt der sterischen Hinderung zu minimieren, da Biotin ein kleineres Kopplungsmolekül darstellt als die Agarosen. In Vorversuchen wurde überprüft, wann die Kopplung des Biotins an das Strep-Tactin®-Gel zu guten Ergebnissen führt. Eine
63 Kopplung des Strep-Tactin®-Gels an cCMP- und cUMP-Biotin vor Hinzufügen des zu untersuchenden Bindungspartners stellte sich als besserer Ansatz heraus als das Fischen des gesamten Komplexes nach Bindung von cCMP oder cUMP an ein Protein.
Die Demonstration der Überexpression, gezeigt in den Input-Laufspuren, diente dem Ausschluss eines Fehlers im Transfektionsvorgang. Der PKARI-Antikörper wurde verwendet, um den Versuch zu überprüfen, da die RI-Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase A ein bereits identifizierter Bindungspartner von cCMP und cUMP ist und mit dieser Methode erfolgreich identifiziert werden konnte (54, 69). Allerdings konnte Calnexin mit keinem der beiden Ansätze (Agarosen und Biotin) als cCMP- oder cUMP-bindendes Protein bestätigt werden.
Myomegalin:
Die Western Blot-Ergebnisse der Bindungsversuche mit Myomegalin-überexprimierenden Zellen zeigten eine Bindung von Myomegalin an cCMP-Agarose (siehe Abbildung 17, Laufspur 6). Diese Bindung wurde auch in untransfizierten Zellen nachgewiesen, allerdings erscheint die Bande hier schmaler als alle anderen Banden (Laufspur 4). Der Einsatz des FLAG-Antikörpers zum Nachweis detektiert den FLAG-Tag des überexprimierten Myomegalins in den transient transfizierten Zellen. Mit dem Lysat der untransfizierten Zellen sollte deshalb gar keine Bande generiert werden können, da es den FLAG-Tag nicht enthält. Deshalb muss in Betracht gezogen werden, dass ein Teil des Zellextrakts aus der Input-Laufspur mit den Myomegalin-überexprimierenden Zellen beim Auftragen in die Taschen des Gels in die Nachbartasche mit den Proben der untransfizierten Zellen (siehe Abbildung 17, Laufspur 3 und 4) gelaufen war. Des Weiteren ist anzumerken, dass die Bande des Kompetitions-Ansatzes (Laufspur 7), zu dem freies cCMP hinzugefügt wurde, stärker ist als die Bande, die die Bindung von Myomegalin an die cCMP-Agarose zeigen sollte. Das bedeutet, dass die Bindung von Myomegalin an cCMP-Agarose unspezifisch ist, da freies cCMP nicht in der Lage war um Myomegalin zu kompetitieren. Der unspezifische Charakter der Bindung wurde auch dadurch gezeigt, dass eine Bindung von Myomegalin zur Ethanolamin-Agarose detektierbar war (Laufspur 8). Zusammenfassend ist also festzuhalten, dass Myomegalin unspezifisch an die Agarosen bindet und diese Ergebnisse somit unabhängig überprüft werden sollten, um Myomegalin als Bindungspartner definitiv auszuschließen oder zu bestätigen.
Zudem kann mit den durchgeführten Versuchen nicht zwischen einer direkten Bindung von Myomegalin an die Agarosen oder die zyklischen Nukleotide oder einer indirekten Bindung durch Bildung eines Multiproteinkomplexes mit Beteiligung unbekannter Kopplungsmoleküle unterschieden werden. Die für die Versuche eingesetzten Lysate enthalten endogene
64 Proteine, die ebenfalls an der Bindung beteiligt sein könnten. Versuche mit cUMP-gekoppelter Agarose und Myomegalin wurden nicht durchgeführt, jedoch wurde cCMP- und cUMP-gekoppeltes Biotin verwendet. Myomegalin ist mit 130 kDa im Gegensatz zu Calnexin (90 kDa) ein größeres Molekül und würde dadurch mehr sterische Hinderung erfahren. Allerdings hat es auch mehr Bindungsoptionen. Der Einsatz der Biotin-gekoppelten zyklischen Nukleotide zeigte für cCMP ein vergleichbares Ergebnis zu den Agaroseversuchen: Eine Bindung konnte nicht nur zum cCMP-Biotin detektiert werden, sondern auch an reines Biotin und sogar an das Strep-Tactin®-Gel, an das Biotin und die Biotin-gekoppelten zyklischen Nukleotide gebunden wurden (siehe Abbildung 29). Mit cUMP zeigte sich ebenfalls eine unspezifische Bindung und keine Kompetition. Versuche mit rekombinantem Protein könnten zur Klärung der Bindungseigenschaften beitragen und Aufschluss über die mögliche Bildung von Multiproteinkomplexen geben. Es sollten dazu keine anderen endogenen Proteine im Probenansatz enthalten sein, die die Bildung eines Komplexes mit Myomegalin und den gekoppelten zyklischen Nukleotiden fördern könnten.
