CENTRE DE RECHERCHE PUBLIC- GABRIEL LIPPMANN- (CRP-GL), Luxemburg
UNIVERSITE PARIS-XI. EMGREF, Laboratoire Evolution et Systématique, Orsay, Frankreich
TEAGASC, Kinsealy Research Centre, Dublin, Irland
INSTITUT FÜR PFLANZENKULTUR (IFP), Schnega, Deutschland VITROFORM, Arslev, Dänemark
8 Anhang
Anhang Englische Zusammenfassung bekannter Veröffentlichungen zur in vitro Kultur von Fraxinus spp. Fraxinus excelsior SterilisationMedium Growth regulators Type of development Reference e s
1 min alcohol 70% 15 min NaOCl 1.5% 4 h washing in sterile tap water 15 min NaOCl 1.5% 3 times washing in sterile tap water
1) MS macrosalts 0.75 strength* 2) WPM macrosalts full strength* 3) WPM macrosalts 0.5 strength* *MS microsalts 0.5 strength, NaFeEDTA 37.5 mg/l, Sucrose 2 %, MS vitamins, ascorbic acid 2 mg/l, biotin 1 mg/l, meso- inositol 100 mg/l, Daichin Agar 0.65 %, pH 6 1)2) PBA 3 mg/l IBA 0.15 mg/l 3) IBA 1 mg/l
shoot growth of adult axillary buds and shoot tips, shoot elongation, axillary branching, rooting (best results after 4 days of initial darkness)
Pierik and Sprenkels (1997). In: Biotech. in Agriculture and Forestry 39. Bajaj (Ed.). Springer Verlag s 20 min 10 % domestos commercial bleach solution rinse with water
1) DKW 2) DKW 3) WPM 0.5 strength 4) MS 1) ----- 2) BAP 22.2 µM/l 3) IBA 4.9 µM/l PG 1 mM 4) TDZ 0.97 mg/l shoot growth, rooting of shoots, production of adven- titious shoots from young leaves, rooting of shoots
Hammatt (1996). In: Biotech. in Agriculture and Agriculture and Forestry 39. Bajaj (Ed.). Springer Verlag s, s
40 min aqueous solution of HgCl2 and sodium lauryl sulfate (SDS) 40 min 9 % (w/v) Ca(Cl)2 (buds) 20 min 5 % (w/v) Ca(Cl)2 hypochlorite (active growth) rinse 3 times in sterile water 1) QL or WPM 2) QL or WPM 3) WPM 0.5 strength + sterilised 4) peatperlite vermiculite mixture 1) ----- 2) BAP 4 mg/l IBS 0.01 mg/l 3) ----- shoot development from apical and axillary buds, shoot elongation, formation of callus, rooting of shoots
Silveira and Cottignes (1994). Canadian journal of Botany72: 261- 267 s no comments 1)2)3) QL and iron complex with ethylene diamine
1)2)3) BAP 1 mg/l IAA 0.2 mg/l shoot development from axillary buds, roots appear without any transfer to rooting media Leforestier et al. (1990). In: Proc. of 7th Int. Congr. on Plant, Tissue and Cell Culture. Amsterdam, 112
Anhang Anhang 1 Englische Zusammenfassung bekannter Veröffentlichungen zur in vitro Kultur von Fraxinus spp. 1. Micropropagation of Fraxinus excelsior Tree ageExplant source SterilisationMedium Growth regulators Type of development Reference bred mother tree
nodal segments • 7 min 0.2 % HgCl23) WPM + mesoinosite 30mg/l 5) Zeolite/sand/soil 1:1:3 3) BAP 0.05-0.1 mg/l IAA 0.7-1.5 mg/l 5) ----- induces rhizogenesis under in vitro conditions, adaptation to green- house conditions
Garelkova et al. (1991). Comptés Rendus de l`Ácademie Bulgare des Sciences 44 :105- 108 mature trees shoot tips or buds • washing • 10 min 0.1 % HgCl2 • rinse once in sterilised water • 20 min 7% calcium hypochlorite • wash 3 times in sterile water • dry in the laminar flow cabinet
2) MS/Vit. B5 QRC (hormone free Medium) change of the media every 5-6 weeks 3) MS 1/10 strength 2) BAP 5 mg/l TDZ 1.1 mg/l IBA 0.2 mg/l 3) IBA 5-10 mg/l shoot development from shoot tips and buds, elongation, adventitious shoot formation, rooting of the shoots
Douglas and Mc Namara (2000). Teagasc, Dublin 1) = Conditions for initiation and isolation 2) = Conditions for shoot multiplication 3) = Conditions for rooting 4) = Conditions for adventitious shoot development 5) = Greenhouse conditions 6) = Germination
Anhang Englische Zusammenfassung bekannter Veröffentlichungen zur in vitro Kultur von Fraxinus spp. Fraxinus ssp. SterilisationMedium Growth regulators Type of development Reference • 20 min 0.5 %NaOCL + Tween 20 • 3 x 5 min washing in sterilised deionized water
1) WPM 2) liquid WPM 3) WPM
1) ----- 2) BAP 5 - 10mg/l 3) IBA 0.1 - 1mg/l + 10 g/l activated charcoal or moistened vermiculite shoot elongation, branching (only on white ash), rooting of shoots
Preece et al. (1987). Proceedings, Inter- national Plant Pro- pagators` Society, 37: 366-373. ot • stems were rinsed for 12 h in running tap water • 30 sec 70 % ethanol 0.1 % Tween 80 • 15 min 3 % NaOCl •
1) liquid Rugini (Rugini, 1986) 2) solidified Rugini 3) Heller medium (Heller, R. 1953) 1) BAP 22.2 µM 2) ----- 3) BAP 0.4 µM NAA 2.5 µM axillary bud de- velopment, shoot proliferation, elongation, rooting of the shoots
Arrilaga et al. (1992). J. Amer. Soc. Hort. Sci. 117: 346-350 ne e
• 30 min 1.6 % NaOCl • rinse 3 times in sterile distilled water
1) Ql 2) DKW 3) WPM
1) ----- 2) BAP 4.4 µM IBA 0,98 µM 3) IBA 0.98- 4.9 µM axillary bud de- velopment, shoot proliferation, elongation, rooting of the shoots
Perrez-Parron et al. (1994). Pl. Cell Tissue and Organ Culture Vol. 37: 297-302 n and isolation shoot multiplication 3) = Conditions for rooting 4) = Conditions for adventitious shoot development 5) = Greenhouse conditions 6) = Germination
Anhang Anhang 1 Englische Zusammenfassung bekannter Veröffentlichungen zur in vitro Kultur von Fraxinus spp. 3. Establishment of shoot cultures with embryos of Fraxinus spp. Explant source Sterilisation of seeds Medium Growth regulators Type of development Reference Fraxinus angustifolia• seeds were scarified with sandpaper • 30 min 2.4 % NaOCl • rinsed three times in sterile distilled water
6) MS 2) QL 3) WPM
6) ----- 2) BAP 8,9 µM IBA 0.49 µM 3) IBA = 0.98-4.9 µM germination, shoot multiplication, rooting of the shoots
Perrez-Parron et al. (1994). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 37: 297-302 F. americana , F. pennsylvanica Marsh. F. angustifoliaVahl. ssp.
