Immunhistologischer Nachweis von MMP-7

Bei der Auswertung des Matrilysin-Signals über alle Untersuchungsgruppen waren statistisch 5 Strukturen auffallend: das Myoepithel, die Entzündungszellen, das Stroma und die Gefäßbestandteile Endothel und Media. Die genannten Strukturen unterschieden sich in ihrem MMP-7-Signal besonders in der Gruppe der komplexen Adenome signifikant von den übrigen Untersuchungsgruppen.

Das Myoepithel exprimierte bei der Gruppe der komplexen Adenome sowohl im Tumorzentrum, als auch in der Tumorperipherie sehr deutlich und unterschied sich hiermit zum Teil hochsignifikant von den Myoepithelien der Gruppen „einfache Adenome“, „komplexe Karzinome“ und „einfache Karzinome“, die nur ein maximal halb so starkes Matrilysin-Signal aufwiesen. Diese Expressionsunterschiede ergaben sich sowohl bei den Vergleichen der Tumorzentren, als auch beim Vergleich der Tumorperipherien dieser Gruppen. Auch der Vergleich der drei Lokalisationen

„umgebende physiologische Mamma“, „Tumorzentrum“ und „Tumorperipherie“

miteinander erbrachte hochsignifikante Ergebnisse zwischen den komplexen Adenomen einerseits, die stärker exprimierten und den einfachen Adenomen, den komplexen Karzinomen und den einfachen Karzinomen andererseits, die geringere MMP-7-Signale aufwiesen. Der Tumorgesamtwert für das Myoepithel der komplexen Adenome unterschied sich ebenfalls hochsignifikant von dem der einfachen Adenome und dem der komplexen Karzinome, wobei die komplexen Adenome ein etwa doppelt so starkes MMP-7-Signal als die anderen beiden Gruppen aufwiesen.

Bislang wurden weder in der Human-, noch in der Veterinärmedizin Untersuchungen zu MMP-7-Expression in Myoepithelien durchgeführt. Allerdings ist bekannt, dass sich myoepitheliale Zellen von benignen humanen Brusttumoren in ihrem Phänotyp

von physiologischen Myoepithelien unterscheiden (NICKOLAY et al., 2003).

Immunhistologisch konnte bei 56% der untersuchten Fälle ein kompletter Verlust von CD10 (auch NEP oder Neprilysin oder neutrale Endopeptidase genannt) nachgewiesen werden, das die Zellmigration inhibiert (HARRISSON et al., 1995;

SUMITOMO et al., 2000), die Apoptose fördert (CUTRONA et al., 1999) und wichtige Signalwege für Wachstumsfaktoren beeinflusst (GANJU et al., 1996). Möglicherweise ist die signifikant erhöhte Expression von MMP-7 in myoepithelialen Zellen der vorliegenden Arbeit ein Hinweis auf ähnliche Effekte in benignen myoepithelialen Tumoren, da auch Matrilysin die Invasivität von Tumorzellen fördert (GONZALEZ et al., 2008; LI et al., 2008), die Apoptose inhibiert (FINGLETON et al., 2001) und das Wachstum von Tumoren begünstigt (JIANG et al., 2005).

In einer Studie von HOLLIDAY et al. (2009) wurde in vitro gezeigt, dass die humane myoepitheliale Zellpopulation der Brust als Bindeglied zwischen den luminalen und den stromalen Zellen fungiert. Es wurden isolierte luminale Zellen mit myoepithelialen Zellen kokultiviert, was zur Lokalisierung der Myoepithelien um die luminalen Zellen führte. Die Beigabe von tumorassoziierten Fibroblasten führte zur Auflösung dieses glandulären Aufbaus, während Fibroblasten aus der gesunden Mamma dies nicht vermochten. Die Zugabe von MMP-Inhibitoren verhinderte den strukturauflösenden Effekt der tumorassoziierten Fibroblasten auf die luminalen und myoepithelialen Zellen. Möglicherweise hängt der in der vorliegenden Arbeit ermittelte signifikant erhöhte MMP-7-Wert der myoepithelialen Zellen mit dem ebenfalls signifikant erhöhten Matrilysin-Wert des Stromas zusammen und dient dem Wachstum und der Invasivität der Brusttumoren. Ob dieser Effekt speziell auf MMP-7 zutrifft, müsste in weiteren Untersuchungen geklärt werden. Ebenfalls zu klären bleibt, warum die myoepithelialen Anteile der komplexen Adenome, jedoch nicht die der komplexen Karzinome signifikant mehr MMP-7 als die übrigen Untersuchungsgruppen exprimierten. Möglicherweise hat die Dignität eines Tumors Einfluss auf die Expression von MMP-7 im Myoepithel, Publikationen hierzu sind bislang jedoch nicht erschienen.