Yotiao:
Als weiteres mögliches cCMP- oder cUMP-bindendes Protein wurde die Yotiao, kleinste
„Splice“-Variante der AKAP9, untersucht, weil sie als putatives Targetmolekül in proteomischen Analysen detektiert wurde. Analog zu Calnexin und Myomegalin wurden zunächst cCMP- und cUMP-Agarosen eingesetzt. In den Untersuchungen der nicht-kanonischen zyklischen Pyrimidinnukleotide hinsichtlich der Bindung an die Yotiao wurden folgende Ergebnisse erzielt: Sowohl für cCMP als auch für cUMP wurde Yotiao als Bindungspartner mit der Affinitätschromatographie identifiziert (siehe Abbildung 18, Laufspur 4 und 7). Die Spezifität der Bindung wurde insofern nachgewiesen, als dass das freie cCMP beziehungsweise cUMP stärker an die Yotiao gebunden hat, als die an die Agarose-gekoppelten zyklischen Nukleotide. Die freien Substanzen kompetitierten um ihre Bindungsstelle an der Yotiao mit cCMP-Agarose vollständig und mit cUMP-Agarose unvollständig. Die Negativkontrolle mit Ethanolamin-Agarose zeigte eine schwache Bande, die im unspezifischen Hintergrundsignal kaum sichtbar war (Laufspur 9). Da freies cCMP um die Bindungsstelle an der Yotiao vollständig kompetitierte, kann zumindest für cCMP von einer spezifischen Bindung ausgegangen werden. Durch die Erhöhung der freien cUMP-Konzentration von 2 mM auf beispielsweise 3 mM kann möglicherweise eine vollständige Kompetition erreicht werden. Mithilfe des PKARI-Antikörpers konnte eine erfolgreiche Durchführung gezeigt werden, da bei den Kompetitions-Ansätzen und der Negativkontrolle deutlich abgeschwächte Banden sichtbar wurden. Um das Ergebnis zu überprüfen, wurden die Biotin-gekoppelten zyklischen Nukleotide eingesetzt. Mit dem von Gundlach et al.
65 verwendeten Bindungspuffer für den Biotin-Assay (117) mit Magnesiumchlorid konnte keine Bindung nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht dargestellt). Deshalb wurden Mangan(II)chlorid als anderes Salz im Puffer und der Triton-Lysepuffer, der für die Agarose-Versuche verwendet wurde, überprüft. Der Einsatz der verschiedenen Puffer erfolgte zunächst für cCMP-Biotin (siehe Abbildung 30). Es stellte sich heraus, dass der Triton-Lysepuffer bessere Ergebnisse erzielte, als der Puffer für den Biotin-Assay, auch wenn eine schwache Bande durch den Austausch des Salzes von Magnesiumchlorid zu Mangan(II)chlorid detektiert werden konnte. Deshalb wurde für alle weiteren Versuche der Triton-Lysepuffer für die Biotin-Assays eingesetzt. Allerdings sollte die Anzahl aller Bindungsversuche zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöht werden. Dies war aus zeitlichen Gründen nicht möglich.
Mithilfe der Bindungsversuche können Bindungspartner identifiziert werden. Allerdings kann nicht unterschieden werden, ob es sich um eine direkte oder indirekte Bindung handelt. Wie bereits bei Myomegalin beschrieben, kann es durch die vorhandenen endogenen Proteine im Lysat zur Bildung von Multiproteinkomplexen kommen. Die Beteiligung eines unbekannten Kopplungspartners an der Bindung muss in weiterführenden Versuchen zum Beispiel durch den Einsatz von rekombinanter Yotiao überprüft werden um die Bindung als direkt oder indirekt klassifizieren zu können.
