Arbeitsanleitung
Serotonin sensitiv ELISA
(Hochsensitiv und für kleine Probenvolumina)
Hochsensitiver Enzymimmunoassay
für die quantitative Bestimmung von Serotonin
REF EA 630/96
12 x 8 2 – 8 °C
DLD Gesellschaft für Diagnostika und medizinische Geräte mbH Adlerhorst 15 • 22459 Hamburg • Tel 040-555 87 10 • Fax 040-555 87 111
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Testprinzip Seite 4
2. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Seite 5
3. Lagerung und Haltbarkeit Seite 5
4. Inhalt des Testbestecks Seite 5
5. Probengewinnung Seite 7
6. Vorbereitung der Reagenzien Seite 8
7. Testdurchführung ELISA Seite 12
8. Auswertung und Beurteilung Seite 13
9. Testcharakteristika Seite 14
10. Literatur Seite 15
Pipettierschema Seite 16
1. Einleitung und Testprinzip
Serotonin (5-Hydroxytryptamin) gehört in die Gruppe der biogenen Amine und ist ein Intermediärprodukt des Tryptophanstoffwechsels. Es ist ein gut dokumentierter Neurotransmitter des zentralen Nerven- systems und ist in hohen Konzentrationen in den chromaffinen Zellen der Darmschleimhaut, in den Thrombozyten und den serotonergen Neuronen des Gehirns nachweisbar.
Zentral-serotonerge Neuronen beeinflussen physiologische Funktionen wie z. B. den Schlaf sowie die hormonelle und kardio-vaskuläre Regulation. Erhöhte Serumspiegel werden bei malignem Karzinoid, bei endogener Depression und Schizophrenie beobachtet. Serotonin ist ein spezifischer Tumormarker für das maligne Karzinoid.
Der Serotonin-Sensitive ELISA-Kit enthält Reagenzien für die quantitative Bestimmung von derivatisiertem Serotonin (5- Hydroxytryptamin) in niedrigkonzentrierten Proben bzw. für kleine Probenvolumina. Die Derivatisierung erfolgt während der Probenvorbereitung. Dabei wird Serotonin durch das Acylierungs- reagenz quantitativ in N-Acylserotonin umgewandelt.
Der Serotonin-Sensitive ELISA ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay, in dem die Antigene um eine definierte Anzahl von Antikörper- Bindungsstellen konkurrieren. Wenn sich das System im Gleichgewicht befindet, wird der nicht-gebundene Antigen-Antikörper-Komplex in einem Waschschritt entfernt und der entsprechend gebundene Komplex mittels eines Peroxidase-Konjugats nachgewiesen und über den Umsatz von Tetramethylbenzidin (TMB) bestimmt. Die TMB/POD-Reaktion wird gestoppt und bei 450 nm gemessen. Die Konzentration des an die Festphase gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexes ist umgekehrt proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe.
2. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
• Dieser Kit ist lediglich zum in vitro-Gebrauch bestimmt.
• Während der Testdurchführung Einmal-Handschuhe und Schutzbrille tragen.
• Alle Reagenzien dieses Testbestecks, die tierischen Ursprungs sind, stammen von gesunden Tieren, die von einer zertifizierten Stelle untersucht wurden. Die Reagenzien sollten trotzdem wie potentiell infektiöses Material behandelt werden.
• Ein Teil der Komponenten dieses Testbestecks sind kennzeichnungspflichtig. Diese Komponenten tragen das entsprechende Gefahrensymbol auf ihrem Etikett.
3. Lagerung und Haltbarkeit
Der Kit ist bei Lagerung zwischen 2 - 8 °C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Nach Anbruch ist der Kit bis zum Verfallsdatum haltbar. Zur Haltbarkeit der vorbereiteten Reagenzien siehe Vorbereitung der Reagenzien.
Alle Reagenzien müssen vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur ge- bracht und sofort nach Gebrauch wieder kühl gestellt werden.
4. Inhalt des Testbestecks
4.1 MT-Streifen STRIPS 12 Stück
Mikrotiterstreifen mit je 8 Vertiefungen, einzeln abbrechbar.
4.2 Standard CAL 1 Fläschchen
4 ml, Konzentrat
Konzentration: 500 ng/ml
Einsatzkonzentrationen werden aus
diesem Standard verdünnt (s. auch 6.1.2.)
