3.3 Methoden zur Kryokonservierung von Fraxinus excelsior
3.3.4 Alginat- / Dehydrationsmethode
Fraxinus excelsior wurden am Ende der Kulturperiode für sieben Tage im Klimaschrank abgehärtet, danach präpariert und auf Standardmedium bis zur Weiterbehandlung am selben Tag gelagert. Die präparierten Sprossspitzen wurden in calciumfreies Flüssigmedium [calciumfreies WPM mit 3 % (w/v) Alginat (siehe Kap. 3.1.3) und 0,75 M Saccharose] überführt und mit dem Medium vorsichtig vermischt. Mit einer sterilen 3 ml Einweg-Plastikpipette (siehe Kap. 3.1.2) wurde jeweils eine Sprossspitze mit Medium aufgenommen und dann ohne Luftblasen in calciumhaltiges Flüssigmedium (WPM mit insgesamt 0,1 M CaCl2 und 0,75 M Saccharose) getropft. Beim Auftreffen des Tropfens koagulieren die beiden Lösungen zu einer Kugel. Die entstandenen Kugeln blieben in der Calciumlösung auf einem Schwenk-Schüttler (80 rpm) für weitere 20 Minuten zum Aushärten. Das Gewicht der Kugeln sollte ca. 50 mg betragen. Die Kugeln wurden über ein Sieb abgegossen und in flüssiges WPM mit 0,75 M Saccharose überführt und dort für 16 Stunden bei 22 °C auf dem Schwenk-Schüttler inkubiert. Nach diesem Schritt der osmotischen Dehydration erfolgte ein Trocknen der Kugeln auf sterilem Filterpapier über Silicagel für fünf Stunden bis zu einem Wassergehalt von 20 bis 25 %. Hierzu wurde zuerst das Oberflächenwasser der Kugeln auf sterilem Filterpapier entfernt. Anschließend wurden jeweils zehn Kugeln mit 50 g sterilem Silicagel, überdeckt mit sterilem Filterpapier, in Petrischalen platziert. Die Petrischalen wurden mit Parafilm verschlossen und bei 22 °C in der Werkbank aufbewahrt. Nach dem Trocknen wurden die zehn Kugeln in 2 ml Kryoröhrchen (siehe Kap. 3.1.2) gegeben, verschlossen und direkt in flüssigen Stickstoff getaucht. Die Proben wurden für mindestens eine Stunde in flüssigem Stickstoff gehalten und dann bei Raumtemperatur über den Zeitraum von zwei Stunden erwärmt.
Anschließend erfolgte eine Rehydration der Kugeln in flüssigem WPM mit 1,2 M Saccharose (Regenerationslösung) für 20 Minuten und die Überführung auf Regenerationsmedium [Standardmedium mit 0,1 % weniger Agar (0,7 % w/v)].
3.3.4.1 Bestimmung des Wassergehaltes der Kugeln
Der Wassergehalt der Kugeln wurde nach folgender Formel aus der Differenz von Frischgewicht (Fg) und Trockengewicht (Tg) bestimmt: Fg - Tg × 100 / Fg
Zur Bestimmung des Trockengewichtes wurden die Kugeln für 16 Stunden bei 103 °C in einem Trockenschrank getrocknet und dann für eine Stunde in einem Exsikkator abgekühlt.
3.3.4.2 Bestimmung der Regeneration nach den einzelnen Behandlungsschritten Um die Regenerationsrate nach den einzelnen Behandlungsschritten zu bestimmen, wurden nach jedem Schritt Kugeln für 20 Minuten in Regenerationslösung inkubiert und dann auf Regenerationsmedium gesetzt. Die Auswertung erfolgte nach acht Wochen.
3.3.5 Vitrifikationsmethode mit PVS2
Als Grundlage für die Versuche zur Entwicklung eines Kryokonservierungsprotokolls mit Hilfe der Vitrifikationsmethode mit PVS2 diente ebenfalls ein von REED (2001 a) entwickeltes Protokoll für Wildbirne und Johannisbeere (siehe Anhang 8). In den folgenden Versuchen (siehe Kap. 3.3.5.2 bis 3.3.5.7) wurde die Methode von REED
abgewandelt und Schritt für Schritt optimiert. Die Versuche erfolgten zuerst an juvenilem Material und wurden dann für adultes Material optimiert.