Die Eingrenzung der Bindungsdomäne erfolgte durch die Verwendung verschiedener Yotiao-Konstrukte (siehe Abbildung 12). Konstrukt B, welches den N-terminalen Bereich (1 bis 958) umfasst, zeigte keine Interaktion mit den eingesetzten zyklischen Pyrimidinnukleotiden, sodass die Bindungsdomäne im C-terminalen Bereich liegen muss (siehe Abbildung 19). Dies bestätigte der Einsatz des Konstrukts D (808 bis 1645), das die gleichen Banden wie die „full length“-Variante zeigte (siehe Abbildung 20). Diese Ergebnisse wurden mithilfe von cCMP- und cUMP-Biotin verifiziert, wobei mit dem PKARI-Antikörper nur für cCMP-Biotin eine Bindung an die PKARI-Untereinheit nachgewiesen werden konnte (siehe Abbildung 31).
Möglicherweise wird auch ein Komplex zwischen der Yotiao, cCMP und der PKARII-Untereinheit gebildet. Denn PKARII ist eine bereits identifizierte Zielstruktur von cCMP und geht außerdem eine Bindung mit der Yotiao ein (9, 98). Diese Vermutung wurde jedoch durch den Einsatz des Konstrukts C (953 bis 1171) eingeschränkt (siehe Abbildung 22). Die PKA-Bindungsdomäne liegt im C-terminalen Bereich der Yotiao und umfasst die Aminosäuren 1452 bis 1469 (110). Das heißt, dass die nachgewiesene Bindung zwischen cCMP- oder cUMP-Agarose und Konstrukt C über eine andere Bindungsdomäne vermittelt werden muss.
Trotzdem könnte das „full length“-Konstrukt eine zweite Bindung über die Proteinkinase A eingehen, sodass weiterhin untersucht werden sollte, ob diese zweite Bindungsdomäne
66 existiert. Dazu kann der PKA-Inhibitor Ht31 verwendet werden, der die Interaktion zwischen AKAPs und der RII-Untereinheit der PKA inhibiert (104). Da die Yotiao eine RII-spezifische AKAP ist und somit an die RII-Untereinheit der Proteinkinase A bindet, kann durch Ht31 eine Inhibition der Bindung an die Proteinkinase A hervorgerufen werden (118). Eine andere Möglichkeit für weitergehende Experimente, die in Zukunft durchgeführt werden müssen, wäre ein Konstrukt zu erstellen, welches den C-terminalen Teil der Yotiao umfasst, jedoch die Aminosäuresequenz des Konstrukts C ausschließt (zum Beispiel Yotiao 1172 bis 1645). Um konkret die PKA-Domäne als Vermittler der Bindung auszugrenzen, sollte in zukünftigen Versuchsansätzen zudem ein Konstrukt zum Einsatz kommen, in dem die PKA-Bindungsdomäne deletiert ist (Yotiao 1 bis 1645 PKA 1452 bis 1469, siehe Abbildung 36).
Ein anderer Ansatz, um die Spezifität der Bindung zu überprüfen, war die Kompetition mit cAMP. Die Zugabe von cAMP führte sowohl mit cCMP-Agarose als auch mit cUMP-Agarose zur vollständigen Kompetition, da cAMP stärker an die Yotiao als die cNMP-Agarosen gebunden hat (siehe Abbildung 23 und Abbildung 24). Das lässt vermuten, dass cAMP möglicherweise über den gleichen indirekten Bindungspartner mit der Yotiao interagiert wie cCMP und cUMP. Durch die Verwendung der zwei unterschiedlichen PKA-Antikörper (-PKARI und -PKARII) mit cUMP-Agarose und des -PKARI für cCMP-Agarose konnte jeweils eine vollständige Kompetition der zyklischen Pyrimidinnukleotid-Agarosen durch cAMP nachgewiesen werden, wohingegen die cUMP-Agarose von den beiden PKA-Untereinheiten durch freies cUMP nur unvollständig verdrängt wurde. Freies cCMP führte zur vollständigen Kompetition an der PKARI-Untereinheit. Die Tatsache, dass cCMP und cUMP wenig potente Aktivatoren der beiden PKA-Untereinheiten sind, könnte eine Erklärung für die unvollständige Kompetition sein. Möglicherweise war die Konzentration mit 2 mM nicht hoch genug, um eine vollständige Kompetition zu erreichen, da die beiden nicht-kanonischen „second messenger“
vollständige Aktivatoren der Proteinkinase A sind (9).
Um die zum Teil auftretenden Banden mit der Ethanolamin-Agarose als Negativkontrolle zu untersuchen (siehe Abbildung 18 und Abbildung 21), wurden Folgeversuche mit dieser Agarose und dem PKARII-Antikörper durchgeführt (siehe Abbildung 26 und Abbildung 27).