4.3 Kontrolle 1 & 2 CON 1 & 2 2 Fläschchen Je 4 ml, Konzentrat
Vor dem Einsatz 1:500 verdünnen (s. auch 6.1.3.) Bereich: Siehe Q.C.-Zertifikat im Kit
4.4 Acylierungspuffer ACYL-BUFF 1 Fläschchen lyophilisiert, mit 4 ml destilliertem Wasser lösen.
200 µl Acylierungspufferkonzentrat ACYL-BUFF-CONC hinzugeben. Vorsichtig mischen, übermäßige
Schaumbildung vermeiden (s. auch 6.1.4.).
4.5 Acylierungspufferkonzentrat ACYL-BUFF-CONC 1 Fläschchen 1 ml, Konzentrat; gelb eingefärbt
4.6 Acylierungsreagenz ACYL-REAG 2 x 2 Fläschchen lyophilisiert, Inhalt eines Fläschchens
mit 2,5 ml SOLVENT lösen (s. auch 6.1.5.).
4.7 Deaktivator DEAC 1 Fläschchen
3 ml, gebrauchsfertig; blau eingefärbt
4.8 Enzymkonjugat CONJ 1 Fläschchen
12 ml, gebrauchsfertig
Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase
4.9 Waschpuffer WASH 1 Fläschchen
20 ml, Konzentrat
Inhalt mit destilliertem Wasser
auf 500 ml auffüllen (s. auch 6.1.6.).
4.10 Substrat SUB 1 Fläschchen
12 ml TMB-Lösung, gebrauchsfertig
4.11 Stopplösung STOP 1 Fläschchen
12 ml, gebrauchsfertig
Enthält 0,3 M Schwefelsäure
4.12 Solvent SOLVENT 2 Fläschchen
6 ml, gebrauchsfertig Enthält Aceton
4.13 Ascorbinsäure ASC-ACID 10% 1 Fläschchen 2 ml, gebrauchsfertig
Enthält 10%ige Ascorbinsäure
4.14 Standardpuffer STD-BUFF 1 Fläschchen 50 ml
10 mM PBS (0,9 % NaCl), stabilisiert
Muss vor dem Einsatz auf 0,1 % Ascorbinsäure angereichert werden (s. auch 6.1.1.).
4.15 Reaktionsplatte ACYL-PLATE 1 Stück für die Acylierung, gebrauchsfertig
4.16 Haftklebefolie FOIL 2 Stück
Gebrauchsfertig
Weiter werden benötigt (nicht im Kit enthalten):
•••• Pipetten für 10, 20, 25, 50, 100 und 200 µl
•••• Mehrkanalpipette oder Waschgerät
•••• Photometer für die Auswertung von Mikrotiterplatten (450 nm)
•••• Horizontalschüttler
•••• Destilliertes Wasser
5. Probengewinnung
Der Test ist ausgelegt für kleine Probenvolumina bzw. sehr niedrige Konzentrationen in Gewebehomogenaten, Dialysaten und allgemein für verdünnte Proben.
Zur Vermeidung des oxidativen Zerfalls des Serotonins müssen die Proben 0,1 % Ascorbinsäure enthalten.
Die Proben können bis zu 6 Stunden bei 2 - 8 °C gelagert werden.
Proben, die nicht sofort in dem Test eingesetzt werden, müssen bei -20 °C gelagert werden.
Wiederholtes Einfrieren und Wiederaufbauen sollte vermieden werden.
Als Verdünnungsmedium können unterschiedliche Puffer eingesetzt werden. Die Einstellung des Testes erfolgte mit Ringer-Puffer bzw. PBS (0,9% NaCl). Optional kann der Standardpuffer verwendet werden, aber auch die Einführung anderer Puffer ist nach vorheriger Überprüfung möglich. Alle als Verdünnungsmedium eingesetzten Puffer müssen auf 0,1 % Ascorbinsäure angereichert sein.
Für kleine Probenvolumina (< 20 µl) muss ein Ausgleich des Volumens mit Verdünnungsmedium (optional: Standardpuffer) stattfinden, so dass jeweils ein Probenvolumen von 20 µl erreicht wird.