Die Entzündungszellen zeigten über alle Untersuchungsgruppen zwischen den Lokalisationen „physiologische Mamma“ und „Tumorzentrum“ hochsignifikante Unterschiede. Dabei exprimierten die Entzündungszellen des gesunden umgebenden Gewebes bei allen Gruppen doppelt bis maximal etwa siebenmal soviel

Diskussion 129

MMP-7, als die Tumorzentren der entsprechenden Tumorgruppe, die nur sehr geringe Matrilysin-Signale aufwiesen.

Entzündungszellen in Mammatumoren setzen sich mengenmäßig schwankend aus Makrophagen, Plasmazellen, Mastzellen und Lymphozyten zusammen und beeinflussen die Angiogenese, das Tumorwachstum und die Invasion neoplastischer Zellen in umliegendes Gewebe (ADAMS et al., 1987; COUSSENS and WERB, 2002;

DANIEL et al., 2005). Die Expression von MMP-7 in mononukleären Zellen von Brusttumoren war mit einer schlechten klinischen Prognose und dem Auftreten von entfernt liegenden Metastasen assoziiert (GONZALEZ et al., 2007). Eine ungeklärte Frage ist, ob die Entzündungszellen durch Tumorzellen zur MMP-Expression angeregt werden, oder sich durch die Tumorprogression gegenseitig induzieren (GONZALEZ et al., 2007). Die in dieser Arbeit signifikant erhöhten MMP-7-Werte der Entzündungszellen des den Tumor umgebenden gesunden Gewebes könnten dafür sprechen, dass die Entzündungszellen nicht direkt durch die Tumorzellen zur MMP-Expression veranlasst werden, sondern auf die Progression des Tumors selbst reagieren. Dies bleibt jedoch ungeklärt. Im Gegenzug wird die MMP-Genexpression in epithelialen Tumorzellen unter Anderem durch inflammatorische Zellen induziert, die den Tumor umgeben (VISSCHER et al., 1994; NIELSEN et al., 2001;

NAKOPOULOU et al., 2002b; de WEVER und MAREEL, 2003). Möglicherweise wirken die in der vorliegenden Arbeit untersuchten MMP-7-exprimierenden Entzündungszellen des umgebenden gesunden Gewebes auf diese Weise auf die neoplastischen Zellen ein und könnten ein Erklärungsansatz für die hohen MMP-7-Expressionslevel der myoepithelialen neoplastischen Zellen in dieser Lokalisation sein.

Das Stroma zeigte tumornah zwischen den komplexen Adenomen und allen übrigen Untersuchungsgruppen hochsignifikante, beziehungsweise signifikante (zu den einfachen Karzinomen) Unterschiede. Dabei erschien das Matrilysin-Signal der komplexen Adenome deutlich, während die übrigen Untersuchungsgruppen nahezu kein MMP-7 aufwiesen.

