Immunhistologische Untersuchung ausgewählter Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und deren Inhibitoren in der neoplastisch veränderten Mamma und den assoziierten Lymphknoten von Hunden

(1)

(2)

(3)

(4)

Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen

Nationalbibliografie;

Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.

1. Auflage 2012

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-0

Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17

35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net

www.dvg.net 83-0

(5)

Tierärztliche Hochschule Hannover

Immunhistologische Untersuchung ausgewählter Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und deren Inhibitoren in der neoplastisch veränderten Mamma und den assoziierten Lymphknoten

von Hunden

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

Vorgelegt von

Julia Bornbaum aus Böblingen

Hannover 2012

(6)

Wissenschaftliche Betreuung: Priv. Doz. Dr. Susanne Alldinger Institut für Pathologie

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachterin: Priv. Doz. Dr. Susanne Alldinger 2. Gutachter/in: Prof. Dr. R. Mischke

Tag der mündlichen Prüfung: 25.5.2012

(7)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ...3

2 Literaturübersicht...5

2.1 Kanine Mammatumoren ...5

2.1.1 Morphologischer Aufbau der physiologischen kaninen Mamma... 5

2.1.2 Hämatogene und lymphogene Versorgung der physiologischen kaninen Mamma... 5

2.1.3 Epidemiologie kaniner Mammatumoren... 6

2.1.4 Ätiologie und Pathogenese kaniner und humaner Mammatumoren... 7

2.1.5 Pathologie kaniner Mammatumoren ... 9

2.2 Die extrazelluläre Matrix (EZM) ...14

2.3 Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und ihre Inhibitoren (TIMPs)...15

2.3.1 Klassifikation, Funktion und Struktur...15

2.3.2 Regulation der MMPs ...17

2.3.3 Substrate der MMPs...20

2.3.4 MMPs und Tumoren ...20

2.3.5 Ausgewählte MMPs und TIMPs...24

3 Material und Methoden ...38

3.1 Untersuchte Tiere ...38

3.2 Untersuchungsmaterial für die histologische und immunhistologische Auswertung ...39

3.2.1 HE-Übersichtsfärbung ...39

3.3 Immunhistologie ...39

3.3.1 Antikörper und Seren...39

3.3.2 Immunhistochemisches Färbeprotokoll (ABC-Methode) ...41

3.3.3 Kontrollen ...43

3.4 Diagnose, Auswertung und statistische Aufarbeitung...44

4 Ergebnisse ...49

4.1 Ergebnisse der histologischen Befunderhebung ...49

4.2 Ergebnisse der immunhistologischen Befunderhebung ...51

4.2.1 MMP-7...51

4.2.2 MMP-11...69

4.2.3 MMP-12...91

4.2.4 TIMP-3 ...111

5 Diskussion ...127

5.1 Immunhistologischer Nachweis von MMP-7 ...127

(8)

5.4 Immunhistologischer Nachweis von TIMP-3...149

6 Zusammenfassung...155

7 Summary ...159

8 Fotodokumentation ...162

8.1 MMP-7-Expression in den Untersuchungsgruppen ...162

8.4 TIMP-3-Expression in den Untersuchungsgruppen ...171

9 Literaturverzeichnis ...175

10 Anhang ...198

10.1 Untersuchtes Tiermaterial ...198

10.2 Immunhistologische „Scores“ aller untersuchten Antikörper...205

10.2.1MMP-7 „Scores“ in den Untersuchungsgruppen ...205

10.2.4TIMP-3 „Scores“ in den Untersuchungsgruppen...223

10.3 Statistische Daten...229

10.3.1Median, Min., Max. für MMP-7...229

10.3.4Median, Min., Max. für TIMP-3 ...240

10.4 p-Werttabellen ...245

10.4.1p-Werte für MMP-7 ...246

10.4.2p-Werte für MMP-11 ...251

10.4.3p-Werte für MMP-12 ...259

10.4.4p-Werte für TIMP-3...267

10.5 Lösungen und Puffer ...275

10.6 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper...276

10.6.1Antikörper und Seren...276

10.6.2Chemikalien...276

10.7 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel ...278

10.8 Abkürzungsverzeichnis...280

11 Danksagung...282

(9)

Einleitung 3

1 Einleitung

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit einer der häufigsten Neoplasien der Hündin:

dem Tumor des Mammadrüsengewebes (BOMHARD et al., 2001; BOSTEDT, 1995;

BOSTOCK, 1986; BRODEY et al., 1983). Diese Mammatumoren zeigen eine große Vielfalt in ihrer Morphologie und Differenzierung und dementsprechend auch unterschiedliche Dignitäten. Eine histologische Untersuchung von exzidiertem Tumorgewebe ist für die Diagnostik und die Dignitätsaussage notwendig. Während über die Pathogenese der Tumorentstehung, deren Progression, Invasion und das Metastasierungsverhalten beim Hund nur wenige Daten vorliegen, gibt es in der Humanmedizin zahlreiche Publikationen über den Zusammenhang oben genannter pathologischer Vorgänge mit Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und ihren Inhibitoren, den „ Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinases“ (TIMPs). Diese Enzyme sind beim Menschen eindeutig mit dem Auftreten von Brusttumoren, deren Wachstum und Differenzierung, sowie der Prognose und der Gesamtüberlebenszeit korreliert (BOURGUIGNON, 2001; GARCIA et al., 2010; STAMENKOVIC, 2003).

MMPs sind eine Familie zinkabhängiger Endopeptidasen, die neben Einflussnahme auf zahlreiche physiologische Vorgänge, wie z. B. Zellproliferation und –migration während der Organogenese, sowie Differenzierung und „Remodelling“ der extrazellulären Matrix auch die Entstehung von Tumoren begünstigen können (CHANG und WERB, 2001). Besonders beim Invasions- und Metastasierungsverhalten wird MMPs und ihren Inhibitoren eine wichtige Bedeutung zugesprochen.

Zahlreiche Untersuchungen in der Humanmedizin belegen die vielfältige Beteiligung von MMP-7, MMP-11, MMP-12 und TIMP-3 an physiologischen und pathologischen Prozessen beim Menschen. Sie und andere MMPs werden nun als Schlüsselregulatoren vielfältiger zellulärer Funktionen gesehen, wie der Reifung und Aktivierung verschiedener Substrate, sowie deren Inaktivierung und Abbau (CAUWE et al., 2007). Auch ihr Auftreten und Einfluss auf Brusttumoren wurde vielfältig untersucht (CHENG et al., 2010; HUGHES et al., 2007; JIANG et al., 2005;

PETERSON et al., 2009; WANG und TETU, 2002). Untersuchungen bei Mammatumoren der Hündin auf MMPs und ihre Inhibitoren sind nur vereinzelt zu finden (PALTIAN, 2006) und es liegt keine Arbeit vor, die die Expression der vier

(10)

genannten Enzyme in verschiedenen mammären Tumorarten der Hündin gegenüberstellt. Dies soll in der vorliegenden Arbeit geschehen.

Diese Dissertation untersucht die Expression von MMP-7, MMP-11, MMP-12 und eines Inhibitors, des TIMP-3, in benignen und malignen Mammatumoren und den assoziierten Lymphknoten der Hündin. Zusätzlich werden auch hyperplastische Drüsengewebe und Kontrollgewebe von gesunden Tieren auf die Expression dieser Enzyme untersucht. Dadurch werden Aussagen über Korrelationen von Expressionsmustern einzelner MMPs, beziehungsweise TIMPs und dem Krankheitsverlauf bei Gesäugetumoren der Hündin erwartet. Möglicherweise stellen MMPs und TIMPs prognostische Marker für die Dignität und das Wachstumsverhalten verschiedener mammärer Tumorarten der Hündin dar.

(11)

Literaturübersicht 5

2 Literaturübersicht

2.1 Kanine Mammatumoren

2.1.1 Morphologischer Aufbau der physiologischen kaninen Mamma Anatomie und Histologie der Mamma

Entlang der ventralen Bauchwand des Hundes liegt die Gesäugeleiste, bilateral bestehend aus fünf, manchmal auch vier oder sechs Drüsenkomplexen. Die Milchdrüse stellt eine zusammengesetzte, modifizierte, apokrine Hautanhangsdrüse dar, eingebettet in Fettgewebe und fibrovaskuläres Stroma von tubulo-alveolärem Aufbau. Sie setzt sich aus dem sogenannten Drüsenkörper (Corpus mammae) und der Eversionszitze (Papilla mammae) zusammen. Es kann zwischen milchbildenden und milchableitenden Teilen unterschieden werden. Die in die Alveolen sezernierte Milch wird über die Ducti lactiferi und dann über größere Milchgänge zur Milchzisterne (Sinus lactiferi) geleitet. Von dort gelangt sie über sechs bis 20 Strichkanäle (Ductuli lactiferi) zu den Öffnungen (Ostia papillaria) auf der Zitze.

Produziert wird die Milch in einem einschichtigen, je nach Füllungsgrad der Alveole flachen, kubischen oder auch hochprismatischen Epithel, das peripher von einer Schicht Myoepithelien umgeben wird. Diese sind in der Lage, bei Oxytozinausschüttung ihre Myofilamente zu kontrahieren und somit eine Verengung der Alveole zu bewirken. Den myoepithelialen Zellen folgt eine außen anliegende Basalmembran. Auch die Milchgänge sind peripher locker von Myoepithel umschlossen, um den gerichteten Milchabfluss zu ermöglichen (CHRISTENSEN, 1979; HABERMEHL, 1996; MANN, 1984);

2.1.2 Hämatogene und lymphogene Versorgung der physiologischen kaninen Mamma

Die kanine Gesäugeleiste wird über die A. thoracica interna, sowie die Aa.

intercostales, die A. epigastricacranialis superficialis, die A. epigastrica cranialis superficialis, die A. epigastrica caudalis superficialis, die A. abdominalis cranialis und den Ramus labialis ventralis der A. pudenda externa mit Blut versorgt. Der venöse Rückfluß der drei kranialen Komplexe erfolgt über die Vv. perforantes oder die V.

