5.1 Untersuchungen am Hormaomycin-Produzenten Streptomyces griseoflavus (Stamm W 384)
Produktionsoptimierung
Durch Fütterung von 2-Pyrrolcarbonsäure zu 1 L-Kulturen von Streptomyces griseoflavus (Stamm W 384) wurde die Ausbeute an Hormaomycin (16) von 15 bis auf 45 mg/L gesteigert. Ein Scale-up unter Verwendung von größeren Fermentern (5–50 L) war nicht möglich.
Vorläufer-dirigierte Biosynthese
Variation der 3-(2’-Nitrocyclopropyl)alanin [(3-Ncp)Ala]-Einheiten
1. Nach Fütterung von L-5-Nitronorvalin und rac-5-Nitronorvalin konnten die neuen Hormaomycine D1–3 (21a–c) isoliert werden. Die Ausbeute an isolierten Derivaten war nicht proportional zur Konzentration des gefütterten Vorläufers. Die Derivate 21a–c enthalten D-5-Nitronorvalin in der Ringeinheit. Durch Fütterung enantiomerenreinen
D-5-Nitronorvalins sank die Ausbeute von 16 auf 5 mg/L, ein Einbau fand nicht statt.
2. Der erwartete Einbau von 2-(2’-Nitrocyclopropyl)glycin [(2-Ncp)Gly] anstelle von (3-Ncp)Ala in 16 war nach Fütterung von L-Ornithin im Rohextrakt der Kulturlösung durch
NH
ESI-MS nachweisbar. Eine Isolierung des neuen Derivates gelang wegen seines geringen Gehalts nicht.
3. Die Fütterung von (2-Ncp)Gly ergab keinen Einbau der intakten Aminosäure in das Peptidlacton. Stattdessen enstanden die Derivate 21a–c. Für die Ringöffnung des (2-Ncp)Gly zum 5-Nitronorvalin konnte ein Mechanismus postuliert werden.
4. Bei Fermentationen unter Zugabe von L-6-Nitronorleucin und rac-6-Nitronorleucin entstanden die neuen Hormaomycine E1–3 (26a–c). Durch HR-ESI-MSn konnte ein Fragmentierungsschema gewonnen werden, was die aus NMR-Spektren abgeleiteten Strukturen zusätzlich stützt. Die Fütterung des D-Epimers der nichtproteinogenen Aminosäure führt neben einem Absinken der Hormaomycin-Produktion (3 mg/L) zu keinem der neuen Derivate.
5. L-5-Nitro-4-thianorvalin und L-ortho-Nitrophenylalanin werden von der Hormaomycin-Synthetase nicht akzeptiert. In beiden Fütterungsexperimenten sinkt die Ausbeute des Naturstoffs 16 unter die der Standardfermentation ohne Zugaben.
Variation der β-Methylphenylalanin [(βMe)Phe]-Einheiten
1. Nach Fütterung von ortho- und meta-Fluorphenylalanin konnte Hormaomycin (16) im Gemisch mit den fluorierten Hormaomycinen F1–3 (30a–c) bzw. G1–3 (31a–c) isoliert werden.
2. Durch Zugabe von para-Fluorphenylalanin zu Streptomyces griseoflavus (Stamm W 384) konnten neben den mono-Fluorhormaomycinen H1,2 (32a,b) die Monodesmethyl-hormaomycine J1,2 (33a,b) gewonnen werden.
3. Fütterungen von para-Chlor- und para-Bromphenylalanin ergaben neben 33a,b das Didesmethylhormaomycin J3 (33c) in unterschiedlichen Ausbeuten. Während bei Zusatz von para-Nitrophenylalanin 33a,b zu beobachten waren, führte die Fütterung von Tyrosin ausschließlich zur Produktion des Naturstoffs 16.
4. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die (βMe)Phe-Domänen der Hormaomycin-NRPS Phenylglycin nicht als Substrat akzeptieren.