Tumorfern war die Matrilysin-Expression des Stromas der komplexen Adenome nur noch etwa halb so stark, während bei den anderen Untersuchungsgruppen die Expressionsstärke ähnlich der tumornah Ermittelten, nämlich nahezu null war. Dies führte beim Vergleich der MMP-7-Expression des tumorfernen Stromas der

komplexen Adenome zu signifikanten Ergebnissen mit den benignen Mischtumoren, der Hyperplasiegruppe und der Kontrollgruppe. GARCIA et al. (2010) fand bei der Untersuchung der Expressionslevel von MMP-7 in Brusttumoren die auffälligsten Unterschiede beim Vergleich von stromalen Zellen unterschiedlicher Lokalisationen.

Dabei waren ortsbezogene Expressionsunterschiede signifikanter als Ortsunabhängige. Fibroblastenähnliche Zellen des Tumorzentrums exprimierten bei GARCIA et al., 2010 in signifikant höherer Prozentzahl MMP-7, als die entsprechenden Zellen der Tumorperipherie. In der hier vorliegenden Arbeit war bei allen Untersuchungsgruppen im Stroma tumornah stets mehr MMP-7 Signal nachzuweisen, als tumorfern (Stroma wurde in dieser Arbeit jedoch nicht in Tumorzentrum und Tumorperipherie untersucht). Der tumornah höhere MMP-7-Level im Stroma könnte mit der Induzierung der MMP-7-Produktion durch Tumorzellen in stromalen Zellen erklärbar sein, die tumornah (beziehungsweise im Tumorzentrum bei del CASAR et al., 2009; GARCIA et al., 2010; GONZALEZ et al., 2010b) stärker ausgeprägt ist, als tumorfern (beziehungsweise in der Tumorperipherie bei del CASAR et al., 2009; GARCIA et al., 2010; GONZALEZ et al., 2010b). Ob dies jedoch auch an der möglicherweise höheren Zelldichte im Tumorzentrum, oder ausschließlich einer höheren Aktivität der Tumorzellen im Zentrum liegt, bleibt ungeklärt. Es ist auch bekannt, dass nicht nur Tumor-, sondern auch Stromazellen durch Wachstumsfaktor- und Zytokinsekretion parakrin die MMP-Expression in neoplastischen Geweben regulieren (MUELLER und FUSENIG, 2004). Eventuell könnten die im Vergleich zu anderen Gruppen relativ hohen tumornahen Werte des Stromas der komplexen Adenome durch die gut ausgeprägten Bindegewebsstrukturen der meist vollständig erhaltenen Kapsel erklärbar sein, die die neoplastischen Zellen aktivieren könnten.

Das Gefäßendothel erbrachte tumornah bei der statistischen Auswertung hochsignifikante Ergebnisse beim Vergleich der komplexen Adenome, die sehr deutliche MMP-7-Signale aufwiesen, und allen übrigen Untersuchungsgruppen, die nahezu Matrilysin-negativ waren.

Die Gefäßmedia war die einzige Struktur, die nicht im Vergleich der komplexen Adenome mit anderen Gruppen auffiel. Tumorfern unterschied sich die Media der Kontrollgruppe, die MMP-7-negativ war, signifikant von der Media der einfachen Karzinome, sowie von der Media der Hyperplasiegruppe, die deutlich mehr MMP-7 exprimierten.

Diskussion 131

Einige MMPs regulieren die Angiogenese in zwei verschiedene Richtungen: Zum Einen mobilisieren sie Proangiogenese-Faktoren (STETLER-STEVENSON, 1999);

zum Anderen generieren sie Angiostatin und Endostatin, die die Einsprossung von Gefäßen verhindern (RIFKIN et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit waren bei Bestandteilen der Gefäße signifikant unterschiedliche Expressionsstärken für MMP-7 messbar, sowohl im Endothel, als auch in der Media.