• 30 min 1 % NAOCl + 0.01 % Tween 20 • rinse 3 x 5 min in sterile deionized water • one third of the opposite radicle was dissected 6) MS 2) MS 3) peat plugs
6) 2) TDZ 1 µM 3) ----- germination. shoot multiplication, rooting of the shoots
Preece et al. (1995). Can. Journal of Forest Ressearch 25: 1368-1374 Fraxinus excelsior L.• 10 min 0.8 % NaOCl • rinsing • soak seeds for 48 hours in sterile water 4 °C • resterilise seeds
6) MS 0.5 strength 2) DKW 3) WPM 0.5 strength 4) MS
6) ----- 2) BAP 22.2 µMol 3) IBA 4.9 µMol+PG 1 mM after 21 days transfer to hormone free WPM 4) from leaves: TDZ 4.4 µM from embryo hypocotyl: TDZ 0.44 µM + IBA 0.49 µM from cotyledons: TDZ 0.22 µM + IBA 0.49 µM germination, development of shoots from seedlings, rooting of shoots, adventitious shoots
Hammatt (1996). In: Biotechnology in Agriculture and Forestry 39. Bajaj (Ed.). Springer Verlag Fraxinus excelsior L. Fraxinus angustifolia (Vahl.)
• 20 min 0.3 M NaOH • over night 0.2 % Ca(ClO)2 at 4°C • 2 h 2 % Ca(ClO)2 at room temperature 6) H0 and H10: modified MS 2) H10: modified MS - germination Raquin et al. (2002). Annals of Forest Science 59:219- 224.
Anhang rce Sterilisation of seeds Medium Growth regulators Type of development Reference • 1min 70 % ethanol • 10min 1,05 % NaOCl • five rinses in sterile, distilled water
6) MS+B5 Vitamins 2) MS+B5 Vitamins 3) MS+B5 Vitamins 6) ----- 2) TDZ 5 µM BAP 5 µM IBA 1 µM 3) IBA 5 µM germination, stable axillary shoot proliferation, rooting of shoots
Kim et al. (1997). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 48: 45-52 Kim. et al. (1998). New Forests 16: 43- 57 ifolia • 3 min 70 % ethanol • 20min 1.8 % NaOCl • 3 rinses in sterile distilled water
6) MS (O.5 strength) 2) DKW 3) WPM 6) BAP 2.2 µM 2) BAP 2.2 µM 3) -----
germination, bud development (Duchefa Gelrite positively affected the number of new buds), rooting of shoots
Tonin et al. (2001). Scientia Horticulture 87: 291-301 n and isolation shoot multiplication 3) = Conditions for rooting 4) = Conditions for adventitious shoot development 5) = Greenhouse conditions 6) = Germination g bur culture Medium poivre
IBA = Indole-3-butyric acid BAP = 6-Benzylaminopurine PBA = 6-(benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine EDTA = ethylene-diamine- tetra-acetate PG = 1,3,5 trihydroxybenzene (phloroglucinol) TDZ = Thidiazuron (N-phenyl-N´-1,2,3-thidiazol-5-ylurea
Anhang 2
Zusammenstellung der Anzahl von Kulturen etabliert aus zygotischen Embryonen von Fraxinus excelsior. Die Zahlen geben den Stand im Januar 2005 wieder. Dargestellt sind die Anzahl an in vitro Kulturen in der aktuellen Kultivierungsphase (in vitro), die Anzahl der bewurzelten Pflanzen ex vitro (bewurzelt), die Anzahl der im Kühlraum eingelagerten Pflanzen (Kühlraum) und ob die Kulturen kryokonserviert wurden (kryokonserviert).