(12)

epigastrica cranialis superficialis in die V. thoracica interna zur V. cava cranialis. Das Blut der kaudal gelegenen drei Komplexe wird über die V. epigastrica caudalis superficialis in die V. pudenda externa geleitet. Von dort fließt es über die V.

pudendoepigastrica, die V. iliaca externa und die V. iliaca communis zur V. cava caudalis (MICHEL, 1994; WAIBL et al., 1996).

Der Lymphabfluss der beiden kranialen Gesäugekomplexe erfolgt bilateral symmetrisch über die Lymphknoten Nl. axillaris proprius und Nl. axillaris accessorius des Lymphocentrum axillare zum Truncus jugularis und zum Ductus thoracicus oder direkt in den Venenwinkel und in den kranialen Sternallymphknoten (Nl. sternalis cranialis). Der dritte Gesäugekomplex kann entweder über diesen Weg seine Lymphe abführen, oder an die beiden kaudalen Komplexe angeschlossen sein, die ihre Lymphe über die Nll. Inguinales superficiales des Lymphocentrum inguinale superficiale in die Nll. iliaci mediales und die Nll. lumbales aortici abführen. Von dort gelangt die Lymphe in den Truncus lumbalis, dann in die Cysterna chyli und schließlich in den Ductus thoracicus. Zwischen kranialem und kaudalem Lymphabfluss bestehen Anastomosen (CHRISTENSEN, 1979; MICHEL, 1994;

VOLLMERHAUS, 1996).

2.1.3 Epidemiologie kaniner Mammatumoren

Neben Hauttumoren zählen Mammatumoren zu den häufigsten neoplastischen Erkrankungen der Hündin (BOMHARD et al., 2001; BOSTEDT, 1995; BOSTOCK, 1986; BRODEY et al., 1983; GUTBERLET et al., 1998; RAVIKUMAR et al., 2000).

Aufgrund unterschiedlich zusammengesetzter Untersuchungsgruppen und der morphologischen Untersuchung nur eines Teils der exzidierten Tumoren ist eine tatsächliche Häufigkeit nur schwer einschätzbar (RUTTEMAN, 2005). Beim Rüden ist die Mammatumorerkrankung jedoch äußerst selten und die Inzidenz wird auf 0,4 bis 2,7 % geschätzt (BOSTEDT, 1995; ESKENS, 1983; FRESE et al., 1989;

RUTTEMAN, 2005). Die Wahrscheinlichkeit an einem Mammatumor zu erkranken, ist für die Hündin etwa zweiundsechzigmal wahrscheinlicher als für den Rüden. Beim männlichen Hund sind die Mammatumoren selten und für gewöhnlich gutartig (SABA et al., 2007). Hunde mit malignen Veränderungen sind signifikant älter als Hunde mit benignen Tumoren (SORENMO et al., 2009). Auch sind bösartige Tumoren größer und in 66 % der Fälle treten multiple neoplastische Veränderungen an der Gesäugeleiste auf (SORENMO et al., 2009). Das Durchschnittsalter betroffener Tiere

(13)

beträgt 9,5 Jahre (BOMHARD et al., 2001; BOSTEDT, 1995; DAHME und WEISS, 1958; GUTBERLET et al., 1998; SIMON et al., 2001; SORENMO et al., 2009).

Obwohl kleine Rassen wie Dackel, Terrier und Spaniels etwas häufiger erkranken, wurden klare Rassendispositionen nicht eindeutig beschrieben (RUTTEMAN, 2005).

Große Rassen sind von Mammatumoren seltener betroffen; Literaturangaben über Boxer, Deutsche Schäferhunde und Mischlinge sind heterogen (BOMHARD et al., 2001; BOMHARD, 1977; DAHME und WEISS, 1958; GUTBERLET et al., 1998;

MCEWEN und WITHROW, 1996; SIMON et al., 2001).

2.1.4 Ätiologie und Pathogenese kaniner und humaner Mammatumoren Die Ätiologie kaniner Mammatumoren ist noch nicht vollständig geklärt. Neben anderen Einflussfaktoren spielen hormonelle Stimuli auf das Brustdrüsengewebe eine entscheidende Rolle (MISDORP, 2002; RUTTEMAN, 2005). Die Expression von Östrogen war in immunhistologisch bearbeiteten Gewebeschnitten von gesunden Hündinnen und bei Tieren mit hyperplastischen gutartigen Tumoren höher als in Karzinomen (MILLANTA et al., 2005). Auch in früheren Publikationen wurden Zusammenhänge zwischen dem Auftreten maligner Entartungen und der Herabregulierung von Steroiden und deren Rezeptoren in der Mamma festgestellt.

(RUTTEMAN und MISDORP, 1993). Eine mögliche Ursache der Tumorentstehung ab dem 5. Lebensjahr ist der hormonelle Einfluss auf das Milchdrüsengewebe. Lange Östrogen-, Progesteron- und Prolaktinphasen in Abhängigkeit vom Rezeptorstatus der kaninen Mamma nehmen Einfluss auf Proliferationsvorgänge und können die Entstehung von Neoplasien begünstigen (BOSTEDT, 1995). Eine erhöhte Expression von Östrogenrezeptoren, Östradiol und dessen metabolisierender Enzyme, sowie Proteinen, die Zellproliferation, Apoptose, Evasion, Invasion und Angiogenese verursachen, führten zum Wachstum von kaninen Mammatumoren (VINOTHINI et al., 2009). Beim Menschen kann auch Prostaglandin E2, ein katalytisches Produkt von Cox-2, zur Tumorentstehung und Angiogenese beitragen (LAVALLE et al., 2009). Eine geringere Expression des Progesteronrezeptors und höhere Expression von zellulären Proliferationsmarkern korrelierten mit größerem Durchmesser von mammären Tumoren und meist mit Malignität (FERREIRA et al., 2009; TONITI et al., 2009). Auch Wachstumsfaktoren scheinen in der Genese von malignen Tumoren und deren Vaskularisierung eine Rolle zu spielen. So war bei kaninen inflammatorischen Karzinomen immunhistologisch eine starke Expression

(14)

des „vascular endothelial growth factor“ (VEGF) nachzuweisen (MILLANTA et al., 2010). Auch Somatotropin und Prolaktin werden neben Progesteron eine tumorinduzierende Wirkung zugeschrieben. Durch Prolaktinhemmer verkleinerten sich bereits vorhandene Mammatumoren (GUTBERLET et al., 1998).

Schon während der ersten Geschlechtszyklen entstehen kleine Klone von präneoplastischen, epithelialen Zellen, die in späterer Zeit unter Einfluss geeigneter Stimuli tumorös entarten (BOSTOCK, 1986). Eine frühzeitig vor dem ersten Zyklus durchgeführte Ovariektomie senkt daher das Mammatumorrisiko auf 0,5 %, nach dem ersten Zyklus auf 8 %. Eine Kastration nach dem zweiten Zyklus vermindert das Risiko der Tumorentstehung nur noch auf 26 %. Ab einem Lebensalter von 2,5 Jahren kann kein Unterschied in der Mammatumorinzidenz zwischen intakten und kastrierten Hündinnen mehr ausgemacht werden (BOSTOCK, 1986; BRODEY et al., 1983; GUTBERLET et al., 1998; MANN, 1984; RUTTEMAN, 2005).

Ein weiterer möglicher Weg der Tumorgenese beim Menschen ist die Beeinflussung des Übergangs von epithelialen Zellen zu mesenchymalen Zellen, welcher in vitro von MMPs induziert wird. Dies führt zu DNA-Schäden und Instabilität des Genoms (STALLINGS-MANN und RADISKY, 2007). Hypoxie wiederum stimuliert die Tumorzellinvasion in den Brusttumorzelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-435 (MUNOZ-NAJAR et al., 2006). Während TIMPs in der Lage waren, die durch schlechte Sauerstoffspannung verursachte Invasion zu blockieren, führte die Überexpression von „membrane type-1 matrix metalloproteinase“ (MT1-MMP) zur Aktivierung von weiteren MMPs und zur Steigerung der Hypoxie-induzierten Invasion (MUNOZ-NAJAR et al., 2006).

Als weitere Einflussfaktoren werden u. a. virale, umweltbedingte, immunologische und diätetische diskutiert (GUTBERLET et al., 1998; MANN, 1984; MISDORP, 2002).

Pathogenetisch handelt es sich bei der Tumorgenese um eine Mutation eines Proto- Onkogens. Diese kann spontan oder durch zuvor genannte Stimuli induziert erfolgen.

Das Proto-Onkogen kodiert ein für die Zellteilung und –differenzierung essentielles Signalprotein und wird in mutierten Zellen durch sogenannte Tumorsuppressorgene gehemmt, die nach ihrer Aktivierung die Apoptose der mutierten Zelle einleiten. Falls die Tumorsuppressorgene jedoch ebenfalls mutiert sind, kommt es zur Transformation zur Tumorzelle und zu unkontrolliertem Wachstum (SUTER, 2001). In der veterinärmedizinischen Tumordiagnostik sind keine Marker für kanine

(15)

Mammatumoren etabliert. Die Gene BRCA1 und BRCA2, humane Tumorsuppressorgene, sorgen bei Mutation für gesteigerte Empfänglichkeit für Brustkrebs. Ihre Genprodukte sind nukleäre Phosphoproteine, die an der Regulation des Zellzyklus beteiligt sind (GILBERT et al., 2009). Bei malignen Mammatumoren der Hündin wurde eine aberrante Verteilung oder auch das vollständige Fehlen dieses Regulationsproteins festgestellt und mit dem bösartigen biologischen Verhalten des Tumors in Zusammenhang gebracht (NIETO et al., 2003). Dieses bösartige Verhalten, charakterisiert durch Invasion und Metastasierung beeinflusst die Bindung von Tumorzellen zur Basalmembran und die Degradierung von lokalem Bindegewebe. Darauf folgen Penetration und Migration durch das proteolysierte Stroma (CHAMBERS und MATRISIAN, 1997; CURRAN und MURRAY, 1999;

KOBLINSKI et al., 2000).