Durch die Behandlung von Fibroblasten mit MMP-7 konnten in vitro Endothelzellsprossungen hervorgerufen werden (ITOH et al., 2007). Stromale Zellen haben folglich neben dem Einfluss auf neoplastische Zellen auch aktivierende Wirkung auf die Angiogenese. Die Endothelzellsprossung scheint im apikalen Kompartiment der Zellen induziert zu werden. In einer kaninen Nieren-Zelllinie wurde MMP-7 vor allem in diesem Bereich nachgewiesen. Dies lässt auf einen dort lokalisierten Matrilysin-Aktivator schließen, der proliferative Prozesse auslöst (HARREL et al., 2005). In einer weiteren Untersuchung resultierte die Unterbrechung der Interaktion von „CD-44 heparan sulfate proteoglycane“ (CD44HSPG) und MMP-7 der laktierenden Mamma in einer Relokalisierung des MMPs von der apikalen zur basalen Zelloberfläche und damit in steigendem Zelltod und übermäßig starkem Gewebs-“Remodelling“ (STAMENKOVIC, 2003; YU et al., 2002). MMP-7 hat demnach einen nachweislichen Einfluss auf die Angiogenese in der Mamma und bei Tumoren, wobei die Lokalisierung und das Vorhandensein von Aktivatoren eine erhebliche Rolle zu spielen scheint. Die Expression von MMP-7 im Endothel bei humanen Tumorarten war mit einer schlechten Überlebensrate und malignem Wachstum assoziiert (SIER et al., 2008). Dies könnte in der vorliegenden Arbeit teilweise bestätigt werden, da die Gefäßmedia der einfachen Karzinome die deutlichste (mittelgradige) MMP-7-Expression aufwies, während die Media der Kontrollgruppe Matrilysin-negativ war.

Neu und in der Humanmedizin nicht beschrieben ist die in dieser Arbeit hervorstechende MMP-7-Expression der kaninen komplexen Adenome in allen oben beschriebenen Strukturen im Vergleich zu den anderen Tumorarten und dem Kontrollgewebe. Es wird vermutet, dass Matrilysin eher die Überlebenszeit der Tumorzellen, als deren Invasivität fördert (RUDOLPH-OWEN et al., 1998). Dies könnte möglicherweise eine Erklärung für das vermehrte Auftreten von MMP-7 in gutartigen Tumoren sein. Zwei Mechanismen führen zu der erhöhten Lebensdauer der Tumorzellen: Zum Einen spaltet MMP—7 den Fas-Liganden an der

Zelloberfläche, wobei die dabei entstehende lösliche Form sFasL, die an den Fas-Rezeptor bindet, eine signifikant herabgesetzte Effektivität zur Einleitung der Zellapoptose besitzt (SHEU et al., 2001). Zum Anderen spaltet MMP-7 auch eine Vorstufe von heparinbindendem EGF an der Zelloberfläche; das freigesetzte aktive Molekül bindet an die ErbB1- und ErbB4-Rezeptoren. Dies führt zu weiteren Signalen zum Schutz vor Apoptose (MITSIADES et al., 2001). Möglicherweise könnten diese Vorgänge bei langsam wachsenden gutartigen Tumoren eine Steigerung der MMP-7-Expression erklären. In einer Studie, die benigne myoepitheliale Brusttumoren mit Spindelzellkarzinomen vergleicht (NICKOLAY et al., 2003), wurden immunhistologisch zwar nicht MMP-7, jedoch zahlreiche andere Enzyme und Zellstrukturen untersucht, um deren Eignung als diagnostische Marker festzustellen.

Hierbei zeigte sich, dass Adenomyoepitheliome weniger häufig CD10 und Myosin exprimieren, jedoch unter anderem eine höhere Expression von Steroid-Rezeptoren aufwiesen. Andere Studien wiesen Östrogen-Rezeptor-positive Adenomyoepitheliome und benigne Mischtumoren der Brust beim Menschen nach (ROSEN et al., 2001; SEGEN et al., 1986). Möglicherweise ist das vermehrte Vorhandensein von Steroid-Rezeptoren in komplexen benignen Brusttumoren ein Erklärungsansatz für die signifikant erhöhte MMP-7-Expression der kaninen komplexen Adenome. Matrilysin war bei Androgenrezeptor-positiven humanen Brusttumoren erhöht (GONZALEZ et al., 2008). Diese Rezeptoren schienen in der Lage zu sein, MMP-7 aufzuregulieren. Dies führte auch zu einem gesteigerten Invasionspotential der Tumorzellen. Ob die MMP-7-Expression jedoch ursächlich mit dem Rezeptorstatus der komplexen Adenome zusammenhängt, bleibt ungeklärt.