3.3.5.1 Erwärmung und Regeneration der Proben
Die Probenröhrchen wurden aus dem flüssigen Stickstoff genommen und sofort für eine Minute in 43 °C und dann zehn Sekunden in 22 °C warmes Wasser gehalten. Anschließend wurde die PVS2-Lösung sehr schnell mit einer Pipette abgenommen und mit der Regenerationslösung (flüssiges WPM mit 1,2 M Saccharose) aufgefüllt. Die Sprossspitzen wurden viermal mit dieser Lösung gespült, dann auf steriles Filterpapier gelegt und von dort auf Regenerationsmedium überführt. Proben, die nach einem der Vorbehandlungsschritte auf ihre Regeneration getestet werden sollten, wurden ebenfalls viermal mit der Regenerationslösung gespült.
Die abschließende Bonitur erfolgte nach acht Wochen. Als Regenerationsmedium wurde WPM mit 2 mg/l BAP, 0,15 mg/l IBA und 0,7 % (w/v) Agar in Petrischalen benutzt. Ein Transfer der Sprossspitzen auf frische Stellen des Mediums erfolgte am ersten, siebten und 14. Tag. Nach zwei Wochen wurden die Sprossspitzen auf Standardmedium überführt.
Sobald sich neue Triebe und Blätter bildeten, spätestens jedoch nach vier Wochen, erfolgte der Transfer der Sprosse auf Standardmedium in Weckgläsern. Bis zur achten Woche wurden die Sprosse alle zwei Wochen auf frisches Medium gesetzt.
3.3.5.2 Einfluss zweier Vorbehandlungslösungen (BSA und Glycerol) auf die Regeneration juveniler Kulturen nach Kryokonservierung
Juvenile in vitro Kulturen (Klon 129-6.2 und 16.1.1) wurden für 28 Tage unter Kultur- und für sieben Tage unter Abhärtungsbedingungen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf DMSO-Medium [WPM mit 5 % (v/v) DMSO, 3 % (w/v) Saccharose und 0,8 % (w/v) Agar]. Für die Vorbehandlung von jeweils zehn Sprossspitzen fanden drei Varianten Anwendung: Zwei Stunden auf Eis in 1 ml einer 1 % (w/v) BSA-Lösung, 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml einer 2 M Glycerollösung mit 0,4 M Saccharose oder gar keine Vorbehandlung. Bei beiden aktiven Vorbehandlungen diente flüssiges WPM in 2 ml Kryoröhrchen als Lösungsmittel. Danach wurde die Lösung mit einer 1 ml Eppendorfpipette abgenommen und durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt [30 % (w/v) Glycerol, 15 % (w/v) Ethylenglykol, 15 % (w/v) DMSO und 0,4 M Saccharose, aufgefüllt mit flüssigem WPM]. Die Inkubation erfolgte für 20 Minuten auf Eis, gefolgt von einer sofortigen Überführung in flüssigen Stickstoff. Die Regenerationsrate wurde sowohl nach der PVS2-Inkubation als auch nach der Überführung in flüssigen Stickstoff ermittelt.
3.3.5.3 Optimierung der Kulturperiode für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen
Die juvenile in vitro Kultur, Klon 129-6.2, wurde für 16, 21, 28 und 35 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von sieben Tagen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf DMSO-Medium. Die Vorbehandlung von jeweils zehn Sprossspitzen fand für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2) statt. Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt, und es erfolgte eine Inkubation für 20 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff.
3.3.5.4 Optimierung des Abhärtungszeitraumes und des Vorkulturmediums für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen
Die juvenile in vitro Kultur, Klon 129-6.2, wurde für 28 Tage ohne Abhärtung oder inklusive einer Abhärtungsperiode von sieben oder 14 Tagen kultiviert. Die präparierten Sprossspitzen wurden entweder direkt in die Vorbehandlungslösung überführt oder alternativ für zwei Tage bei 4 °C auf Standardmedium, DMSO-Medium oder auf in
flüssigem DMSO-Medium getränkten Filterpapier inkubiert. In allen Fällen erfolgte eine Vorbehandlung der Sprossspitzen für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2). Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt und es erfolgte eine Inkubation für 20 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff.
3.3.5.5 Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff von fünf juvenilen Kulturen
Fünf juvenile in vitro Kulturen wurden für 28 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von zehn Tagen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf Standardmedium mit anschließender Inkubation der Sprossspitzen für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2). Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt und es erfolgte eine Inkubation für 20 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff.
Die Proben wurden nach einem Lagerungszeitraum von einem Tag, drei Monaten und sechs Monaten erwärmt, wobei 60 bis 100 Sprossspitzen zur Langzeitlagerung erhalten wurden.