2.1.5 Pathologie kaniner Mammatumoren

Die kaninen Mammatumoren treten in 75 % der Fälle solitär auf. Sie variieren in ihrer Größe und Konsistenz. Diese reicht von weich, teils fluktuierend bei zystischen Veränderungen bis hin zu derber Beschaffenheit mit glatter oder unregelmäßig höckeriger Oberfläche (ARNOLD, 2001; GUTBERLET et al., 1998; MCEWEN und WITHROW, 1996; RUTTEMAN, 2005; SIMON et al., 2001). Maligne Tumoren sind signifikant größer als benigne Veränderungen. Hunde mit malignen Neoplasien entwickeln auch häufiger neue Primärtumoren (SORENMO et al., 2009). Mehr als 80% der Entartungen treten in den kaudalen drei, 60 % in den letzten beiden Komplexen auf. Dies ist vermutlich mit größeren morphologischen Umbauprozessen während des Zyklus und dem relativ höheren Gewicht der hinteren Komplexe erklärbar (GUTBERLET et al., 1998; KÄLIN et al., 1985; SIMON et al., 2001). Die in den kranialen Komplexen auftretenden Tumoren sind häufig gutartig und nicht so groß oder sie werden als hyperplastische Proliferationen diagnostiziert (ZANINOVIC und SMICIC, 1994). Metastasierung wird vorwiegend bei einfachen Karzinomen und Mischtumoren festgestellt (ARNOLD, 2001). Diese kann auf hämatogenem, lymphogenem oder lympho-hämatogenem Weg erfolgen. Beim Vergleich von inflammatorischen und nicht-inflammatorischen Karzinomen, die sowohl beim Menschen, als auch bei der Hündin die aggressivsten Tumorarten darstellen, zeigt sich beim Hund eine Metastasierungstendenz in die Blase und die Reproduktionsorgane, jedoch keine Metastasierungsneigung in Knochen und nur

(16)

eine geringe Tendenz zur Metastasierung in Lunge, Leber und Nieren (CLEMENTE et al., 2010). Genetisch lassen sich beim Menschen drei Subtypen bei malignen Brusttumoren klassifizieren. In einer immunhistologischen Untersuchung wurden Gesäugetumoren des Hundes untersucht, um diese molekular basierte Klassifikation der humanen Brusttumoren einer Überprüfung zu unterziehen. Mit Hilfe von Antikörpern wurden die Subtypen in „luminalähnlich A und B“ und „basalähnlich“

unterteilt (SASSI et al., 2010). Diese Subtypen zeigten allerdings keine Assoziationen zum histologischen Befund oder dem Tumorgrad. Aufgrund der hohen molekularen Heterogenität von kaninen Mammatumoren wäre eine Klassifikation auf genetischer Ebene von wichtiger prognostischer Bedeutung, jedoch schwierig (SASSI et al., 2010).

2.1.5.1 Maligne Tumoren der Mamma

Die histologische Klassifikation der kaninen Mammatumoren erfolgt anhand der WHO (World Health Organisation)- Einteilung in der „histologischen Klassifikation von Mammatumoren von Hund und Katze“ (MISDORP et al., 1999). Diese legt morphologische Kriterien unter Berücksichtigung einer prognostischen Wertung zugrunde und listet die Tumoren aufsteigend in ihrer Malignität. Es gibt insgesamt sieben verschiedene Gruppen maligner kaniner Mammatumoren epithelialen, mesenchymalen und gemischten Ursprungs (MISDORP et al., 1999).

Epitheliale Tumoren: -nicht infiltrativ wachsendes Karzinom (Carcinoma in situ) -komplexes Karzinom

-einfaches Karzinom: Tubulo-papillärer Subtyp Solider Subtyp

Anaplastischer Subtyp -besondere Varianten: Spindelzellkarzinom

Plattenepithelkarzinom Muzinöses Karzinom Lipidreiches Karzinom Mesenchymale Tumoren: -Sarkome: Fibrosarkom

Osteosarkom

(17)

Andere Sarkome Mischtumoren: -Karzinosarkom

-Karzinom oder andere Sarkome in benignen Tumoren Das nicht-infiltrativ wachsende Karzinom stellt eine epitheliale maligne Neoplasie dar, welche nicht die Basalmembran überwindet, häufig multizentrisch auftritt und kribriform, zum Teil begleitet von einer zentralen Nekrose, wächst.

Komplexe Karzinome treten beim Hund recht häufig auf. Ihre Malignität ist gekennzeichnet durch das Fehlen einer Kapsel, infiltratives Wachstum, hohe Zelldichte, Nekrosen und eine hohe Mitoserate. Die epithelialen Zellen können tubulopapillär oder solide formiert sein. Sowohl die epithelialen Anteile, als auch die myoepithelialen Anteile sind proliferiert, wobei die spindelförmigen Myoepithelien ein retikuläres Netz in einer faserarmen extrazellulären Matrix bilden. Expansives, lobuliertes Wachstum ist die Regel, Lymphgefäßeinbrüche jedoch selten.

Einfache Karzinome bestehen aus nur einem Zelltyp, der entweder epithelialen Zellen oder myoepithelialen Zellen ähnelt. Eine peritumorale Lymphozytenakkumulation wird häufig, mit oder ohne Nekrose beobachtet. Diese Tumoren haben eine große Tendenz, in umgebendes Gewebe und Gefäße vorzudringen und können in drei Subtypen von steigender Malignität eingeteilt werden: tubulopapillär, solide und anaplastisch. Der tubulopapilläre Subtyp lässt sich nochmals unterteilen in tubuläre und papilläre Karzinome, wobei die tubulären Tumoren häufig von Proliferationen stromalen Bindegewebes begleitet sind. Im soliden Karzinom finden sich die Tumorzellen in kompakten Strängen, Flächen oder Nestern wieder. Das Stroma ist reduziert oder in moderaten Anteilen aufzufinden.

Das anaplastische Karzinom ist ein hochgradig infiltrativ wachsender Tumor, der pleomorphe, nicht klassifizierbare epitheliale Zellen enthält. Die Nuklei dieser Zellen sind häufig chromatinreich und weisen einen deutlichen Polymorphismus auf.

Mehrkernige Zellen, ein kollagenreiches Stroma und Nekrosetendenz sind ebenfalls häufig vorhanden.

Besondere Varianten der Karzinome sind das Spindelzellkarzinom, das vermutlich myoepithelialen Ursprungs ist, sowie das Plattenepithelkarzinom, das squamöse Differenzierung aufweist, die häufig von zentraler Nekrose begleitet sind. Es ist stark infiltrativ wachsend und häufig von lymphogener Metastasierung begleitet. Bei

(18)

Hunden ist es in der Mamma unüblich. Auch muzinöse und lipidreiche Karzinome sind bei Hunden selten.

Zu den bösartigen mesenchymalen Tumoren zählt das Fibrosarkom, dessen Spindelzellen retikulin-und kollagenartige Fasern bilden. Diese können parallel ausgerichtet, oder netzartig verwoben sein. Sie sind, gemeinsam mit den Osteosarkomen, die häufigsten mammären Sarkome der Hündin. Osteosarkome sind Neoplasien, die entweder rein ossäre oder zusätzlich auch chondrale Anteile aufweisen. Außerdem können Bindegewebsbestandteile und Fettgewebe maligne entartet sein. Hervorstechende Merkmale sind Pleomorphismus und mitotische Aktivität. Chondrosarkome und Liposarkome sind selten. Die aus variablen epithelialen und mesenchymalen Anteilen zusammengesetzten Tumoren werden als Karzinosarkome bezeichnet. Sie variieren in ihrer Morphologie, sind jedoch häufig gut umschrieben. Karzinome oder Sarkome in einem gutartigen Tumor sind beispielsweise maligne Neoplasien in komplexen Adenomen oder in benignen Mammamischtumoren. Es stellt jedoch eine Herausforderung dar, festzustellen, ob der maligne tumoröse Teil aufgrund einer Entartung des benignen entstanden, oder in diesen invadiert ist.

2.1.5.2 Benigne Tumoren des Mammadrüsengewebes

Benigne Mammatumoren können in vier Gruppen unterteilt werden (MISDORP et al., 1999) und sind epithelialen oder gemischten Ursprungs.

Epitheliale Tumoren: -Adenome: Einfaches Adenom Komplexes Adenom Basaloides Adenom -Duktpapillome

Mischtumoren: -Fibroadenome: Zellarmes Fibroadenom Zellreiches Fibroadenom -Benigne Mischtumoren

Die einfachen Adenome bestehen aus gut differenziertem luminalen Epithel tubulärer Wuchsform. Beim Hund werden solide wachsende, gutartige Spindelzellen enthaltende Adenome Myoepitheliome genannt. Bei komplexen Adenomen treten neben epithelialen Bestandteilen auch myoepitheliale Zellen auf. Das Vorhandensein

(19)

einer Kapsel in Abwesenheit von Nekrose und Zellatypien, sowie eine geringe Mitoserate helfen bei der Unterscheidung von gut differenzierten komplexen Karzinomen. Einfache Adenome stellen häufig eine Übergangsform zu benignen Mischtumoren dar. Basaloide Adenome wurden erstmals und nur beim Beagle diagnostiziert. Dieser benigne Tumor, bestehend aus basaloiden, monomorphen, epithelialen Zellen orientiert sich peripher an der Basalmembran und kann zentral squamös differenziert sein. Fibroadenome bestehen aus einer Mischung aus luminalen Epithelzellen, Stromazellen und bisweilen myoepithelialen Zellen. Sie werden in zellreich und zellarm unterteilt. Der benigne Mammamischtumor enthält Komponenten, die morphologisch an epitheliale (luminale oder myoepitheliale) und an mesenchymale Tumoren erinnern. Die mesenchymalen Bestandteile produzieren Knorpel und / oder Knochen und / oder Fettgewebe in Kombination mit Bindegewebe. Sie sind bei der Hündin häufig. Duktale Papillome finden sich in dilatierten Milchgängen und bestehen aus einfachen oder komplexen, benignen Tumoren.