Folgende Tabelle dient als Beispiel:
Probenvolumen Verdünnungsmedium
1 µl 19 µl
2 µl 18 µl
5 µl 15 µl
10 µl 10 µl
15 µl 5 µl
20 µl /
6. Vorbereitung der Reagenzien und Proben
6.1. Vorbereitung der Reagenzien
6.1.1. Standardpuffer STD-BUFF
Der Standardpuffer ist vor dem Einsatz auf 0,1 % Ascorbinsäure anzureichern: 50 ml Standardpuffer + 0,5 ml ASC-ACID 10% .
Der gebrauchsfertige Standardpuffer muss für den späteren Gebrauch bei -20 °C eingefroren werden und bleibt so bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendbar.
6.1.2.Standard CAL
Der mitgelieferte Standard besitzt eine Serotoninkonzentration von 500 ng/ml (= 10.000 pg/sample).
Zur Erstellung einer Std-Kurve muss dieser auf folgende
Konzentrationen verdünnt werden: 0 / 0,67 / 2 / 6,7 / 20 / 100 pg/sample.
Std 6 100 pg/sample 990 µl Verdünnungsmedium 10 µl CAL Std 5 20 pg/sample 800 µl Verdünnungsmedium 200 µl Std 6
(100 pg/sample) Std 4 6,7 pg/sample 933 µl Verdünnungsmedium 67 µl Std 6
(100 pg/sample) Std 3 2 pg/sample 980 µl Verdünnungsmedium 20 µl Std 6
(100 pg/sample) Std 2 0,67 pg/sample 993 µl Verdünnungsmedium 6,7 µl Std 6
(100 pg/sample) Std 1 0 pg/sample 1000 µl Verdünnungsmedium
Als Verdünnungsmedium sollte der gleiche Puffer eingesetzt werden, mit dem auch die Proben gewonnen bzw. verdünnt wurden.
Optional: Zur Standard- und Probenverdünnung ist der Standardpuffer geeignet.
Alle als Verdünnungsmedium eingesetzten Puffer müssen zur
Stabilisierung 0,1 % Ascorbinsäure enthalten (auch der Standardpuffer).
Die Verdünnung sollte in Polypropylen(PP)röhrchen, in Eppendorf Cups bzw. Reaktionsgefäßen aus PP erfolgen.
Die Standards sollten unmittelbar vor Gebrauch frisch angesetzt werden
6.1.3. Kontrolle 1 & 2 CON 1 & 2
Die mitgelieferten Kontrollen müssen vor dem Einsatz 1:500 verdünnt werden.
Kontrolle 1 (1:500): 5000 µl Verdünnungsmedium 10 µl Kontrolle 1 Kontrolle 2 (1:500): 5000 µl Verdünnungsmedium 10 µl Kontrolle 2 Als Verdünnungsmedium sollte der gleiche Puffer eingesetzt werden, mit dem auch die Proben gewonnen bzw. verdünnt wurden.
Optional kann der Standardpuffer verwendet werden.
Die Kontrollen sollten unmittelbar vor Gebrauch frisch angesetzt werden
6.1.4. Acylierungspuffer ACYL-BUFF
Inhalt des Fläschchens in 4 ml destilliertem Wasser lösen.
200 µl Acylierungspufferkonzentrat ACYL-BUFF-CONC hinzugeben.
Kurz mischen und 30 min auf einen Rollmischer bzw. Horizontal- schüttler legen. Vorsichtig mischen, übermäßige Schaumbildung vermeiden.
Der gelöste Acylierungspuffer muss für den späteren Gebrauch bei -20 °C eingefroren werden und bleibt so bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendbar.
6.1.5. Acylierungsreagenz ACYL-REAG
Inhalt des Fläschchens in je 2,5 ml SOLVENT lösen und für 5 min auf einen Rollmischer bzw. Horizontalschüttler legen. Das Acylierungs- reagenz sollte unmittelbar vor Gebrauch frisch angesetzt werden und nach Gebrauch ist das Restreagenz zu verwerfen. Durch die vier
Fläschchen im Kit ist der ELISA in vier Ansätzen teilbar. Wenn der Kit in einem Ansatz verbraucht werden soll, den aufgelösten Inhalt zweier Fläschchen vereinigen.
Bitte beachten: Solvent reagiert mit vielen Plastikmaterialien, z.B.
Plastikschälchen. Solvent reagiert nicht mit normalen Pipettenspitzen und Glasgefäßen.