Klon Etabliert Einzelbaum- in vitro bewurzelt Kühlraum kryokonserviert
von Jahr absaat
126-103.2 NFV-V 2002 Far 126-103 96 ja
126-103.3 NFV-C 2002 Far 126-103 48
126-103.4 NFV-C 2002 Far 126-103 96
129-6.1 NFV-C 2001 Wolf 129-6 96 ja
129-6.2 NFV-C 2001 Wolf 129-6 24 96
134-6.2 NFV-C 2002 SooA 134-6 96 ja
134-6.3 NFV-C 2002 SooA 134-6 28 96
16-1.1 NFV-C 2001 Bov 16-1 37 96 ja
16-1.2 NFV-C 2001 Bov 16-1 30 96
16-1.3 NFV-C 2001 Bov 16-1 96
47-1.1 NFV-C 2001 Wenz 47-1 32
47-1.2 NFV-C 2001 Wenz 47-1 80
47-1.3 NFV-C 2001 Wenz 47-1 80 28
47-1.5 NFV-C 2001 Wenz 47-1 96 ja
67-2.1 NFV-C 2002 Walk 67-2 32 41 96 ja
67-2.2 NFV-C 2002 Walk 67-2 96
7-3.2 NFV-C 2001 ElmEvl 7-3 6
7-3.3 NFV-C 2001 ElmEvl 7-3 16
S 8 Teagasc - - 61 96 ja
Anhang 3
Herkunft der 31 ausgewählten (29.03.01) Plusbäume des Eschen Herkunfts-/ Nachkommen-schaftsversuchs im Forstamt Bovenden und Anzahl der produzierten Pfropflinge und ihre Anwuchsrate. Von jedem Klon wurden mindestens zwei und maximal fünf Pflanzen zu Versuchszwecken genutzt, der Rest wurde an Projektpartner verschickt.
Nr. Klonname Familienname Pfropfdatum
19.04.01
Anwuchserfolg am 13.11.01
no Pfropflinge n [%]
1 Bov 77-1 Kelheim3 8 6 (75)
2 Bov 77-2 Lüchow 326-2 8 7 (88)
3 Bov 77-3 Lüchow 326-2 8 8 (100)
4 Bov 77-4 Geislingen 3 8 4 (50)
5 Bov 77-5 Öhringen 1 8 5 (63)
6 Bov 77-6 Wienhausen 4-3 8 8 (100)
7 Bov 77-7 Witzenhausen 7 8 7 (88)
8 Bov 77-8 Lichtenfels 3 8 7 (88)
9 Bov 77-9 LWK Cloppenburg 1 8 7 (88)
10 Bov 77-10 Kelheim 1 8 6 (75)
11 Bov 77-11 Montabaur 2 8 7 (88)
12 Bov 77-12 Sinntal 1 8 8 (100)
13 Bov 77-13 Stauffenburg 2 45 B/4 8 6 (75)
14 Bov 77-14 Giengen 1 8 7 (88)
15 Bov 77-15 Busschewald 2 8 6 (75)
16 Bov 77-16 Geislingen 2 8 2 (25)
17 Bov 77-17 Farchau 126-1 8 7 (88)
18 Bov 77-18 Mellrichstadt 3 8 7 (88)
19 Bov 77-19 Mellrichstadt 3 8 8 (100)
20 Bov 77-20 Paderborn 34 8 8 (100)
21 Bov 77-21 Lichtenfels 3 8 6 (75)
22 Bov 77-22 Lichtenfels 3 8 8 (100)
23 Bov 77-23 Rendsburg 13-1 8 8 (100)
24 Bov 77-24 Wieselburg 4-1 8 5 (63)
25 Bov 77-25 Wieselburg 4-1 8 8 (100)
26 Bov 77-26 Spießingshol 3 8 5 (63)
27 Bov 77-27 Spießingshol 3 8 6 (75)
28 Bov 77-28 Mellrichstadt 1 7 7 (100)
29 Bov 77-29 Kehlheim 2 6 2 (33)
30 Bov 77-30 Kehlheim 3 8 5 (63)
31 Bov 77-31 Kehlheim 3 8 5 (63)
Gesamt 2451 1961 (802)
1Anzahl der Pfropflinge. 2Mittelwert des Anwuchserfolges [%]
Anhang 4
Herkunft der 31 ausgewählten (26.04.01) Plusbäume des Eschen Herkunfts-/ Nachkommen-schaftsversuch im Forstamt Dannenberg und Anzahl der hergestellten Pfropflinge und ihre Anwuchsrate. Von jedem Klon wurden mindestens zwei und maximal sechs Pflanzen zu Versuchszwecken genutzt, der Rest wurde an Projektpartner verschickt.
Nr. Klonname Familienname Pfropfdatum
12.03.02 Anwuchserfolg 13.12.02 Anzahl Pfropflinge n (%)
1 Dan 519-1 Montabaur 5 11 8 (73)
2 Dan 519-2 Lichtenfels 1 11 7 (64)
3 Dan 519-3 Rosenau 2 11 8 (73)
4 Dan 519-4 Lüchow 5 12 8 (67)
5 Dan 519-5 Lensahn 2 11 10 (91)
6 Dan 519-6 Lauterberg 7 11 8 (73)
7 Dan 519-7 Weissenhorn 1 12 12 (100)
8 Dan 519-8 Dierdorf 2 11 9 (82)
9 Dan 519-9 Rosenau 5 11 9 (82)
10 Dan 519-10 Lüchow 2 11 9 (82)
11 Dan 519-11 Lutter 1 11 9 (82)
12 Dan 519-12 Montabaur 5 11 9 (82)
13 Dan 519-13 Lüchow 4 11 9 (82)
14 Dan 519-14 Wieselburg 4 11 9 (82)
15 Dan 519-15 Lahr 5 11 11 (100)
16 Dan 519-16 Farchau 1 11 11 (100)
17 Dan 519-17 Rosenau 1 11 10 (91)
18 Dan 519-18 Lensahn 3 11 9 (82)
19 Dan 519-19 Lensahn 3 11 8 (73)
20 Dan 519-20 Busschewald 5 11 9 (82)
21 Dan 519-21 Dierdorf 5 11 11 (100)
22 Dan 519-22 Kelheim 4 11 9 (82)
23 Dan 519-23 Kelheim 4 11 11 (100)
24 Dan 519-24 Lüchow 1 11 10 (91)
25 Dan 519-25 Aargau - Muri 1 11 10 (91)
26 Dan 519-26 Farchau 5 11 9 (82)
27 Dan 519-27 Schöningen 3 11 10 (91)
28 Dan 519-28 Lüchow 2 11 9 (82)
29 Dan 519-29 Lüchow 2 11 10 (91)
30 Dan 519-30 Busschewald 1 11 10 (91)
31 Dan 519-31 Lüchow 2 11 11 (100)
Gesamt 343 2921 (852)
1Anzahl der Pfropflinge. 2Mittelwert des Anwuchserfolges [%]
Anhang 5
Zusammenstellung der Anzahl von Kulturen etabliert von Pfropflingen der selektierten Plusbäume.