2.1.5.3 Unklassifizierte Tumoren des Mammadrüsengewebes

Tumoren, die sich in keine der oben genannten Kategorien einfügen lassen, werden

„unklassifiziert“ genannt.

2.1.5.4 Mammäre Hyperplasien und Dysplasien

Im Folgenden werden die einzelnen Formen von Hyperplasien und Dysplasien laut WHO-Klassifikation zusammengefasst.

-Duktale Hyperplasie -Lobuläre Hyperplasie -Zysten

-Gangektasien -Fokale Fibrosen -Gynäkomastie

Die duktale Hyperplasie kann diffus oder multifokal auftreten und besteht aus einer intraduktalen epithelialen Zellproliferation. Die Zellen sind klein, uniform und mitosearm; das Vorhandensein einer myoepithelialen Schicht favorisiert die Diagnose einer benignen Entartung. Die duktale Hyperplasie ist auch als

(20)

Papillomatose oder Epitheliose bekannt. Bei der lobulären Hyperplasie unterscheidet man zwei Formen, die epitheliale Hyperplasie und die Adenosis. Die epitheliale Hyperplasie stellt eine nicht neoplastische Proliferation epithelialer Zellen in extralobulären Dukti dar, während die Adenosis durch eine nicht neoplastische Proliferation von Duktuli charakterisiert wird. Letztgenannte besteht aus unterschiedlichen Anteilen Epithel, Myoepithel und Stroma. Zysten treten für gewöhnlich multipel auf. Das Epithel kann atrophisch, hyperplastisch oder papillär wuchernd vorliegen. Gangektasien repräsentieren eine progressive Dilatation des mammären Duktsystems. Eine Ruptur des Epithels kann zu einer granulomatösen Entzündung führen. Fokale Fibrosen können in lobulären Hyperplasien und in duktalen Proliferationen in Erscheinung treten. Die Gynäkomastie ist ein Phänomen beim Rüden, unter anderem ausgelöst durch einen endokrin aktiven Sertolizelltumor, der zu ausgeprägten duktalen und stromalen Hyperplasien führt.

2.2 Die extrazelluläre Matrix (EZM)

Die extrazelluläre Matrix vermittelt Zell-zu-Zell-Kontakte und Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung. Sie dient der Aufrechterhaltung der Gewebsintegrität, -form und -architektur und sorgt durch Proteinbindung für die Sequestrierung von Gewebswasser. (KUMAR et al., 2005). Aber auch pathologische Vorgänge, wie die Entstehung von Tumoren und genetische Erkrankungen werden von der EZM und deren Proteinen mit beeinflusst. Diese Proteine beinhalten typischerweise multiple, hochkonservierte Domänen, die an Adhäsionsrezeptoren, wie Integrine binden können. Sie sind für die Zell-Matrix-Adhäsion und die Übermittlung von Signalen in die Zelle zuständig. EZM-Proteine binden auch an lösliche Wachstumsfaktoren und regulieren deren Verteilung, Aktivierung und Präsentation (HYNES, 2009). Die EZM ist organabhängig unterschiedlich zusammengesetzt. Die Komponenten werden von zahlreichen Zellen synthetisiert und sezerniert. Dazu zählen im Wesentlichen drei Gruppen von Makromolekülen: 1. Bindegewebs-Strukturproteine, wie Kollagene und Elastine, 2. Adhäsive Glykoproteine, und 3. Proteoglykane und Hyaluronsäure. Diese Makromoleküle dienen zum Einen dem Aufbau der Basalmembran, zum Anderen der Gestaltung der interstitiellen Matrix. Durch Tumorerkrankungen oder Entzündungsprozesse kann die Homöostase, die durch dynamische Auf- und Abbauprozesse aufrechterhalten wird, empfindlich gestört werden (STAMENKOVIC, 2003). Die durch Proteolyse entstandenen Spaltprodukte der EZM können z. B. die

(21)

Migration von verschiedenen Zellarten ermöglichen (NAGASE et al., 2006; PAGE- MCCAW et al., 2007; STAMENKOVIC, 2000).

2.3 Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und ihre Inhibitoren (TIMPs) 2.3.1 Klassifikation, Funktion und Struktur

Matrixmetalloproteinasen, auch Matrixine genannt, wirken auf den extrazelullären Raum und degradieren sowohl Matrix-, als auch nicht-Matrix Proteine. Sie sind essentiell für Morphogenese, Wundheilung, Gewebs-“Remodelling“, Zellproliferation, Differenzierung der EZM, Vaskularisierung und Zellmigration (PAGE-MCCAW et al., 2007; STAMENKOVIC, 2003) und spielen im Verlauf von pathologischen Prozessen wie Enzephalitis eine wichtige Rolle (ALLDINGER et al., 2006; ULRICH et al., 2006).

Die Degradierung der extrazellulären Matrix wird unter anderem mittels Proteolyse von Wachstumsfaktoren erreicht. Dadurch wird die Migration von Zellen in umliegendes Gewebe ermöglicht. Regulierte Rezeptorspaltung führt zur Beendigung der Migrationssignale (CHANG und WERB, 2001). MMPs bestehen aus mehreren Domänen und werden von den TIMPs reguliert. Grundsätzlich sind zahlreiche Typen von Proteinasen in die Degradierung der extrazellulären Matrix eingebunden, wie z.

B. Serine, Zysteine und Aspartate (CHAMBERS und MATRISIAN, 1997; CURRAN und MURRAY, 1999; KOBLINSKI et al., 2000; NAGASE und WOESSNER, Jr., 1999), den Hauptbestandteil machen allerdings die MMPs aus (VISSE und NAGASE, 2003). Der Mensch besitzt 24 Gene, die für Matrixmetalloproteinasen kodieren, zwei davon für MMP-23. Somit existieren 23 MMPs beim Menschen, deren Aktivität mittels Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Hormonen, Zell-zu-Zell-Kontakten und Interaktionen zwischen Zellen und der EZM reguliert wird (NAGASE und WOESSNER, Jr., 1999).

Auch das Vorliegen als inaktive Vorstufen, die Zymogene, und die Hemmung durch endogene Inhibitoren, die TIMPs, stellen weitere Abstufungen der Regulationsmechanismen dar.

MMPs sind als zinkabhängige Endopeptidasen Mitglieder der „zinc metalloprotease family M10“ und wurden zunächst gemäß ihrer Substratspezifität in Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysine und Matrilysine eingeteilt (YONG et al., 1998). Aufgrund zahlreicher Substratüberschneidungen erfolgte eine numerische Listung (MMP-1, MMP-2,Q), wobei MMP-4, MMP-5, MMP-6 und MMP-22 fehlen, da diese sich als mit anderen MMPs identisch herausgestellt haben. Anhand ihrer Domänen und ihres

(22)

molekularen Aufbaus wurden sie systematisiert (EGEBLAD und WERB, 2002;

MCCAWLEY und MATRISIAN, 2001; STAMENKOVIC, 2003).

MMPs gelten als extrazelluläre Proteine, jedoch zeigten inzwischen Studien, dass MMP-1 (LIMB et al., 2005), MMP-2 (KWAN et al., 2004) und MMP-11 (LUO et al., 2002) auch intrazellulär vorliegen und als intrazelluläre Proteine aktiv sind. Manche MMPs werden sezerniert, andere liegen in membrangebundener Form vor. Alle MMPs werden als Zymogene produziert, die eine sekretorische Signalsequenz und eine Propeptidsequenz enthalten und durch Proteolyse in die aktive Form überführt werden (STAMENKOVIC, 2003).

Die typische Struktur eines MMPs besteht aus einer Propeptid-Domäne, aus etwa 80 Aminosäuren, einer katalytischen Domäne, etwa 170 Aminosäuren beinhaltend, einer sogenannten „hinge“-Region, eine prolinreiche Verbindungsstelle zwischen der katalytischen Domäne und eines weiteren Bereichs, der Hämopexin-Domäne, die aus ca. 200 Aminosäuren besteht. Sie ist für die kollagenolytische Aktivität der Kollagenasen zuständig. CHUNG et al. (2004) zeigten, dass Kollagenasen zunächst die tripelhelikalen Ketten ihrer Substrate aufwinden, um sie dann zu spalten.

Aufgrund dieser Aktivität und verschiedener Mechanismen, einschließlich der Enzymproduktion durch Tumorzellen, der Induktion der Kollagenaseproduktion in benachbarten Stromazellen und der Interaktion von Tumor- und Stromazellen, um die Kollagenasenproduktion durch eine oder beide Zelltypen einzuleiten, können Kollagenasen unter anderem als Indikatoren für schlechte Prognose und als Marker für die Tumorprogression dienen (BRINCKERHOFF et al., 2000). Durch Interaktion der Hämopexin-Domäne von proMMP-2 mit dem Inhibitor TIMP-2 wird beispielsweise auch die Bindung an MT1-MMP vermittelt; dieses agiert sowohl als Rezeptor für den proMMP-2-TIMP-2-Komplex, als auch als Aktivator von proMMP-2 (ITOH und SEIKI, 2006).