Variation der 5-Chlor-N-hydroxypyrrol-2-carbonsäure (Chpca)-Einheit
1. Nach Fütterungen von Furan-, Tetrahydrofuran-, Pyrrol- und Thiophen-2-carbonsäure sowie Picolin-, Pipecolin- und 3-Chlorsalicylsäure konnte immer nur 16 gewonnen werden.
2. Die Zugabe von Pyrrol-2-carbonsäure führte zu einem starken Produktionsanstieg von 16.
Bei Zusatz von 2 mmol/L betrug die Ausbeute bis zu 45 mg/L (ca. 300 %), bei 1 mmol/L 21 mg/L (ca. 150 %). Eine Erhöhung der Konzentration bis zu 8 mmol/L ergab keinen weiteren Produktionsanstieg.
Die Biosynthese des Hormaomycins
1. Die Ergebnisse der Vorläufer-dirigierten Biosynthese zeigen:
a) 6-Nitronorleucin als Intermediat sowie eine externe Epimerase können für die Biosynthese von (3-Ncp)Ala ausgeschlossen werden;
b) die Methyltransferase in der (βMe)Phe-Biosynthese kann durch para-halogenierte und nitrierte Phenylalanine inhibiert werden;
c) Pyrrol-2-carbonsäure ist ein Intermediat der Chpca-Biosynthese. Ihre Verfügbarkeit bestimmt die Ausbeute an 16.
2. Beim HPLC-MS-Screening von Extrakten der Mutanten E. coli pKZ72 und pKZ73, in welchen die Biosyntesegene hrmS und hrmI, hrmJ exprimiert wurden, konnten weder (βMe)Phe noch (3-Ncp)Ala nachgewiesen werden. Somit fehlt weiterhin der endgültige Beweis, dass der Hormaomycin-Biosynthesegencluster gefunden wurde (AK PIEL, Universität Bonn).
Die Struktur des Hormaomycins
1. Nach der Gewinnung von Hormaomycin (16) in gut aufgereinigter Form gelang der Arbeitsgruppe SHELDRICK die Kristallisation und eine Röntgenstrukturanalyse, der ein dimerer Metall-Komplex des Naturstoffs zugrunde liegt.
2. Durch eine ICP-MS-Untersuchung konnte gezeigt werden, dass im dimeren 16 mit Natrium, Calcium und Zink ein Gemisch von Metallionen enthalten ist.
3. Durch Ionenaustauschchromatographie und nachfolgende Beladung von 16 mit verschiedenen Metallionen wurden Konformationsänderungen in 16 erreicht und somit der Grund für die Unterschiede in 1H-NMR-Spektren verschiedener Fermentationsansätze sowie zwischen Syntheseprodukt und Naturstoff aufgeklärt.
Biologische Aktivitäten der Hormaomycinderivate
1. Die antimikrobiellen Aktivitäten aller Derivate wurden ermittelt und entsprechen gegen Arthrobacter sp. mit 60–100 % der des Naturstoffs. Für Hormaomycin D2 (21b) konnte zusätzlich eine hohe Aktivität gegen Candida albicans nachgewiesen werden, weder 16 noch andere Derivate besitzen antimykotische Aktivitäten.
2. Für alle Derivate konnten gegen Plasmodium falciparum (IC50 = 0.08–1.66 μg/mL) und Leishmania donovanii (IC50 = 0.13–0.71 μg/mL) sehr gute, sowie gegen Trypanosoma sp.
(IC50 = 5.5–17.7 μg/mL) moderate in vitro Aktivitäten nachgewiesen werden. Die therapeutische Breite der Peptidlactone gegen Plasmodium falciparum ist aufgrund geringer Cytotoxizität als gut einzustufen. Für 16 verliefen Tests zur in vivo Aktivität gegen Plasmodium berghei negativ. Erkenntnisse zu Struktur-Wirkungsbeziehungen wurden diskutiert.