Die Zahlen geben den Stand im Januar 2005 wieder. Dargestellt sind die Anzahl an in vitro Kul-turen in der aktuellen Kultivierungsphase (in vitro), die Anzahl der bewurzelten Pflanzen ex vitro (bewurzelt), die Anzahl der im Kühlraum eingelagerten Pflanzen (Kühlraum) und ob die Kulturen kryokonserviert wurden (kryokonserviert).
Klon Etablierungsjahr Familie in vitro bewurzelt Kühlraum kryokonserviert
Bov 77-2 2002 Lüchow 326-2 61 96 ja
Bov 77-3 2002 Lüchow 326-2 95 96 ja
Bov 77-5 2002 Öhringen 1 18 96 ja
Bov 77-12 2002 Sinntal 1 27 ja
Bov 77-19 2002 Mellrichstadt 3 11 96 ja
Bov 77-23 2002 Rendsburg 13-1 31 96 ja
Bov 77-24 2002 Wieselburg 4-1 27 96 ja
Bov 77-2 2003 Lüchow 326-2 17 96 ja
Bov 77-8 2003 Lichtenfels 3 58 13
Bov 77-9 2003 LWK Cloppenburg 1 54
Bov 77-12 2003 Sinntal 1 23 ja
Bov 77-15 2003 Busschewald 2 45
Bov 77-23 2003 Kelheim 4 96 ja
Bov 77-27 2003 Schöningen 3 37 96 ja
Dan 519-1 2003 Montabaur 5 90 26
Dan 519-2 2003 Lichtenfels 1 96 ja
Dan 519-4 2003 Lüchow 5 96 ja
Dan 519-5 2003 Lensahn 2 96 ja
Dan 519-6 2003 Lauterberg 7 91
Dan 519-9 2003 Rosenau 5 32
Dan 519-10 2003 Lüchow 4 96 ja
Dan 519-12 2003 Montabaur 5 63
Dan 519-16 2003 Farchau 1 96 ja
Dan 519-20 2003 Busschewald 5 100 ja
Dan 519-21 2003 Dierdorf 5 41 96 ja
Dan 519-27 2003 Schöningen 3 96 ja
Dan 519-28 2003 Lüchow 2 2
Bov 77-3 2004 Lüchow 326-2 36
Dan 519-7 2004 Weissenhorn 1 21
Dan 519-18 2004 Lensahn 3 96 ja
Anhang 6
Anzahl und Erfolg der mit dem optimierten Bewurzelungsprotokoll behandelten Kulturen im Mai 2005 nach dem Projekt- und Forschungsende im Januar 2005.
Versnr. Klon Medium Pikierdatum n Topfdatum bewurzelt
n bewurzelt
% 1903/03-05 519-2 14/225 24.05.2005 20 13.07.2005 19 95,00 1903/03-19 519-5 14/225 24.05.2005 2 08.07.2005 2 100,00 1903/03-37 519-10 14/225 24.05.2005 24 13.07.2005 22 91,67 1903/04-04 519-16 14/225 24.05.2005 21 13.07.2005 18 85,71
1903/05-07 77-2 14/225 25.05.2005 28 - - -
1903/06-31 77-23 14/225 24.05.2005 63 13.07.2005 63 100,00 1903/06-48 77-27 14/225 24.05.2005 11 13.07.2005 4 36,36 1903/12-25 519-4 14/225 24.05.2005 4 08.07.2005 3 75,00 1903/13-01 77-5 14/225 24.05.2005 99 08.07.2005 90 90,91 1903/13-04 77-24 14/225 24.05.2005 9 13.07.2005 9 100,00 1903/13-07 77-3 14/225 25.05.2005 43 14.07.2005 33 76,74 1903/13-11 77-23 14/225 25.05.2005 33 07.07.2005 30 90,91 1903/14-10 77-19 14/225 25.05.2005 5 14.07.2005 4 80,00 1903/14-22 77-2 14/225 25.05.2005 44 14.07.2005 25 56,82 1904/06-16 519-18 14/225 25.05.2005 30 14.07.2005 17 56,67 1904/03-02 77-8 14/225 20.05.2005 33 12.07.2005 33 100,00 1904/17-02 126-103.1 14/225 20.05.2005 12 12.07.2005 12 100,00 1904/17-03 77-3 14/225 20.05.2005 12 08.07.2005 10 83,33 1904/17-04 77-23 14/225 20.05.2005 8 08.07.2005 8 100,00 1904/17-05 77-5 14/225 20.05.2005 12 12.07.2005 6 50,00 1904/17-06 77-5 14/225 20.05.2005 12 08.07.2005 12 100,00 1904/17-07 77-19 14/225 20.05.2005 5 08.07.2005 5 100,00 1904/17-08 126-103.1 14/225 20.05.2005 12 07.07.2005 12 100,00 1904/17-09 47-1.1 14/225 20.05.2005 5 07.07.2005 3 60,00 1904/17-10 129-6.2 14/225 20.05.2005 12 08.07.2005 9 75,00 1904/20-01 77-8 14/225 20.05.2005 9 08.07.2005 9 100,00 1904/20-02 77-8 14/225 20.05.2005 10 12.07.2005 8 80,00 1904/20-03 77-23 14/225 20.05.2005 6 08.07.2005 6 100,00 1904/20-04 77-23 14/225 20.05.2005 6 08.07.2005 6 100,00 1904/20-05 77-2 14/225 20.05.2005 5 08.07.2005 3 60,00 1904/20-07 77-27 14/225 20.05.2005 1 08.07.2005 1 100,00 1904/20-10 77-3 14/225 20.05.2005 10 08.07.2005 9 90,00 1904/20-15 77-8 14/225 20.05.2005 6 08.07.2005 6 100,00 1904/20-16 77-8 14/225 20.05.2005 6 12.07.2005 5 83,33 1904/20-17 T70 14/225 20.05.2005 9 08.07.2005 9 100,00
Anhang 7
Alginat- / Dehydrations-Methode
Übersetzt aus der Anleitung vom National Clonal Germplasm Repository-Corvallis (Reed 2001 a)