Ausnahmen vom klassischen Aufbau bilden MMP-7 (Matrilysin 1) und MMP-26 (Matrilysin 2), denen das Verbindungspeptid und die Hämopexin-Domäne fehlen, und MMP-23, das zusätzlich eine zysteinreiche Domäne und eine Immunglobulin- ähnliche Domäne aufweist.

Durch Fibronektin II –ähnliche Einschübe sind die Gelatinasen (MMP-2 und MMP- 9) in der Lage, die Bindung von Gelatine an die katalytische Domäne zu vermitteln (NAGASE und WOESSNER, Jr., 1999). Diese fibronektinähnliche Domäne ist

(23)

essentiell, um Typ IV Kollagen, Elastin und Gelatine zu spalten, allerdings ist sie nicht in der Lage, die Hydrolyse kleinerer Peptide zu vermitteln (MURPHY et al., 1992).

Der zinkbindende Bereich der katalytischen Domäne und der „cysteine switch“- Bereich der Propeptid-Domäne besitzen gemeinsame strukturelle Elemente, wobei drei Histidinmoleküle das zinkbindende Strukturelement beeinflussen und das Zystein (Cys) der Propeptidregion mit dem katalytischen Zinkion (Zn) interagiert (STAMENKOVIC, 2003). Diese Zystein-Zink-Verbindung hält durch Wasserbindung an das Zink-Atom die proMMPs in inaktiver Form (Zymogen). Die Bindung von Substraten wird von der Struktur der Bindungsstelle diktiert. Diese liegt in der Nähe des Zinkatoms und ist in ihrer Tiefe, je nach MMP, variabel (NAGASE et al., 2006).

Sie ist der determinierende Faktor der Substratspezifität von Matrixmetalloproteinasen. Durch das Binden eines Substrates wird das Wassermolekül vom Zinkmolekül getrennt. Zunächst muss jedoch das Zymogen durch Proteolyse in die aktive Form überführt werden; dies wird durch Trennung der Zystein-Zink-Verbindung und Ersetzen der Thiolgruppe des hochkonservierten, ungepaarten Zysteinrestes durch ein Wassermolekül erreicht. Dieser Aktivierungsmechanismus wird als „cysteine switch“ oder „velcro“-Mechanismus bezeichnet (SOMERVILLE et al., 2003; VALLEE und AULD, 1990; VAN WART und BIRKEDAL-HANSEN, 1990). Eine „Met-turn“-Region, ebenfalls in der katalytischen Domäne, sorgt für den Strukturerhalt rund um das katalytische Zink (BODE et al., 1993). Die Zinkbindungsstelle und das „Met-turn“ sind Strukturelemente, die allen Familien der „metzincins“ (wie z. B die ADAM-, ADAMTS-oder die Astacin-Familie) zueigen sind (BODE et al., 1993). Die nahe verwandten Familien der Matrixmetalloproteinasen und die Metalloproteinasen Disintegrine (ADAMs) spielen bei der Tumorausbreitung eine wichtige Rolle, wobei die ADAMs für Zelladhäsion und Proteolyse zuständig, die MMPs hingegen für Invasion, Angiogenese, Metastasierung, Tumorwachstum und –überleben verantwortlich sind (CHANG und WERB, 2001).

2.3.2 Regulation der MMPs

Die MMP-Aktivität wird auf unterschiedlichen Wegen kontrolliert, nämlich a) die Transkription, wobei die mRNA, die posttranskriptional vorliegt, durch Wachstumsfaktoren stabilisiert, bzw. destabilisiert wird und die Exkretion von

(24)

intrazellulär gespeicherten MMPs variieren kann (STERNLICHT und WERB, 2001), b) die proteolytische Aktivierung aus der inaktiven zymogenen Form und c) die Inhibierung des aktiven Enzyms durch eine Vielzahl endogener Inhibitoren, zum Beispiel der TIMPs (STAMENKOVIC, 2000; 2003). Auch die Induktion der Genexpression durch „extracellular matrix metalloproteinase inducer“ (EMMPRIN, CD 147, Basignin), die an der Tumorzelloberfläche vermehrt exprimiert werden, stellt eine Möglichkeit zur Regulation dar (BISWAS et al., 1995; GUO et al., 2000).

Die Expression der meisten MMPs (darunter MMP-7 und MMP-12) wird auf der transkriptionellen Ebene mittels Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Hormonen und Kontakt zur extrazellulären Matrix induziert (AMALINEI et al., 2007).

MMPs können durch Proteinasen oder „non-proteolytisch“ (chemisch oder thermisch) durch Zerstörung der Zystein-Zink-Interaktion aktiviert werden (AMALINEI et al., 2007; CHEN et al., 2001; VAN WART und BIRKEDAL-HANSEN, 1990). Plasmin aktiviert zum Beispiel proMMP -1, -3, -7, -9, -10 und -13. Aktivierte MMPs können beim Umbau anderer MMPs mitwirken (AMALINEI et al., 2007; VISSE und NAGASE, 2003).

Schließlich stehen den MMPs funktionelle Antagonisten gegenüber. In Gewebsflüssigkeiten erfüllt diese Aufgabe vor allem α2-Makroglobulin (SOTTRUP- JENSEN und BIRKEDAL-HANSEN, 1989; YANG et al., 2001). Weitere Regulatoren der MMP-Aktivität sind Thrombospondin und der Oberflächenrezeptor „reversion inducing cysteine-rich protein with kazal motifs“ (RECK) (OH et al., 2001;

STAMENKOVIC, 2003). So bindet Thrombospondin-2 an MMP-2 und erleichtert die Rezeptor-vermittelte Endozytose (YANG et al., 2001). Thrombospondin-1 hingegen kann MMP-2 und MMP-9 sowohl aktivieren (TARABOLETTI et al., 2000) als auch in inaktiver Form binden und blockieren (BEIN und SIMONS, 2000; RODRIGUEZ- MANZANEQUE et al., 2001). RECK, ein Glykosylphosphatidylinositol (GPI)- verankertes Glykoprotein, das MMP-2 und -9 herabreguliert, die Angiogenese unterdrückt und zum Tumorzelltod führt, inhibiert die proteolytische Aktivität von MMP-2 und -9 , sowie MT1-MMP (OH et al., 2001; TAKAHASHI et al., 1998). Eine Reihe von Proteinen enthalten Sequenzen, die der N-terminalen Sequenz der TIMPs ähneln, so zum Beispiel Netrine, die unter anderem „type I collagen C-proteinase enhancer protein“ (PCPE) sezernieren und auch als MMP-Inhibitor fungieren (BAKER et al., 2002). Der „tissue factor pathway inhibitor“ (TFPI-2) weist ebenfalls

(25)

Sequenzähnlichkeiten mit den TIMPs auf und inhibiert MMP-1, MMP-2, MMP-9 und MMP-13. Auch Thrombospondin-2 wird zu den MMP-Inhibitoren gezählt (BAKER et al., 2002), während α2-Makroglobulin als Hauptinhibitor der Matrixmetalloproteinasen im Plasma gilt.

Weitere endogene Inhibitoren sind die TIMPS. Diese Moleküle haben ein Molekulargewicht von 21-28 Kilodalton (kDa) und gehen eine 1:1 stochiometrische Bindung mit MMPs ein, um diese reversibel zu blockieren (GOMEZ et al., 1997).

TIMP-1 und TIMP-2 sind in der Lage, eine Vielzahl von MMPs zu hemmen. TIMP-3 inhibiert vor allem die Aktivität von MMP-1, -3, -7 und -13 und die verwandten Metalloproteinasen der ADAMs–Familie (ADAM-10, -12, -17) (AMOUR et al., 1998;

NAGASE et al., 2006), aber auch die ADAMTS -1, -4, -5 (NAGASE et al., 2006).

TIMP-4 weist eine schwächere, etwas eingeschränkte Inhibitoraktivität auf, die sich auf MMP-2, und -7 und weniger ausgeprägt MMP-1, -3 und -9 bezieht (LIU et al., 1997).

Die meisten MMPs werden von Zellen sezerniert und extrazellulär aktiviert. Pei und Weiss wiesen 1995 für MMP-11 (Stromelysin-3) eine intrazelluläre Aktivierung mittels Furin nach. Für viele MMPs ist für eine optimale Funktion die Lokalisierung an der Zelloberfläche essentiell (WERB, 1997). Auch sezernierte MMPs sind häufig transient an der Zelloberfläche zu finden, verbunden mit Adhäsionsrezeptoren oder mit Proteoglykanen. So findet sich MMP-1 assoziiert mit Integrinen (DUMIN et al., 2001) und EMMPRIN, einem Immunglobulin, das gebunden an MMP-1 an der Zelloberfläche die Tumorzellinvasion begünstigt (GUO et al., 1997; 2000).

Zelloberflächenbindung scheint bei vielen MMPs dafür zu sorgen, dass die MMP- Aktivität an jene Stellen verlagert wird, an denen das „Remodelling“ der EZM stattfindet und der Zelle eine Kontrollmöglichkeit über Degradierung und damit verbundene Migration gibt (BOURGUIGNON et al., 1998). Die an der Zellmembran verankerten MMPs -7 und -9 zeigen eine persistierende Aktivität. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Zelloberfläche diesen Enzymen quasi als protektive Nische zum Schutz vor ihren natürlichen Inhibitoren dient (BOURGUIGNON et al., 1998; YU und STAMENKOVIC, 1999; YU et al., 2002). Die Bindung von MMPs an Zelloberflächenproteine kann Effekte auf intrazelluläre Signalwege haben, die Proenzymaktivierung vereinfachen, die Zellmotilität modulieren, indem Zellkontakte zur EZM unterbrochen werden, und die Internalisierung von Enzymen unterstützen (BROOKS et al., 1996; STEFANIDAKIS und KOIVUNEN, 2006). Integrine dienen

(26)

hierbei als Rezeptoren für Proteasen, einschließlich der MMPs. Der gebildete Integrin-MMP-Komplex ist in die Angiogenese und das Tumorwachstum involviert. So aktivieren MMPs Integrine mittels proteolytischer Spaltung; dies scheint wichtig für die Invasion von Tumorzellen und Metastasierung zu sein (BROOKS et al., 1996;

STEFANIDAKIS und KOIVUNEN, 2006).