Hierbei waren Bindungen an Ethanolamin-Agarose detektierbar, die sich durch keins der eingesetzten zyklischen Nukleotide kompetitieren ließen. Dies spricht dafür, dass es sich hierbei um unspezifische Bindungen handelt, da mit der PKARIIbei spezifischer Interaktion als Bindungspartner aller verwendeten zyklischen Nukleotide eine Kompetition hätte erfolgen müssen. Im Vergleich dazu wurde cAMP-Agarose eingesetzt, mit der eine Bindung von cAMP an die endogene PKARIIstattgefunden hat, die mit freiem cAMP kompetitierbar war. Das zeigt, dass der Versuch korrekt durchgeführt wurde. Durch Modifizierung des
Triton-67 Lysepuffers im Sinne eines Austauschs des alten Triton® x-100 durch ein neues Produkt konnten die unspezifischen Bindungen der Ethanolamin-Agarose minimiert werden (siehe Abbildung 27). Es muss davon ausgegangen werden, dass das Detergens möglicherweise degeneriert war und somit unspezifische Proteine unzureichend entfernt und im Western Blot detektiert werden konnten. Die Überprüfung des Puffers durch neuwertiges Triton® x-100 fand erst nach Abschluss der in dieser Arbeit demonstrierten Bindungsassays statt.
Da in der Literatur die Bindung der Proteinkinase A an AKAPs und von cAMP an die PKA beschrieben wird, wurden ebenfalls cAMP-gekoppelte Agarose in Kombination mit Yotiao-überexprimierenden Zellen eingesetzt, um mit der affinitätschromatographischen Methode diesen Komplex (Yotiao-PKA-cAMP) nachzuweisen (98). Wie erwartet wurde im Western Blot eine spezifische Bindung von Yotiao an cAMP-Agarose detektiert, die durch freies cAMP kompetitiert wurde (siehe Abbildung 25, Laufspur 4 und 5). Der PKARII-Antikörper zeigte eine Bindung von cAMP an die genannte Untereinheit der Proteinkinase A mit Kompetition durch freies cAMP.
Durch den beschriebenen Versuch mit cAMP könnte der Komplex aus cAMP-Agarose, endogener PKARII und Yotiao nachgewiesen worden sein, sodass keine direkte Bindung von der Yotiao an cAMP stattfand. Eine weitere Möglichkeit wäre ebenso die Vermittlung der Bindung über einen unbekannten Bindungspartner. Um die Bildung eines Komplexes zu verhindern und die Beteiligung unbekannter Moleküle an der Bindung auszuschließen, müsste in den Versuchsansätzen das native zu untersuchende Protein, zum Beispiel rekombinant hergestellt, verwendet werden und nicht das vollständige Zelllysat. Gegen die Bildung eines Komplexes spricht, dass cAMP die Bindung zwischen Yotiao und cCMP- oder cUMP-Agarose erfolgreich kompetitieren konnte und somit möglicherweise die gleiche Bindungsstelle an der Yotiao einnimmt (siehe Abbildung 23 und Abbildung 24). Es könnte jedoch auch ein unbekannter Kopplungspartner an der Bindung beteiligt sein, der sowohl eine Bindung mit cCMP/cUMP als auch mit cAMP eingeht und die Bindung deshalb erfolgreich durch cAMP kompetitiert werden kann (siehe Abbildung 35). Es konnte zudem eine Bindung zwischen cCMP oder cUMP und einem Konstrukt der Yotiao nachgewiesen werden, welches die PKA-Bindungsdomäne nicht enthält (Konstrukt C, siehe Abbildung 22), sodass cCMP oder cUMP nicht nur über die PKA mit der Yotiao interagieren (siehe Abbildung 33). Das deutet darauf hin, dass es zwei Bindungsdomänen geben könnte, wobei eine Bindung über die PKA vermittelt wird und hier die Kompetition erfolgte. Deshalb ist es wichtig, wie bereits oben beschrieben, das Vorhandensein einer zweiten Bindungsdomäne an der Yotiao, zum Beispiel mit dem PKA-Inhibitor Ht31, zu überprüfen. Außerdem könnte der Einsatz der cAMP-Agarose in Kombination mit dem mittleren Konstrukt C Aufschluss darüber geben, ob auch cAMP mit
68 diesem Fragment eine Bindung eingeht. Auch hier müsste man jedoch ein rekombinant hergestelltes Konstrukt verwenden, um die alleinige direkte Interaktion zwischen dem zyklischen Nukleotid und der Yotiao zu gewährleisten. Des Weiteren wäre es hilfreich die Sequenz des Konstrukts C zu analysieren, um mögliche Bindungsmotive zu identifizieren. Die Sequenz sollte in Datenbanken und mit anderen Proteinen auf Homologie verglichen werden.