Material
1. Sprosskulturen werden 1 Woche abgehärtet, d.h. bei einem Temperaturwechsel von 22 °C und –1 °C (8 h Licht/ 16 h Dunkelheit) kultiviert
2. Agarplatten zum Aufbewahren der Meristeme nach dem Schneiden. (Man benutzt das reguläre Wachstumsmedium oder hormonfreies MS-Medium)
3. Flüssiges MS-Medium mit 0,75 M Saccharose zur Vorbehandlung (75 ml in 125 ml Erlenmeyerkolben)
4. Flüssiges MS-Medium ohne Calcium und mit 3 % Alginat (Sigma A-2158) und 0,75 M Saccharose
Das Alginat ist schwer zu lösen. Das Medium wird zuerst erhitzt und dann wird das Alginat langsam unter ständigem Rühren dazugegeben. Um die Kugeln zu gießen, benötigt man:
5. Flüssiges MS-Medium mit 100 mM Calciumchlorid (Erlenmeyerkolben) 6. Sterile 250 ml Bechergläser
7. Sterile Pipetten (Einweg-Kunststoff-Pipetten)
8. Sterile Glaspetrischalen mit Filterpapier zum Abtropfen der Alginatkugeln 9. Sterile Petrischalen um die Kugeln während der Dehydrierung aufzubewahren Vorbereitung
• Ein Erlenmeyerkolben mit 0,75 M Saccharose (MS-Saccharose-Medium)
• 250 ml mit Calciumchlorid Medium (MS-CaCl2-Medium),
• 100 ml Becherglas mit Alginat Lösung (20-25 ml) (MS-Alginat ohne Calcium)
• 1 sterile Petrischale und Pipette pro Behandlung (Genotyp)
• Flüssiges MS-Medium (Rehydrierungsmedium)
• Regenerationsmedium, das Regenerationsmedium sollte etwas weicher als das normale Medium sein (1 g Agar/l weniger)
Methode
1. Die Meristeme (0,8 mm) werden präpariert und auf Vermehrungsmedium in Petrischalen gesammelt, bis genügend vorhanden sind.
2. Sie werden dann in ein kleines Becherglas oder in eine Petrischale mit Alginatlösung gelegt.
3. Die Meristeme werden mit der Alginatlösung vermischt. Um die Kugeln (50 mg) zu gießen, werden die Meristeme mit einer sterilen Pipette aufgenommen und in ein 250 ml
5. Die Kugeln werden 18 Stunden in einem 125 ml Erlenmeyerkolben mit MS-Saccharose Medium auf einem Schüttler inkubiert. Die Kugeln werden steril abgesiebt und in eine sterile Petrischale mit Filterpapier gegeben. 25 Kugeln werden in eine 10 cm Petrischale gelegt und im Luftstrom für 3-4 Stunden getrocknet. Sie sollten sich nicht gegenseitig oder die Wand berühren, da sie sonst nicht vollständig trocknen.
6. Die Kugeln werden in sterile Kryoröhrchen gegeben und einmal in den Container mit flüssigem Stickstoff (LN) getaucht, sie werden für 30 Sekunden unter der Oberfläche gehalten und danach an ihren Lagerplatz gegeben.
7. Aufbewahrung in LN für mindestens 1 Stunde oder auch länger
8. Das Auftauen erfolgt bei Raumtemperatur über 20 Minuten. Zur Rehydrierung werden die Kugeln für 5 bis 10 Minuten in flüssiges MS-Medium gegeben. Danach werden die Kugeln so auf das Regenerationsmedium gelegt, dass die Meristemseite nach unten zeigt. Das Regenerationsmedium sollte etwas weicher als das normale Medium sein (1 g Agar/l weniger).
9. Nach zwei Wochen werden die Sprosse, falls nötig von den Kugeln befreit.
10. Die Regeneration erfolgt innerhalb einer Woche.
Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts der Alginatkugeln
• Der Feuchtigkeitsgehalt wird über das Verhältnis Frischgewicht zu Trockengewicht bestimmt. Erwünscht ist ein Feuchtigkeitsgehalt von 15-25 % (18-22 %) des Frischgewichts.
• Um den erforderlichen Feuchtigkeitsgehalt unter den gegebenen Laborbedingungen zu ermitteln, werden 10 Kugeln in Aluminiumschälchen gewogen, für eine bestimmte Zeit getrocknet und dann wieder gewogen. Danach werden die Kugeln 16 h in einem Ofen bei 103 °C getrocknet. Das Abkühlen erfolgt in einem Exsikkator und das Trockengewicht wird bestimmt.
Folgende Medien werden für die Herstellung der Alginatkugeln benötigt:
1. Alginatlösung
Dieses Medium darf kein Calcium enthalten.