2.3.3 Substrate der MMPs

Generell spalten MMPs Peptidbindungen vor einem Rest mit hydrophoben Seitenketten, wie z. B: Leukin, Isoleukin, Methionin, Phenylalanin oder Tyrosin (AMALINEI et al., 2007; FOLGUERAS et al., 2004; VISSE und NAGASE, 2003). Die Substrate der MMPs und die Wege ihrer proteolytischen Spaltung sind vielfältig:

So erfolgt eine Spaltung von Matrixproteinen in Verbindung mit Wachstumsfaktoren.

Der „fibroblast growth factor“ (FGF) und der „transforming growth factor- β ” (TGF-β) haben eine hohe Affinität zu Matrixkomponenten, und die Proteolyse spezifischer Matrixmoleküle macht die assoziierten Faktoren löslich. Die Spaltung von Decorin durch MMP-2, -3, oder -7 ist beispielsweise in der Lage, TGF-β freizusetzen (IMAI et al., 1997; MCCAWLEY und MATRISIAN, 2001). MMPs spalten Nicht-Matrixproteine, die mit Wachstumsfaktoren assoziiert sind. Sie proteolysieren z. B. das „insulin-like- growth-factor-binding protein“ (IGF-BP) und generieren einen aktiven IGF-Liganden (FOWLKES et al., 1994). MMPs spalten und aktivieren Wachstumsfaktoren direkt (MCCAWLEY und MATRISIAN, 2001; SCHONBECK et al., 1998; YU und STAMENKOVIC, 2000). Mitogene Signalwege können durch Proteolyse herabreguliert werden (MCCAWLEY und MATRISIAN, 2001; SHEU et al., 2001).

MMPs führen durch Degradierung der Basalmembran und daraus resultierendem Verlust von Zellsignalen zur Apoptose, z. B. bei der Mamma während der Involution (ALEXANDER et al., 1996). Die Spaltung von β-Integrin, sowie E-Cadherin (durch MMP-7) führt über Modulation der Zell-zu-Zell-oder Zell-Matrix-Bindungen indirekt zur Zellmigration (LOCHTER et al., 1997; MCCAWLEY und MATRISIAN, 2001; NOE et al., 2001; VON BREDOW et al., 1997).

2.3.4 MMPs und Tumoren

In der Humanmedizin sind zahlreiche Untersuchungen und Veröffentlichungen zum Thema „Matrixmetalloproteinasen und ihre Inhibitoren“ bei Tumoren veröffentlicht

(27)

worden. Nachfolgend soll eine Übersicht über die jüngsten Ergebnisse erstellt werden.

Die recht enggefasste Ansicht, MMPs seien einfache Zerstörer von Komponenten der extrazellulären Matrix lässt sich neueren Untersuchungen nach nicht mehr halten. So sind die Proteine in weiten Bereichen an der Tumorentstehung und der metastatischen Disseminierung beteiligt (CHABOTTAUX und NOEL, 2007). Bei pathophysiologischen Prozessen werden MMPs vermehrt freigesetzt, so wird zum Beispiel MMP-7 vor allem von Tumorzellen sezerniert, andere MMPs wiederum von tumornahen Stromazellen. Diese Stromazellen werden zur Expression durch Tumorzellinfiltration, durch direkte Zell-zu–Zell-Kontakte, parakrin durch von Tumorzellen freigesetzte Wachstumsfaktoren oder indirekt (über Induktion von Wachstumsfaktoren) über den Abbau der EZM stimuliert (STAMENKOVIC, 2003).

MMPs setzen Faktoren frei, die parakrin das Verhalten bestimmter Zelltypen beeinflussen. Bergers et al. wiesen 2000 nach, dass die VEGF-Sekretion von MMP-9 zu Angiogenese im Mausmodell bei Inselzelltumoren führte.

Malignes Wachstum wird grundsätzlich von 6 essentiellen Veränderungen der Zellphysiologie diktiert: (1) Produktion autokriner Wachstumsfaktoren, (2) Insensitivität gegenüber Wachstums-inhibierenden Signalen, (3) Unterlaufen der Apoptose, (4) unbegrenztes replikatives Potential, (5) Aufrechterhaltung der Angiogenese und schließlich (6) Invasion in Gewebe und Metastasierung (HANAHAN und WEINBERG, 2000). Entgegen der früheren Auffassung, MMPs wären vor allem wichtig in späten Stadien der Tumorprogression, nämlich durch ihren Einfluss auf Zellmigration, Invasion und Metastasierung, wird durch neuere Untersuchungen wahrscheinlich, dass MMPs nicht auf die Proteolyse physiologischer Matrixbarrieren beschränkt sind (CAUWE et al., 2007). MMPs werden nun als Schlüsselregulatoren vielfältiger zellulärer Funktionen gesehen. Meist an der Zelloberfläche lokalisiert, reichen die vielfältigen Aufgaben der MMPs von der Reifung und Aktivierung verschiedener Substrate, bis hin zu Inaktivierung und zum Abbau derselben (CHABOTTAUX und NOEL, 2007). Obwohl manche MMPs (wie z.

B. MMP-7) von Tumorzellen gebildet werden, findet die Produktion der meisten MMPs in stromalen Zellen statt. Mammatumoren sind häufig durch eine stromale Reaktion charakterisiert, die zum Einen zelluläre Elemente (Infiltration von fibroblastoiden, endothelialen und inflammatorischen Zellen), zum Anderen die extrazelluläre Matrix mit einschließt (KALLURI und ZEISBERG, 2006; NOEL und

(28)

FOIDART, 1998). Eine vermehrte Menge von Tumorstroma und erhöhte Anteile an EZM sind bei invasiven Mammatumoren häufig assoziiert (SHEKHAR et al., 2003).

Die im Tumorstroma lokalisierten Fibroblasten zeigten eine Modifikation ihres Phänotyps, die auch bei Fibroblasten während der Wundheilung beobachtet wurde (DVORAK, 1986). Diese „aktivierten“ Fibroblasten, wie beispielsweise die peritumoralen Fibroblasten, die reaktiven Stromafibroblasten, die Karzinom- assoziierten Fibroblasten oder auch die Tumor-assoziierten Fibroblasten, sind in die maligne Progression von Tumoren aktiv eingebunden, vor allem durch ihre Fähigkeit, MMPs zu sezernieren (KALLURI und ZEISBERG, 2006; MUELLER und FUSENIG, 2004). Fibroblasten produzieren latenten VEGF, der von Tumorzellen aktiviert werden kann. Humane primäre Fibroblasten (VA-13 Zellkulturen) formierten mit VEGF unter MMP-7-Zugabe in den Zellkulturüberstand endotheliale Tuben (ITOH et al., 2007). Zugabe von „connective tissue growth factor“ (CTGF) hob den Angiogeneseffekt wieder auf. Dies lässt vermuten, dass Fibroblasten latentes VEGF im extrazellulären Raum deponieren, um im Bedarfsfall mit Hilfe von MMP-7 die Angiogenese einzuleiten.

In frühen Stadien der Tumorentstehung sorgt die proteolytische Prozessierung bioaktiver Moleküle für ein permissives Umfeld, das maligne Entartung ermöglicht.

Gebundene Wachstumsfaktoren, wie z. B. der TGF-β, der IGF, der FGF, und der

„Heparin Binding Epidermal Growth Factor“ (HB-EGF), sind nicht in der Lage, mit ihrem Rezeptor zu interagieren und Signale zu übermitteln (CHABOTTAUX und NOEL, 2007). Verschiedene MMPs regulieren die Tumorzellproliferation, indem sie Wachstumsfaktoren an spezifische Bindungsproteine oder auch Matrixkomponenten gebunden lassen, oder diese aus ihren Vorläufern in die aktive Form überführen. Als Beispiel hierfür dient IGF, das durch MMP-7 aus seinem Vorläufer aktiviert wird (MIYAMOTO et al., 2007). Ebenso aktiviert MMP-7 HB-EGF durch Spaltung dessen an der Zelloberfläche verankerten Vorläufers und führt durch Aktivierung des spezifischen Rezeptors ERbB4 zum Überleben dieser Zellen (YU und STAMENKOVIC, 1999). Die Spaltung des membrangebundenen Fas-Liganden (mFasL) in löslichen FasL (sFasL) durch MMP-7 erhöht die Apoptose-Rate im physiologischen, den Tumor umgebenden Gewebe (POWELL et al., 1999). Durch Abnormalitäten in der Transduktionskaskade (LI et al., 2006; MITSIADES et al., 2001; O'CONNELL et al., 1999) sind Tumorzellen hingegen in der Lage, die

(29)

Apoptose zu unterlaufen. Desgleichen ist MMP-11 in der Lage, den Tumorzelltod zu inhibieren (BOULAY et al., 2001).

Zell-zu-Zell-Kontakte werden auch durch E-Cadherin vermittelt. Mittels proteolytischer Prozessierung von E-Cadherin durch MMP-7 wird die Zellaggregation unterbrochen und Tumorzellinvasion möglich (NOE et al., 2001). Proteolyse von E- Cadherin und Freisetzen von β-Catenin ist elementar für die „epithelial to mesenchymal transition“ (EMT), einem phänotypischen Übergang von Zellen, der mit aggressivem malignen Verhalten assoziiert ist (CHRISTOFORI, 2007; GILLES et al., 2001). Eine neuere Untersuchung von WOLF et al. (2007) wies bei der kollektiven Migration von Brusttumorzellen und der Bildung von multizellulären Strängen eine regulative Beteiligung von MT1-MMP mittels EZM-„Remodelling“ nach. Die Spaltung von EZM-Komponenten, wie z.B. Laminin oder Typ IV Kollagen durch MMPs kann zuvor unzugängliche Stellen exponieren und dadurch die Zellmigration vereinfachen (GIANNELLI et al., 1997; GILLES et al., 2001; XU und YU, 2001).