Solvent ist leicht flüchtig und verdampft schnell. Daher bitte keine Gefäße zusammen mit Mehrkanalpipetten verwenden, da sie eine hohe Oberfläche besitzen. Bitte Multipetten o.ä. verwenden, das aufgelöste Acylierungsreagenz direkt aus dem Fläschchen aufziehen und Vertiefung für Vertiefung pipettieren.
6.1.6. Waschpuffer WASH
Inhalt des Fläschchens mit destilliertem Wasser auf 500 ml auffüllen.
Der fertige Waschpuffer muss für den späteren Gebrauch bei 2 - 8 °C gelagert werden und bleibt so für 4 Wochen verwendbar.
Alle anderen Reagenzien sind gebrauchsfertig.
6.2. Probenvorbereitung (Acylierung)
Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. Es empfiehlt sich, Doppelbestimmungen anzusetzen.
Die für die Acylierung verwendeten Vertiefungen der Reaktionsplatte markieren (Edding) und nicht noch einmal verwenden!
1. Je 25 µl Acylierungspuffer in alle zu verwendenden Vertiefungen der Reaktionsplatte pipettieren.
2. Je 20 µl verdünnter Standard 1 - 6, Kontrolle 1 & 2 und Probe in die jeweiligen Vertiefungen pipettieren.
Platte kurz schütteln.
3. Je 10 µl frisch zubereitetes Acylierungsreagenz in alle Vertiefungen pipettieren (Rotfärbung) und sofort mit Punkt 4. fortfahren.
Solvent ist leicht flüchtig und verdampft schnell. Daher bitte keine Gefäße zusammen mit Mehrkanalpipetten verwenden, da sie eine hohe Oberfläche besitzen. Bitte Multipetten o.ä. verwenden, das aufgelöste Acylierungsreagenz direkt aus dem Fläschchen aufziehen und Vertiefung für Vertiefung pipettieren.
4. Platte 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontal- schüttler inkubieren, dabei darf die Platte keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt sein.
Platte nicht abkleben oder abdeckeln, Platte offen schütteln.
5. Je 25 µl Deaktivator in alle Vertiefungen pipettieren.
6. Platte mit Haftklebefolie abdecken und 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler inkubieren, dabei darf die Platte keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt sein.
Je 50 µl der so vorbereiteten Proben werden in dem ELISA eingesetzt.
7. Testdurchführung ELISA
Die Reagenzien auf Raumtemperatur bringen und sorgfältig mischen, Schaumbildung vermeiden.
1. Je 50 µl vorbereitete Standards 1 bis 6, Kontrollen und Proben in die Vertiefungen der Mikrotiterstreifen pipettieren.
2. Platte mit Haftklebefolie abdecken und 15 - 20 Stunden (über Nacht) bei 2 - 8 °C inkubieren.
3. Vertiefungen entleeren, mit ca. 300 µl Waschpuffer füllen und wieder entleeren. Anschließend die Mikrotiterstreifen umgedreht auf eine saugfähige Unterlage (Papierhandtuch) legen und kurz ausklopfen, um alle Flüssigkeitsreste zu entfernen. Diesen Vorgang insgesamt 3 - 4 mal durchführen.
4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugat in alle Vertiefungen pipettieren.
5. 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler inkubieren.
6. Waschen: Wie unter Punkt 3. beschrieben.
7. Jeweils 100 µl Substrat in alle Vertiefungen pipettieren.
8. 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 °C bis 25 °C) auf einem Horizontalschüttler inkubieren.
9. Jeweils 100 µl Stopplösung in alle Vertiefungen pipettieren.
10. Streifen sofort (innerhalb 10 Minuten) im Mikrotiterplattenphotometer bei einer Messwellenlänge von 450 nm (Referenzwellenlänge zwischen 570 nm und 650 nm) messen.
8. Auswertung
Die OD-Werte der Standards (linear) werden gegen die entsprechenden Konzentrationen der Standards (logarithmisch) aufgetragen. Die Konzentrationen der Kontrollen und der Proben können dann direkt aus der Eichkurve in pg/sample abgelesen werden.
Die folgende Abbildung zeigt ein typisches Beispiel einer Standardkurve.