• MS-Medium ohne Calcium
• Saccharose 0,75 M (256,73 g/l)
• pH: 5,7
• Alginic Acid 30 g/l (Viskosität von 2 %, Sigma A-2158)
Das Alginat wird vor dem Erhitzen und unter sehr langsamen Rühren dazugegeben.
Erst wenn alles gelöst ist, erfolgt das Erhitzen. Wenn man zuerst erhitzt, bildet sich ein unlösbarer Klumpen, der auch im Autoklaven nicht mehr schmilzt.
Es werden 125 ml oder 250 ml in einen Erlenmeyerkolbens (zur Hälfte gefüllt) autoklaviert.
2. MS-Saccharose Medium (0,75 M)
0,75 M Saccharose Medium wird als Inkubationsmedium für die Kugeln hergestellt. Die Inkubation erfolgt über Nacht.
3. MS-CaCl2 Medium (100 mM)
Calciumchlorid-Medium für die Herstellung der Kugeln
Herstellung des MS-Saccharose Medium (0,75 M) und MS-CaCl2 Medium (100 mM):
Medium Konz/l 500 ml 500 ml
MS-Saccharose Medium MS-CaCl2
0,75 mM Saccharose 100 mM CaCL2
MS-Macro 50 ml MS-Micro 5 ml MS-Vitamine 5 ml MS-Eisen 10 ml Saccharose 30 g
Es wird auf 500 ml aufgefüllt (2 x konz.) 500 ml doppelt konzentriertes
MS-Medium in 2*250 ml aufteilen 250 ml 250 ml Saccharose MW 342,3
extra Saccharose 141,15 g/500 ml ---
CaCl2 --- 7,3 g/500 ml
Endvolumen 500 ml 500 ml
Einstellen des pH-Wertes auf 5,7 mit 1 N HCL oder HCL
Das 0,75 mM Saccharose Medium wird in 125 ml Erlenmeyerkolben (75 ml pro Erlenmeyerkolben, weite Öffnung) gegeben.
Die Calciumchloridlösung wird in 250 ml Erlenmeyerkolben oder größer (100 ml / 250 ml Erlenmeyerkolben) gegeben. Beide Lösungen werden autoklaviert und müssen vor Gebrauch abgekühlt sein.
Anhang 8
Vitrifikationtechnik mit PVS2
Übersetzt aus der Anleitung vom National Clonal Germplasm Repository-Corvallis (Reed 2001 a)
Vorbereitungen
1. Sprosskulturen werden 1 Woche bei einem Temperaturwechsel von 22 °C und –1 °C (8 h Licht/ 16 h Dunkelheit ) abgehärtet. Die Abhärtung erfolgt 2-3 Wochen nach dem letzten Transfer.
2. Petrischalen mit dem Vorbehandlungsmedium (5 % DMSO, höherer Agargehalt) 3. Flüssiges Medium mit 0,4 M Saccharose, pH 5,8
4. Sterile Bechergläser oder Petrischalen für die Gefrierschutzlösung und das flüssige Medium 5. Flüssiges Medium mit 1,2 M Saccharose, pH 5,8
6. Sterile Filterpapierstreifen in Petrischalen, um die Meristeme oberflächlich zu trocknen 7. Vermehrungsmedium in Petrischalen
8. Auf Eis gelagerte oder eingefrorene Halter für die Kryoröhrchen Isolation der Meristeme
1. Die Meristeme werden präpariert (nicht quetschen) und weitere 2 Tage auf Medium mit 5 % DMSO (v/v) und höherem Agargehalt unter den Abhärtungsbedingungen (siehe oben) aufbewahrt.
2. Nach 2 Tagen erfolgt eine Vorinkubation der Meristeme auf Eis oder im Kühlschrank in einer der folgenden Lösungen:
A) Vorinkubation für 2 Stunden in einer sterilfiltrierten, 1%igen Lösung (0,4 M Saccharose) aus Bovin Serum Albumin (BSA, Sigma A9418) oder 10 % Prolin. Erst danach wird die PVS2 Lösung in die Kryoröhrchen gegeben.
B) Vorinkubation für 20 Minuten in 2 M Glycerol und 0,4 M Saccharose/ MS-Medium.
Ablauf der Vorinkubation und des Einfrierens Die Arbeiten werden unter der Sterilbank durchgeführt.
1. Kryoröhrchen mit 1 ml 1 % BSA-Lösung füllen. Der Röhrchenhalter soll in einem Eisblock eingefroren sein, bzw in Eis stehen.
2. Die Meristeme werden vom Vorbehandlungsmedium in die Kryoröhrchen überführt (10-25 Stück/ Röhrchen). Einwirkdauer 2 Stunden.
3. Nach 2 Stunden wird die BSA-Lösung mit einer sterilen Einwegpipette oder Einwegspritze möglichst vollständig abgesaugt. (Achtung: Nicht die Meristeme aufsaugen!).
4. 1 ml PVS2-Lösung wird zu den Meristemen in das Kryoröhrchen gegeben. Die Meristeme sollen in dieser Lösung absinken.
5. Die Einwirkdauer der PVS2-Lösung bei 0 °C (Röhrchenhalter im Eisblock) soll genau 20, 25 oder 30 Minuten betragen. Die Röhrchen bleiben in dieser Zeit in der Sterilbank in Eis. Kleiner Dewar oder Transportgefäß wird mit flüssigem Stickstoff gefüllt.
6. Nach 20 Minuten werden die Kryoröhrchen schnell in einen Aluminium-Röhrchenhalter eingespannt und sofort in flüssigen Stickstoff getaucht. Einwirkzeit 1 Stunde. Zu diesem Zeitpunkt wird eine Kontrolle mit 1,2 M Saccharosemedium gespült und auf Regenerationsmedium gesetzt.