3. Die Tests der mit Metallionen angereicherten Hormaomycine zeigen, dass Aktivität und Cytotoxizität vom gebundenen Ion abhängen, was für keinen antiparasitären Wirkstoff literaturbekannt ist.
5.2 Strukturaufklärung von Sekundärmetaboliten
Sieben Stämme aus Portugal und der Mongolei wurden einem chemischen Screening nach dem OSMAC-Ansatz unterzogen und zwei zur weiteren Bearbeitung ausgewählt.
1. Aus dem Kulturfiltrat- und Mycelextrakt von Actinomyces sp. Stamm P4 konnte der bekannte Metabolit Chartreusin (44) in guten Ausbeuten isoliert werden.
2. Von den drei im chemischen Screening von Actinomyces sp. Stamm M4-1 aufgefallenen Substanzen erwiesen sich mit Genistein (45) und Daidzein (12a) zwei als Nährmedienbestandteile, der dritte Metabolit ist das ebenfalls bekannte Borrelidin (15).
Die als Reinsubstanzen vorliegenden Metaboliten im Kooperationsprojekt mit PROF. DR. H.-P.FIEDLER (Mikrobiologisches Institut, Universität Tübingen) aus Streptomyces sp. Stamm Tü 6319 wurden in ihrer Struktur aufgeklärt. Für die aus Streptomyces sp. Stamm Tü 2561 isolierte Substanz 2561-1 (57) konnten Partialstrukturen ermittelt werden, die auf ein neues, ungewöhnlich großes Makrolid hinweisen. Die Metaboliten wurden aus Kultivierungsansätzen von jeweils 10 L isoliert.
Aus dem Kulturfiltratextrakt von Stamm Tü 6319 konnten die bekannten Metabolite Germicidin A (49), Germicidin B (50), Ferulasäure, SEK4b (47) und anhydroSEK4b (48) in ihrer Struktur aufgeklärt werden. Weiterhin konnte mit Fogacin (46) ein neues Octaketid isoliert und in seiner Struktur aufgeklärt werden. Die Metaboliten 47 und 48 sind als Shuntmetaboliten aus Actinorhodin-Deletionsmutanten bekannt und konnten erstmals in einem Wildstamm nachgewiesen werden. Ihre und die vermutliche Biosynthese von 46 werden vergleichend diskutiert. Für 48 ließ sich eine moderate Aktivität gegen Bacillus subtitlis DSM 10 und Streptomyces viridochromogenes Tü 57 nachweisen.
O CH3
OH O OH
O
OH
46 C O
OH
OH O
OH N O
15
5.3 Untersuchungen am Borrelidin-Produzenten Streptomyces sp.
S 1495
1. Die bisherigen molekulargenetischen Untersuchungen zur Biosynthese von Borrelidin (15) wurden diskutiert. Zur Verifizierung der Befunde wurden Fütterungen mit isotopenmarkierten Vorläufern ([1-13C]-, [2-13C]-, [1,2-13C2]- und d3-Acetat;
[1-13C]Propionat; [U-13C3]Glycerin; [1-13C]- und 2,3,5,6-d4-Tyrosin) durchgeführt.
2. Während sich die von LEADLAY und SALAS postulierte Biosynthese des Borrelidin-Makrolidrings durch die Fütterungen bestätigen ließ, gibt es keine Hinweise darauf, dass die Bildung der trans-Cyclopentan-(1R,2R)-dicarbonsäure (59) von Tyrosin ausgeht. Der erkennbare Einbau von Acetat und Glycerin spricht für einen Aufbau aus Bausteinen des Kohlenhydratpools, bzw. Citratcyclus. Ein Beweis dafür steht noch aus.
3. Erste Versuche zur Vorläufer-dirigierten Biosynthese an Streptomyces sp. S 1495 wurden durchgeführt, eine mangelnde Substratflexibilität der beteiligten Enzyme konnte nachgewiesen werden.