Serotonin conc. (pg/sample)
0,1 1 10 100 1000
0,16 0,66 1,16 1,66 2,16
Serotonin-Sensitive
y = ( (A - D)/(1 + (x/C)^B ) ) + D: A B C D R^2
Std (Standards: Concentration vs MeanValue) 2,612 1,089 3,791 0,154 1
9. Testcharakteristika
9.1. Sensitivität
Die untere Nachweisgrenze wurde bestimmt, indem die 2-fache Standardabweichung der optischen Dichte (OD) des Nullstandards gemessen und die entsprechende Konzentration an der Standardkurve abgelesen wurde.
Sensitivität : 0,39 pg/sample
9.2. Spezifität (Kreuzreaktivitäten)
Der in dem Test verwendete Antikörper ist spezifisch für Serotonin.
Getestet wurden die Kreuzreaktivitäten zu Tryptamin, 5- Methoxytryptamin, 5-Hydroxytryptophan, Melatonin, 5-HIAA, L- Tryptophan.
Substanz 50% Inhibition
(pg/sample) Kreuzreaktivität (%)
Serotonin 4,3 100
Tryptamin 1.996 0,22
5-Methoxytryptamin 17.083 0,025
5-Hydroxytryptophan 207.551 0,0021
Melatonin 677.434 < 0,001
5-HIAA > 2.000.000 < 0,001 L-Tryptophan > 20.000.000 < 0,0001
9.3. Reproduzierbarkeit
Die Reproduzierbarkeit des Serotonin-Sensitive-ELISAs wurde durch die Ermittlung des Intra-Assay-Variationskoeffizienten gezeigt:
Konzentrationsangaben in pg/sample
Intra-Assay
Probe Anzahl n Mittelwert SD VK (%)
1 40 4,7 0,41 8,7
2 40 11,9 0,79 6,6
10. Literatur
• Harenberg, J., Huhle, G., Giese, Ch., Wang, L., Feuring, M., Song, X., Hofmann, U.
Determination of serotonin release from platelets by enzyme immunoassay in the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia British Journal of Hematology, 109, 182-186 (2000)
• Balaskas, E., Bamihas, G., Karamouzis, M., Voyiatzis, G., Tourkantonis, A.
Histamine and Serotonin in uremic pruritus: effect of ondansetron in CAPD-pruritic patients
Nephron, 78:395-402 (1998)
• Stratz, T., Samborski, W., Hrycaj, P., Pap, T., Mackiewicz, S., Mennet, P., Müller, W.
Die Serotoninkonzentration im Serum bei Patienten mit generalisierter Tendomyopathie (Fibromyalgie) und chronischer Polyarthritis
Medizinische Klinik, 88, 458-462 (1993)
• Attanasio, A. et al.
Diurnal rhythms of N-acetylserotonin and serotonin J. Pineal res. 3 (1986), 251 - 256
• Kema, I.P. et al.
Influence of a Serotonin- and Dopamine-Rich Diet on Platelet Serotonin Content and Urinary Excretion of Biogenic Amines and Their Metabolites Clin. Chem. 38/9 (1992), p.1730 – 1736
• Kema, I.P. et al.
Improved Diagnosis of Carcinoid Tumors by Measurement of Platelet Serotonin
Clin. Chem. 38/4 (1992), p. 534 - 540
Pipettierschema Probenvorbereitung
Standards Kontrollen Proben
Acyl. Puffer µl 25 25 25
verd. Standard 1- 6 µl 20
verd. Kontrolle 1 & 2 µl 20
Proben µl 20
Platte kurz schütteln
frisch angesetztes
Acylierungsreagenz µl 10 10 10
Platte nicht abkleben oder zudeckeln, Platte offen schütteln.
60 Minuten bei Raumtemperatur schütteln
Deaktivator µl 25 25 25
Platte abkleben
3 Stunden bei Raumtemperatur schütteln
50 µl Überstand im ELISA einsetzen
Pipettierschema ELISA
Standards Kontrollen Proben
Standard 1-6 µl 50
Kontrolle 1 & 2 µl 50
Proben µl 50
Platte abkleben
15 – 20 Stunden (über Nacht) bei 2 - 8 °C inkubieren
3 - 4 x Waschen
Enzymkonjugat µl 100 100 100
60 Minuten bei Raumtemperatur schütteln
3 - 4 x Waschen
Substrat µl 100 100 100
20 - 30 Minuten bei Raumtemperatur schütteln
Stopplösung µl 100 100 100
Messung der Extinktion bei 450 nm