Auftauen
Das Arbeiten erfolgt unter der Sterilbank
1. Aus dem Stickstoff werden die Röhrchen sehr schnell mit Röhrchenhalter für 1 min in 45 °C warmes Wasser, danach für 1-2 min in raumwarmes (25 °C) Wasser gegeben, um ein
Überwärmen zu verhindern. Nach dem Wasserbad wird das Haftwasser abgeschüttelt und das Röhrchen mit Alkohol abgesprüht, um Kontaminationen zu vermeiden.
2. Die Lösung wird dann schnell mit einer Pipette oder Einwegspritze abgesaugt und 2 mal durch neues 1,2 M Saccharosemedium ersetzt. Das Absaugen und Auffüllen muss sehr schnell erfolgen.
3. Die Meristeme werden mit der Pipette auf steriles Filterpapier gelegt und anschließend sehr vorsichtig auf Regenerationsmedium überführt. Die Meristeme dürfen nicht trocken werden.
Folgende Lösungen werden benötigt:
1) Kryo-Vorbehandlungsmedium (5 % DMSO-Platten)
Stammlsg: Konz. Menge
MS-Macro 20-fach 50 ml
MS-Micro 200-fach 5 ml
MS-Vitamine 200-fach 5 ml
MS-Eisen 100-fach 10 ml
Saccharose 30 g
DMSO 50 ml
mit Reinstwasser auf 1 l auffüllen, der pH-Wert wird mit 1 N NaOH oder HCL auf 5,7 eingestellt.
Agar: 8 g/l Difco Bacto Es kann auch eine Mischung aus Agar und Gelrite benutzt werden.
Agar: 3,5 g/l Gelrite: 1,75 g/l 2) Flüssiges MS-Saccharosemedium:
• 0,5 l Saccharosemedium 0,4 M --->Vitrifikationslösung
• 0,5 l Saccharosemedium1,2 M ---> Waschen der Meristeme nach dem Auftauen Stammlsg. Konz. Menge 0,4 M 1,2 M
Saccharosemedium Saccharosemedium
MS-Macro 20-fach 50 ml
MS-Micro 200-fach 5 ml
MS-Eisen 100-fach 10 ml Es wird auf 500 ml aufgefüllt (2 x konz.)
Die Lösung wird in 2 mal 250 ml geteilt: 250 ml 250 ml
0,4 M Saccharose 136,92 g/l 68,46 g ---
1,2 M Saccharose 410,76 g/l --- 205,38 g
Endvolumen 500 ml 500 ml
mit Reinstwasser auffüllen
Der pH-Wert wird mit 1 N NaOH oder HCL auf 5,8 eingestellt.
Das Medium wird in 125 ml Erlenmeyerkolben abgefüllt, verschlossen und autoklaviert.
Nach dem Autoklavieren im Kühlschrank aufbewahren.
3) Gefrierschutzlösung (PVS2) 50 ml (immer frisch ansetzen, Handschuhe tragen) Vorlage von 20 ml 0,4 M Saccharosemedium in einem 50 ml Messkolben
für 50 ml 25 ml
Glycerol 30 %(w/v) 11,9 ml 5,9 ml
Ethylen Glykol 15 % (w/v) 6,8 ml 3,4 ml
DMSO 15 % (w/v) 6,8 ml 3,4 ml
Mit flüssigem 0,4 M Saccharosemedium (136,92 g/l) auf 50 ml auffüllen.
Die Gefrierschutzlösung wird sterilfiltriert und im Kühlschrank aufbewahrt.
Anhang 9
Liste der bis Ende des Projektes Januar 2005 kyokonservierten adulten Kulturen und der jeweiligen Regenerationsrate der Kontrolle.
Nr. Klon Datum Kryokonservierung Kontrolle
[n] [n] Kallus / kein Wachstum Regeneration braun
1 77-2 21.07.2004 70 7 29% 71% 0%
2 77-5 21.07.2004 68 9 22% 78% 0%
3 77-24 01.09.2004 60 14 64% 0% 36%
4 77-2 15.09.2004 80 15 33% 53% 13%
5 77-23 15.09.2004 80 12 8% 50% 42%
6 77-27 13.10.2004 60 12 8% 67% 25%
7 519-21 13.10.2004 90 8 25% 38% 38%
8 519-21 13.10.2004 80 7 0% 57% 43%
9 77-3 14.10.2004 80 8 25% 63% 13%
10 77-8 14.10.2004 90 10 0% 100% 0%
11 77-5 14.10.2004 60 10 30% 30% 40%
12 T70 20.10.2004 70 10 0% 80% 20%
13 77-2 03.11.2004 80 11 36% 27% 36%
14 519-10 03.11.2004 70 9 56% 44% 0%
15 519-2 03.11.2004 60 10 60% 40% 0%
16 519-16 03.11.2004 80 8 0% 50% 50%
17 519-21 24.11.2004 80 13 85% 15% 0%
18 77-19 24.11.2004 80 10 0% 80% 20%
19 519-4 01.12.2004 70 5 0% 100% 0%
20 77-27 15.12.2004 70 8 0% 38% 63%
21 77-2 22.12.2004 70 6 0% 33% 67%
22 77-23 22.12.2004 60 10 0% 40% 60%
23 519-18 07.01.2005 70 9 0% 89% 11%
24 77-12 12.01.2005 70 10 20% 20% 60%
25 77-23 19.01.2005 60 10 0% 50% 50%
26 77-24 19.01.2005 60 6 0% 50% 50%
27 519-5 20.01.2005 70 6 17% 33% 50%
28 77-24 20.01.2005 60 8 25% 25% 50%
Bonitur nach 8 Wochen
Anhang 10
Liste der aus 62 ausgewählten Elitebäume etablierten Klone. Die Versuche wurden sowohl an der Niedersächsischen Versuchsanstalt in Escherode als auch in den beiden kommerziellen Partnerlabors (Institut für Pflanzenkultur (IFP), Solkau, Deutschland und Vitroform, Dänemark) mit Pfropflingen derselben Mutterbäume durchgeführt. Die Anzahl der in vitro Pflanzen pro Kultur entspricht dem Stand Frühjahr 2004.