Auch die Angiogenese ist ein Vorgang, der durch verschiedene MMPs eingeleitet wird (DAVIS und SAUNDERS, 2006; HANDSLEY und EDWARDS, 2005; NOEL et al., 2007; SOUNNI und NOEL, 2005; VAN HINSBERGH et al., 2006). Dies schließt fibrinolytische und kollagenolytische Aktivität (HOTARY et al., 2002; 2003) ebenso mit ein, wie die Morphogenese von Endothelzellen (HOTARY et al., 2000; LAFLEUR et al., 2002; PLAISIER et al., 2004), die transkriptionale Regulation von VEGF (DERYUGINA et al., 2002; NOEL et al., 2004; SOUNNI et al., 2002), das Freisetzen von sequestriertem VEGF entweder in der EZM (BERGERS et al., 2000), oder an den CTGF gebunden (HASHIMOTO et al., 2002), sowie die posttranslationale Prozessierung von VEGF (LEE et al., 2005). MMPs können bei der Angiogenese stimulierend oder auch inhibierend wirksam werden, so kann beispielsweise die Degradierung von EZM-Komponenten oder Plasminogen auch angiogene Inhibitoren, wie Tumstatin, Endostatin und Angiostatin generieren (HAMANO und KALLURI, 2005; HELJASVAARA et al., 2005).

In der unveränderten und tumorösen kaninen Mamma wurden im Rahmen einer Dissertation von PALTIAN (2006) die verschiedenen Epithelien der Tumoren, die Gefäßbestandteile und das Stroma auf die Expression von MMP-2, -9, -14, sowie von TIMP-1 und -2 immunhistologisch untersucht. MMP-2 wurde in alveolären und duktalen Epithelien von Mammatumoren, sowie in Gefäßen unveränderten und

(30)

hyperplastischen Drüsengewebes festgestellt. Maligne Tumorarten wiesen eine verringerte Expression von MMP-2 auf. Für MMP-9 konnte eine Aufregulierung in benignen Mammamischtumoren gegenüber normalem Drüsengewebe und anderen Tumorarten, besonders den komplexen Adenomen und Karzinomen festgestellt werden. MMP-14 zeigte eine Aufregulierung in Tumorepithelien und Gefäßbestandteilen verschiedener Tumoren. Die Überexpression von MMP-14 in Karzinomen könnte mit deren Metastasierungs- und Invasionsverhalten assoziiert sein. TIMP-1 war in Mammamischtumoren der Hündin deutlich überexprimiert. Dies könnte durch eine Gegenregulierung der erhöhten MMP-Expression in diesen Tumoren zu erklären sein. In einfachen Karzinomen war hingegen eine reduzierte TIMP-1-Expression aufzufinden. Diese Untersuchungsergebnisse zeigen, dass MMPs und TIMPs in der kaninen Mamma in verschiedenen Strukturen heterogen exprimiert werden und waren Anlass, weitere Matrixmetalloproteinasen und Inhibitoren immunhistologisch zu untersuchen.

2.3.5 Ausgewählte MMPs und TIMPs

Im Folgenden soll ein Überblick über die Publikationen über MMP-7, MMP-11, MMP- 12 und TIMP-3 im Allgemeinen, bei Brusttumoren des Menschen und bei Untersuchungen zu Hunden gegeben werden.

2.3.5.1 MMP-7-Allgemeines

MMP-7, auch Matrilysin genannt, ist das kleinste MMP und besitzt nur eine Propeptid- und eine katalytische Domäne. Es wurde erstmalig von SELLERS und WOESSNER (1980) im Uterus der Ratte während der Involution post partum identifiziert. Sequenziert und charakterisiert wurde es 1988 (MULLER et al., 1988;

WOESSNER, Jr. und TAPLIN, 1988). Weitere Bezeichnungen des humanen Enzyms sind „putatives MMP“ oder „Pump-1“ und es erwies sich, dass die Eigenschaften dieser Protease sehr ähnlich zum Rattenenzym sind (QUANTIN et al., 1989).

Die Aufgaben von MMP-7 sind vielfältig. So spaltet es beispielsweise Vorstufen von an der Zelloberfläche gelegenen Wachstumsfaktoren der EGF-Familie, vor allem HB- EGF. Dies führt zu Zellproliferationen (YU et al., 2002). E-Cadherin, ein Proteoglykan, wird ebenfalls durch MMP-7 gespalten (NOE et al., 2001). Das nun lösliche Molekül begünstigt die Invasion von Tumorzellen in umliegendes Gewebe.

Auch Integrine, wie z.B. β4-Integrin gehören zu den Substraten von MMP-7 (VON

(31)

BREDOW et al., 1997). Matrilysin spaltet weiterhin das Proteoglykan Syndecan-1 (LI et al., 2002). Die Spaltung von FasL an der membrangebundenen Ektodomäne von Nicht-Tumor- und Tumorzellen führt zur Bildung von sFasL (lösliches Fas) und dessen Aktivierung (POWELL et al., 1999; VARGO-GOGOLA et al., 2002). Der nun löslich vorliegende Faktor scheint für die Apoptose der umliegenden Zellen, zum Beispiel während der Involution der Prostata wichtig zu sein (MITSIADES et al., 2001; POWELL et al., 1999). Auch die Apoptose von zytotoxischen T-Zellen ist Fas- induziert und wird durch Tumorzellen durch die Freisetzung von MMP-7 und damit verbundene Spaltung von Fas vermittelt (MASANORI et al., 2005).

Die Produktion von MMP-7 durch Makrophagen führt zur Freisetzung von TNF-α durch Unterbrechen der Adhäsion an der Zelloberfläche (MCCAWLEY und MATRISIAN, 2001). Dies stimuliert die MMP-3 –Produktion, z. B. bei entzündlichen Prozessen der Bandscheibe (HARO et al., 2000). Die Spaltung von TNF-α-Vorstufen führt zur Freisetzung von löslichem TNF-α; dies erhöht die Apoptose-Rate (GEARING et al., 1994; MOHAN et al., 2002).

MMP-7 ist ebenfalls in der Lage, das „C-type lectin domain family member A“

(CLEC3A), ein Protein, das im Knorpel, in der Zellmembran, in der EZM, im Kulturmedium von CLEC 3A-exprimierenden Zellen, aber auch im normalen Brustgewebe und bei Brusttumoren aufgefunden wurde, zu spalten und dadurch vermutlich die Adhäsion von (Tumor-) Zellen abzuschwächen und die Migration in umliegendes Gewebe zu erleichtern (TSUNEZUMI et al., 2009).

In einem in vitro-Modell untersuchten HARREL et al. (2005) die Matrilysin-Expression am polarisierten Epithel von „Madin-Darby-canine-kidney“ (MDCK)- Zellkulturen, die mit humanem MMP-7 transfiziert wurden. Latentes MMP-7 wurde im basolateralen Kompartiment sezerniert, jedoch war im apikalen Bereich der Zelle eine wesentlich höhere Matrilysin-Aktivität zu beobachten, was vermutlich auf die apikale Co- Freisetzung von Matrilysin-Aktivatoren zurückzuführen ist. Apikale MMP-7-Aktivität führte zu erhöhter Proliferation. MMP-7 seinerseits fungiert ebenfalls als Aktivator anderer MMPs. So zeigte eine in vitro-Studie, dass MMP-8 ein Substrat von MMP-7 darstellt und die Bioverfügbarkeit von MMP-13 verringert. MMP-8-Vorstufen scheinen auch in vivo durch Matrilysin in die aktive Form überführt zu werden (DOZIER et al., 2006).

(32)

Obwohl MMP-7 an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt ist, ist der Körper in der Lage, es bei Überexpression als Antigen zu erkennen. Eine Unterart zytotoxischer T-Zellen lysiert in diesem Fall die entsprechenden Zellen (YOKOYAMA et al., 2008). Neben den TIMPs fungiert auch die „human leucozyte elastase“ aus polynukleären Leukozyten als natürlicher Inaktivator (ALLA et al., 2008).

2.3.5.2 MMP-7 in physiologischem und tumorösem Mammagewebe des Menschen

MMP-7 spielt bei der Regulation des physiologischen Gewebs- „Remodellings“ eine wichtige Rolle. Durch Komplexbildung mit der Vorstufe des „heparin-binding epidermal growth factor“ (pro-HB-EGF) unter Einfluss von CD44 sorgt Matrilysin für höhere Überlebenszeit der Epithelzellen der Mamma (YU et al., 2002). MMP-7 und CD44 wurden im luminalen Kompartiment des lobuloalveolären Epithels und in den myoepithelialen Zellen aufgefunden. Dies könnte bei der Kontrolle des physiologischen „Remodellings“ der reproduktiven Organe helfen und vor ungerichteter EZM-Degradierung schützen (YU et al., 2002).

Während des Alterungsprozesses durchlaufen „human mammary epithelial cells“

(HMEC)-Zellkulturen sowohl morphologische, als auch funktionelle Veränderungen.

Dabei sinken die MMP-7-Expressionslevel mit steigendem Zellalter, wohingegen die MMP-1-, MMP-2- und MMP-9-Expression unverändert bleibt. Dies weist auf eine mögliche Rolle von MMP-7 beim Zellalterungsprozess hin (BERTRAM und HASS, 2008).

Grundsätzlich sind 4 Klassen von Proteinasen bekannt, die durch Degradierung der extrazellulären Matrix ein Tumorfortschreiten ermöglichen, nämlich die Serinproteinasen, die Aspartatproteinasen, die Zysteinproteinasen und die Matrixmetalloproteinasen (NAGASE et al., 2006; PAGE-MCCAW et al., 2007).