3.3.5.6 Vergleich der Regenerationsfähigkeit von juvenilen und adulten Kulturen nach dem für juvenile Kulturen optimierten Kryokonservierungsprotokoll Zwei juvenile (Klon 129-6.2 und 16.1.1) und zwei adulte in vitro Kulturen (Klon 77-23 und 77-3) wurden für 28 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von zehn Tagen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf Standardmedium mit anschließender Inkubation der Sprossspitzen für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.2.5.2). Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt und es erfolgte eine Inkubation für 20 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff.
3.3.5.7 Optimierung der Kulturperiode, der Vorkultur und der PVS2-Inkubation für die Kryokonservierung von adulten Kulturen
Die Subkulturdauer wurde bei den getesteten adulten Kulturen (Klon 77-2, 77-5, 77-19 und
Glycerolmedium [WPM mit 0,8 M Glycerol, 0,4 M Saccharose und 0,8 % (w/v) Agar]
transferiert. Die weitere Vorbehandlung erfolgte für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2). Im nächsten Schritt wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt, dann die Sprossspitzen für 20 oder 25 Minuten in dieser Lösung auf Eis inkubiert und anschließend in flüssigen Stickstoff überführt.
Um den Einfluss der Vorkultur zu testen, wurden Sprossspitzen des Klons 77-3 sowohl auf dem beschriebenen Glycerol- als auch auf dem bisherigen Standardmedium inkubiert. In diesem Versuch erfolgte eine Inkubation in der PVS2-Lösung für 25 Minuten.
3.3.5.8 Langzeitlagerung von neun adulten Kulturen in flüssigem Stickstoff
Neun adulte in vitro Kulturen wurden für 33 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von zehn Tagen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf 0,8 M Glycerolmedium mit anschließender Inkubation der Sprossspitzen für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2). Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt und es erfolgte eine Inkubation für 25 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff. Die Proben wurden nach einem Lagerungszeitraum von einem Tag auf ihre Regenerationsfähigkeit getestet. 60 bis 100 Sprossspitzen pro Klon wurden langfristig eingelagert und in einer angelegten Datenbank erfasst.
3.3.5.9 Optimiertes Kryokonservierungsprotokoll für juvenile und adulte in vitro Kulturen von Fraxinus excelsior
Kulturalter: Bei juvenilen Kulturen ca. 28 Tage, bei adulten 33 bis 35 Tage, stets in Abhängigkeit von der Wüchsigkeit des Klons.
Abhärtung: Die letzten sieben Tage des Kulturzyklus wurden die Kulturen unter Abhärtungsbedingungen auf Standardmedium kultiviert.
Präparation: Die Sprossspitzen wurden auf eine Größe von ca. 1 mm präpariert.
Vorbehandlungsmedium: Präparierte Sprossspitzen wurden für zwei Tage bei 4 °C auf ein 0,8 M Glycerolmedium [WPM mit 0,8 M Glycerol. 0,4 M Saccharose und 0,8 % (w/v) Agar] transferiert.
Vorbehandlung: 1 ml der Vorbehandlungslösung [WPM mit 2 M Glycerol und 0,4 M Saccharose] wurde in 2 ml Kryoröhrchen gefüllt, danach wurden maximal zehn
Sprossspitzen dazu gegeben. Die Röhrchen mit den Sprossspitzen wurden geschüttelt, so dass alle Sprossspitzen auf den Boden des Röhrchens absanken. Die Inkubation der Sprossspitzen erfolgte für 20 Minuten bei 22 °C.
PVS2-Behandlung: Abnahme der Glycerollösung mit einer 1 ml Eppendorf-Pipette und Auffüllen der Röhrchen mit 1,5 ml der PVS2-Lösung. Die Röhrchen wurden für 25 Minuten auf Eis gehalten.
Einlagerung: Nach der Inkubation in der PVS2-Lösung wurden die Kryoröhrchen schnell in einen Aluminium-Röhrchenhalter eingespannt und sofort in flüssigen Stickstoff getaucht.
Erwärmung und Regeneration: Die Erwärmung erfolgte für eine Minute in 43 °C und zehn Sekunden in 22 °C warmem Wasser. Anschließend wurde die PVS2-Lösung sehr schnell abgenommen und mit der Regenerationslösung (flüssiges WPM mit 1,2 M Saccharose) aufgefüllt. Nach viermaligem Spülen der Sprossspitzen erfolgte eine Überführung auf steriles Filterpapier und der Transfer auf Regenerationsmedium.