Klon Familie etabliert von NFV IFP Vitroform total
Dan 519-1 Montabaur 5 NFV, vitroform 13 200 213
Dan 519-2 Lichtenfels 1 NFV, vitroform 17 50 67
Dan 519-4 Lüchow 5 NFV 28 2 30
Dan 519-5 Lensahn 2 NFV 15 15
Dan 519-6 Lauterberg 7 NFV 16 5 21
Dan 519-16 Farchau 1 NFV 9 10 19
Dan 519-9 Rosenau 5 NFV 14 14
Dan 519-10 Lüchow 4 NFV 23 23
Dan 519-12 Montabaur 5 NFV 4 4
Dan 519-20 Busschewald 5 NFV 20 10 30
Dan 519-21 Dierdorf 5 NFV 282 95 10 387
Dan 519-27 Schöningen 3 NFV 27 5 32
Dan 519-28 Lüchow 2 NFV 2 2 4
Bov 77-2 Lüchow 326-2 NFV, vitroform 293 103 14 410
Bov 77-3 Lüchow 326-2 NFV, IFP 279 400 53 732
Bov 77-5 Öhringen 1 NFV, vitroform 151 57 15 223
Bov 77-6 Öhringen 1 IFP 151 184 335
Bov 77-8 Lichtenfels 3 NFV, vitroform 6 300 306
Bov 77-9 LWK Cloppenburg 1 NFV 4 4
Bov 77-12 Sinntal 1 NFV, vitroform 90 20 110
Bov 77-15 Busschewald 2 NFV 4 4
Bov 77-19 Mellrichstadt 3 NFV 175 10 20 205
Bov 77-23 Kelheim 4 NFV 246 53 15 314
Bov 77-24 Wieselburg 4-1 NFV 145 48 193
Bov 77-27 Schöningen 3 NFV, vitroform 25 300 325
Anzahl der Sprosse
Danksagung
Ich möchte allen Menschen danken, die mich bei der Fertigstellung der Dissertation und auf dem Weg dorthin mit Ratschlägen, Aufmunterungen oder einfach nur durch ihre Anwesenheit unterstüzt haben. Besonderer Bedanken möchte ich mich hier bei meiner Freundin Ute, die mir zu jeder Zeit immer mit Hilfe zur Seite stand und mich stets ermuntert hat die Arbeit nicht aus den Augen zu verlieren und bei meiner Mutter Rosemarie.
Ein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Grotha, der die Betreuung meiner Arbeit übernommen hat und mir mit Diskussionen und Anregungen jederzeit zur Seite stand.
Weiterhin danke ich Herrn Prof. Dr. Kutschera für die Übernahme des Koreferats.
Ein großer Dank gilt allen MitarbeiterInnen der Niedersächsischen Forstlichen Versuchsanstalt in Escherode, durch deren Unterstützung diese Arbeit erst möglich wurde.
Besonders herrvorheben möchte ich die technischen Assistenten Herrn Serge Havel, Frau Ulrike Seifert und Frau Silvia Köhler, die mich bei allen Labor- und Freilandarbeiten unterstützt haben und den Fachgebietsleiter Herrn Dr. Meier-Dinkel für die Betreuung der Projektarbeit über den gesamten Zeitraum.
Besonders erwähnen und danken möchte ich an dieser Stelle noch meinem sehr guten Freund Jörg Stederoth. Sein großes Fachwissen in allen naturwissenschaftlichen Bereichen, sein großes technisches Verständnis und seine Geduld hat mich seit meinem Studium begleitet. Diskussionen und Gespräche mit Ihm haben in der gesamten Zeit zur Klärung vielfältiger fachlicher Fragen und Anwendungen sowie zur Entwicklung neuer Ideen geführt. Zum Schluss möchte ich mich noch bei seiner Frau Christiane bedanken, die mir eine große Hilfe bei der Korrektur und Endformatierung dieser Arbeit war.
Lebenslauf
Persönliche Angaben
Name: Katja Schönweiß
Geburtsdatum: 26.02.1970
Geburtsort: München
Schulische und berufliche Ausbildung
08.1980 - 05.1989 Albert-Schweitzer Gymnasium, Kassel Allgemeine Hochschulreife 1989
11.1990 - 10.1992 Ausbildung zur Krankengymnastin, Hessisch-Lichtenau 11.1992 - 10.1993 Krankengymnastisches Anerkennungsjahr, Bayreuth
Universitätsstudium
10.1995 - 01.2001 Diplomstudiengang Biologe an der Universität Kassel 16.01.2001 Studienabschluss Diplom Biologin an der Universität Kassel seit 05.2002 Doktorandin am Institut für Biologie, Abteilung
Pflanzenphysiologie an der Universität Kassel
Berufstätigkeit
01.1994 - 05.1995 Anstellung in einer Krankengymnastikpraxis, Ihringen
05.1995 - 09.1995 Anstellung als Krankengymnastin an der Orthopädischen Klinik, Hessisch-Lichtenau
02.1996 - 09.2005 Tätigkeit in einer Krankengymnastikpraxis, Kassel 04.2001 - 03.2005 Promotionsstelle an der Niedersächsischen Forstlichen
Versuchsanstalt, Abteilung Waldgenressourcen in Escherode im Rahmen eines 4-jährigen EU-Projektes
04.2005 - 09.2005 arbeitssuchend und Fertigstellung der Dissertation seit 10.2005 Anstellung als Medical Advisor bei der Firma
BSN-Jobst GmbH in Emmerich