Ein weiterer Ansatz in der Charakterisierung der Bindung sollte der Nachweis der endogenen Yotiao sein und anschließend die Charakterisierung der Bindung von cCMP und cUMP an das endogene Protein. Dazu wurde mittels qRT-PCR die Genexpression des Yotiao-Gens mithilfe von genspezifischen TaqMan-Primern untersucht. Die bereits verwendeten HEK293-Zellen ergaben die höchste Yotiao-Genexpression, sodass diese Zelllinie auch für den Bindungsnachweis von cCMP und cUMP an die endogene Yotiao genutzt werden sollte.
cCMP und cUMP konnte bisher noch keine eindeutige physiologische Funktion zugeschrieben werden. Als eine Funktion von cCMP wurde ein Effekt im kardiovaskulären System auf die Relaxation glatter Gefäßmuskulatur beschrieben sowie eine inhibitorische Komponente bei der Thrombozytenaggregation (50). Auch die Yotiao entfaltet ihre Funktion im kardiovaskulären System, indem sie die Phosphorylierung der Kaliumkanal-Untereinheit KCNQ1 über die Proteinkinase A unterstützt (siehe Abbildung 34). Diese ist vor allem bei steigender Herzfrequenz für eine schnellere Repolarisation notwendig und kann durch eine Mutation in der Yotiao oder dem Kanal gestört sein. Infolgedessen kann es zum Long-QT-Syndrom kommen, welches im schlimmsten Fall mit dem plötzlichen Herztod endet (108, 112). Durch die Interaktion der Yotiao mit cCMP und cUMP wäre somit auch eine pathophysiologische Relevanz von cCMP und cUMP in Kardiomyozyten denkbar. Die Bindung über die PKA könnte
Yotiao, Konstrukt C (Yot C) 953-1171
PP1
myc-TagNR1
Yotiao, Konstrukt D (Yot D) 808-1645
PKABindungsdomäne:
1452-1469 PP1
myc-Tag NR1
Yotiao „full length“
(Yot FL) 1-1645
PKABindungsdomäne:
1452-1469 IP3R
myc-Tag NR1
PP1
Abbildung 33: Zusammenfassung der Yotiao-Konstrukte, an die cCMP und cUMP gebunden haben
Mithilfe der Affinitätschromatographie konnte eine Interaktion zwischen cCMP-/cUMP-Agarose und den dargestellten Konstrukten im Western Blot nachgewiesen werden.
69 einerseits eine mögliche Aktivierung dieser bewirken und damit einen Beitrag zur Phosphorylierung des Kanals darstellen. Andererseits könnte die PKA-Interaktion mit cAMP durch Bindung von cCMP und cUMP gestört sein und in einer verminderten Phosphorylierung des Kanals resultieren, die eine Ursache des Long-QT-Syndroms ist.
Yotiao KCNQ1
= cAMP
= cCMP
? unbekannter
Kopplungspartner?
Abbildung 35: Modell der Interaktion der Yotiao mit einem unbekannten Kopplungspartner am KCNQ1-Kanal Dargestellt ist die Bindung der Yotiao an den KCNQ1-Kanal und an einen unbekannten Kopplungspartner. Die Bindung von cAMP oder cCMP an die Yotiao könnte indirekt über ein bisher noch nicht identifiziertes Molekül stattfinden. Ähnliche Überlegungen können zu cUMP in Betracht gezogen werden. Grafik modifiziert nach Michel und Scott, 2002.
Yotiao KCNQ1
C C
= cAMP
= cCMP
P P
PKA
Abbildung 34: Modell der Interaktion der Yotiao mit der PKA am KCNQ1-Kanal
Dargestellt ist die Bindung der Yotiao an den KCNQ1-Kanal und an die Proteinkinase A. Nach Bindung von cAMP oder cCMP kommt es zur Aktivierung der PKA mit Freisetzung der katalytischen Untereinheiten (9). Dies führt zur Phosphorylierung des KCNQ1-Kanals. Ähnliche Überlegungen können zu cUMP in Betracht gezogen werden.
Grafik modifiziert nach Michel und Scott, 2002.
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