Auch andere Studien bringen Matrilysin mit benignen Tumoren in Zusammenhang.

Die Elimination von MMP-7 in Mäusen führte zu einer zahlenmäßigen Verringerung von benignen intestinalen Tumoren (WILSON et al., 1997). In einer Publikation von MYLONA et al., 2005, wurde die Matrilysin-Expression mit weniger aggressiven Phänotypen von Brusttumoren assoziiert, jedoch eine Einflussnahme auf das Invasionsverhalten festgestellt. Möglicherweise zeigt sich dies auch in der vergleichsweise hohen, statistisch jedoch nicht signifikant zu anderen Gruppen unterschiedlichen MMP-7-Expression der metastasierten Lymphknoten der hier untersuchten einfachen Karzinome. Matrilysin ist in der Lage, neben Kollagen IV und Laminin auch Integrine auf der Tumorzelloberfläche zu spalten (ABDEL-GHANY et al., 2001). Es bildet mit CD44 einen Komplex an der Zelloberfläche, vermutlich, um

Diskussion 133

tumorzellvermittelte Matrixdegeneration zu koordinieren (YU et al., 2002). Indem es E-Cadherin spaltet, induziert es das invasive Potential der Tumorzellen (DAVIES et al., 2001; NOE et al., 2001). Frühere Theorien postulierten den Einfluss von MMPs auf das Metastasierungsverhalten einzig über das „Remodelling“ der extrazellulären Matrix (GARCIA et al., 2010). Inzwischen sind die Möglichkeiten der Tumorzellbeeinflussung vielfältig untersucht. Ihre Fähigkeit, Wachstumsfaktoren, Zelloberflächenrezeptoren, Zelladhäsionsmoleküle und Chemokine, beziehungsweise Zytokine zu spalten (EGEBLAD und WERB, 2002; RIFKIN et al., 1999; STERNLICHT und WERB, 2001) sind ebenso belegt, wie die Bildung eines aggressiven Tumorzellphänotyps, der sich apoptoseresistent zeigt (FINGLETON et al., 2001). Es scheint, dass die Tumorzellen der Metastasen eine Induktionsmöglichkeit der Proteinproduktion in den Lymphknoten-spezifischen Zellen besitzen. Dies gilt vor allem für MMP-7 in stromalen Zellen der entarteten Lymphknoten und betont die Bedeutung der stromal-epithelialen Interaktion (GARCIA et al., 2010). Vor der Untersuchung von GARCIA et al. gab es keine Untersuchungen über MMP- und TIMP-Expressionsprofile in assoziierten Lymphknoten von Brusttumoren. Allerdings sind drainierende Lymphknoten höchst aufschlussreich, da sie mit einer Vielzahl von löslichen Faktoren des Brusttumorgewebes in Kontakt kommen und, wie auch diese Untersuchung bei der Betrachtung der einfachen Karzinome zeigt, von aggressiven Klonen des Primärtumors durchsetzt sein können, die signifikant mehr MMP-7 exprimieren (GARCIA et al., 2010). MMP-7-Expression korrelierte zum Beispiel auch mit der Lymphknotenmetastasierung beim Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle (DE VICENTE et al., 2007) und diente dort als prognostischer Indikator. Daher könnten die auffallend hohen, jedoch statistisch nicht signifikant unterschiedlichen Werte der Lymphknotenmetastasen der einfachen Karzinome in der vorliegenden Arbeit einen Hinweis auf den Einfluss von MMP-7 auf das Invasionsverhalten von malignen Tumoren geben. Aufgrund der relativ geringen Fallzahl der metastasierten einfachen Karzinome dieser Arbeit bleiben die Ergebnisse statistisch interpretierbar.