Matrilysin-mRNA ist jedoch, im Gegensatz zu einer Vielzahl anderer MMPs bei Brusttumoren schwächer exprimiert als in gesundem Mammagewebe. Die Proteinlevels von MMP-7 sind allerdings erhöht. Dies kann mit einer Regulierung der Translation zusammenhängen, welche den mRNA-Level von Matrilysin in den Tumorzellen senkt und aufgrund höherer Translationsraten eine verstärkte Proteinexpression im Tumorgewebe zur Folge hat (KOHRMANN et al., 2009).

Allerdings bleibt die Rolle von MMP-7 weitgehend undurchsichtig. Einige Untersuchungen befassten sich bis jetzt ausgiebig mit Matrilysin im Zusammenhang

(33)

mit Mammatumoren. Das Enzym war bei Androgenrezeptor-positiven humanen Brusttumoren erhöht. Diese Rezeptoren scheinen in der Lage zu sein, MMP-7 aufzuregulieren. Dies führte zu gesteigertem Invasionspotential der Tumorzellen (GONZALEZ et al., 2008). Erhöhte Expression korrelierte mit verringerter rückfallfreier Zeitspanne bei Brusttumorpatienten. Ebenso konnte eine Assoziation der Expression von MMP-7 in Fibroblasten und in mononukleären Entzündungszellen mit einer höheren Metastasierungsrate nachgewiesen werden (VIZOSO et al., 2007).

Einer neuen Studie zufolge wiesen intratumorale Fibroblasten unter anderem eine höhere Expression von MMP-7 auf als die invasive Front des Tumors (DEL CASAR et al., 2009). Eine stark vermehrte MMP-7-Produktion durch Fibroblasten korrelierte mit dem Auftreten von entfernten Metastasen, geringe Fibroblastenexpression dagegen war mit geringem Risiko für Metastasen korreliert (DEL CASAR et al., 2009). Eine andere Untersuchung von GONZALEZ et al (2010a) zeigte eine höhere MMP-7-Expression (neben anderen MMPs) in stromalen Fibroblasten der invasiven Front im Vergleich zu den neoplastisch veränderten Dukti von gemischt invasiven Karzinomen und dem Carcinoma in situ. MYLONA et al. wiesen 2005 einen Anteil von 54,2% der MMP-7 exprimierenden Zellen im Zytoplasma von Brusttumorzellen und 47,5% in tumoralen Stromazellen nach. Matrilysin schien mit gesteigerter Invasivität der neoplastischen Zellen assoziiert zu sein. Es scheint möglich, dass ein Proto-Onkogen, das ACTR/AIB1, MMP-7 aufreguliert und über Reduzierung der Zelladhäsion von Tumorzellen an spezifischen extrazellulären Matrixproteinen die Invasivität dieser Zellen begünstigt (LI et al., 2008). Demgegenüber wirkt ein Rezeptor, EphB6, der bei invasiven humanen Brusttumoren nicht mehr nachweisbar ist, reduzierend auf die Transkriptionslevel von MMP-7 und verringert so die Invasivität der Neoplasie (FOX und KANDPAL, 2009).

Eine Elimination von MMP-7 in humanen Brusttumorzelllinien (MDA-MB-231) war mit geringerer Invasivität und langsamerem Tumorwachstum assoziiert (JIANG et al., 2005). Die Überexpression von Matrilysin in “Michigan-Cancer-Foundation-7“ (MCF- 7)-Zelllinien, einer Brusttumorzellkultur des Menschen, erhöhte die zelluläre Invasivität und aktivierte proMMP-2 und MMP-9 (WANG et al., 2006). Chronische Expression von Matrilysin in Vorläuferzellen mammärer Neoplasien führt zur Selektion einer Zellpopulation mit reduzierter apoptotischer Sensitivität (FINGLETON et al., 2001). Diese Zellen sind in der Lage, die Lymphozyten-vermittelte Immunabwehr zu unterlaufen. Genetische Polymorphismen, sogenannte „single

(34)

nucleotid polymorphisms“ (SNPs) von MMP-7 sind signifikant für die Überlebensrate und somit für die Prognose (BEEGHLY-FADIEL et al., 2009). Frauen mit dem homozygoten G-Allel hatten eine signifikant schlechtere Prognose, als Frauen mit dem homozygoten A-Allel. Eine längere Überlebenszeit zeigten Patientinnen mit dem AA-SNP.

2.3.5.3 MMP-7-Untersuchungen bei Hunden

Eine Untersuchung bei Hunden mit dem renalen Alport-Syndrom (AS), einer genetisch bedingten Erkrankung, bei der das Typ IV Kollagen mutiert ist und keine ursächlichen Behandlungsmethoden möglich sind, zeigt sowohl eine Erhöhung der m-RNA, als auch der Aktivität des vorhandenen MMP-7, was eine Beteiligung von Matrilysin bei der Pathogenese dieser renalen Erkrankung nahelegt (RAO et al., 2005). Die Behandlung von vorgefallenem Bandscheibengewebe mit rekombinanten humanen MMP-7 (rhMMP-7) führte zu signifikant geringerem Gewicht und einem Proteoglykanabbau im behandelten Gewebe bei Hunden. Die Behandlung mit rhMMP-7 könnte die Abbauvorgänge bei Bandscheibenvorfällen beschleunigen (HARO et al., 2005). Matrilysin ist eines der wenigen MMPs, das in polarisiertem Epithel von MDCK-Zellen exprimiert wird (HARRELL et al., 2005). Latentes MMP-7 wurde sowohl im apikalen, als auch im basolateralen Kompartiment der MDCK- Zellen sezerniert, jedoch in viel größerem Ausmaß im basolateralen Bereich. Die Aktivität von Matrilysin jedoch war im apikalen Bereich zweifach höher, als im Basolateralen, was zu einer erhöhten Zellproliferation führte. Dies könnte durch die apikale Freisetzung eines MMP-7-Aktivators erklärt werden. Die gesteigerte Proliferation ist auf die Spaltung eines apikal vorhandenen Substrats und auf die Bindung an Heparansulfat-Proteoglykan zurückzuführen, nicht auf die Entstehung eines löslichen Faktors, der die Zellvermehrung auslösen würde. Bislang wurden keine Untersuchungen zur Matrilysin-Expression bei Mammatumoren der Hündin durchgeführt.

2.3.5.4 MMP-11-Allgemeines

MMP-11, auch Stromelysin-3 (ST3) genannt, besitzt, ähnlich den MT-MMPs, einen Spaltungsbereich für intrazelluläre furinähnliche Konvertasen. Dieser Bereich ist zwischen der Pro-Domäne und der katalytischen Domäne lokalisiert (MOTRESCU und RIO, 2008). Stromelysin-3 wird im Gegensatz zu den meisten anderen Matrixmetalloproteinasen nicht extrazellulär, sondern intrazellulär umgebaut und in

(35)

aktiver Form sezerniert (PEI und WEISS, 1995; SANTAVICCA et al., 1996). Neben Furin zählt auch das „furin/paired basic amino-acid-cleaving enzyme“ (PACE4), eine Proprotein-Konvertase, zu den Aktivatoren von MMP-11 (BASSI et al., 2000). ST3 ist transient in postlaktatischen Involutionsvorgängen, embryonaler Implantation, Organogenese und bei der amphibischen Metamorphose exprimiert (RIO et al., 1996). Bei Fröschen ist Stromelysin-3 für die intestinale Metamorphose notwendig (SHI et al., 2007). Diese Thyroid-abhängigen Umbauvorgänge schließen die Degenerierung des gesamten Schwanzes und die Apoptose des larvalen Epithels mit ein und führen zur Entstehung adulten Epithels. Die Untersuchung ist ein Modell für die Rolle von ST3 während der postembryonalen Entwicklung.

Doch obwohl die proteolytische Aktivität im Tiermodell mit Tumorgenese in Zusammenhang gebracht wurde (NOEL et al., 2000), ist MMP-11 nicht in der Lage, Hauptkomponenten der EZM zu spalten und die Substrate bleiben unbekannt (AMANO et al., 2004; RIO, 2005).

Das Enzym nimmt Einfluss auf die Fettgewebshomöostase, indem es die Differenzierung von Präadipozyten limitiert, oder reife Fettzellen verändert. MMP-11 wird von Adipozyten nahe der invasiven Front von Karzinomen, jedoch nicht in davon weiter entfernten Fettzellen exprimiert, was den Schluss zulässt, dass invasive Tumorzellen die Expression von MMP-11 in benachbarten Adipozyten induzieren (ANDARAWEWA et al., 2005). Das ST3-Gen wird ebenfalls von stromalen Zellen bei inflammatorischen Prozessen bei der Wundheilung produziert, vermutlich durch Faktorenfreisetzung von Entzündungszellen (BASSET et al., 1993).

Neben den TIMPS, die als Inhibitoren dienen, zählt auch die Proteinkinase D1 (PKD1) zu den Hemmern von Stromelysin-3. PKD1 ist bei invasiven Karzinomen stark vermindert und gilt als Marker für invasive Tumoren (EISELER et al., 2009).

2.3.5.5 MMP-11 in physiologischem und tumorösem Mammagewebe des Menschen

In adulten Organen unter normalen physiologischen Bedingungen ist MMP-11 nur in geringem Maße exprimiert (SHI et al., 2007). Während der Embryogenese ist es bei zahlreichen Prozessen aufzufinden, darunter Zellmigration, Gewebsdifferenzierung und apoptotischen Vorgängen (ALEXANDER et al., 1996; BASSET et al., 1990).

MMP-11 wurde erstmals in Mammatumoren, exprimiert von nicht-malignen fibroblastenähnlichen Zellen, entdeckt (BASSET et al., 1990). Tumorassoziierte oder