Zellmigration

TGF-1. Einleitung

24 β1 (und auch TGF-β2, TGF-β3) die Proliferation und die Migration in vitro. Allerdings stimulieren alle drei Isoformen die Kontraktion und führen somit zu einer narbenfreien Regeneration der funktionellen Schicht nach ihrer proteolytischen Degenerierung in der Menstruationsphase (194).

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25 Ende durch den Einbau neuer Monomere verlängern, führt Arp2/3 durch Induktion einer Polymerisierung seitlich des bestehenden Filaments zu dessen Verzweigung. Fortführende Verzweigung der Polymerisierung führt schließlich zu einer netzartigen Aktinstruktur.

Reguliert wird die Polymerisierung durch zahlreiche Aktin-bindende Proteine, wie Profilin, welches die Polymerisierung unter anderem durch Freisetzung von Aktin-gebundenem Adenosindiphosphat (ADP) stimuliert, und Cofilin, das die Depolymerisierung fördert. Durch Anlagerung von capping Proteinen am „barbed“ Ende wird die Polymerisierung unterbunden.

Depolymerisierung am „pointed“ Ende des Aktin-Polymers setzt einzelne G-Aktin-Monomere frei, so dass diese nach Bindung zellulären ATPs wieder als Bausteine zur Verfügung stehen.

Polymerisiertes F-Aktin kann lateral durch Aktin-verlinkende Proteine, wie Myosin-2, zu Aktinbündeln assoziieren. Liegen die Aktinbündel, bezogen auf ihre Polarität, antiparallel vor, bilden sich übergeordnete dicke Aktinfilmante (Stressfasern) aus. Aktinbündel weisen durch das angelagerte Myosin-2 die Fähigkeit zur Kontraktion auf (88, 196).

Anhand der verschiedenen Morphologien des Aktin-Zytoskeletts lassen sich Zellen in migratorische oder statische Phänotypen einteilen. Während bei einem statischen Phänotyp viele Stressfasern entlang der longitudinalen Hauptachse der Zelle angeordnet sind, zeichnet sich ein migratorischer Phänotyp durch einen Verlust an Stressfasern und Ansammlung von F-Aktin in der Zellperipherie aus (198).

Eine migrierende Zelle bildet, in Folge der durch Polymerisierung gebildeten physikalischen Kraft auf die Zellmembran, in Richtung der Bewegung charakteristische Strukturen aus.

Filopodien sind lange, dünne Membranausstülpungen, welche aus unverzweigten, parallel angeordneten F-Aktinbündeln bestehen. Sie sind nicht zwingend notwendig für die Migration und dienen wohl zum Ertasten der Umgebung. Die Aktin-Polymerisierung innerhalb der Filopodien wird durch Aktivierung von weiteren Proteinen, wie Profilin und VASP, gesteuert.

VASP verhindert eine verzweigende Polymerisierung und zusätzlich, durch Blockierung einer Bindung von capping Proteinen an das „barbed“ F-Aktin-Ende, einen Abbruch der Polymerisierung. Lamellipodien sind dagegen bürstenartige, breite Membranausstülpungen, in denen dünne, kurze Aktin-Polymere vernetzt vorliegen. Innerhalb dieser Struktur erfolgt eine schnelle Polymerisierung und Depolymerisierung unter Beteiligung zahlreicher Proteine, ein Prozess, welcher die Zelle in die Bewegungsrichtung drängt (88, 196).

Die Enden der Aktinfilamente können mit der Plasmamembran und mit Integrin/Protein-Cluster verbunden sein. Die Verbindung mit der Plasmamembran wird durch die Aktivität von Proteinen, wie Ezrin, Radixin und Moesin, reguliert und ist während der Migration oft nur von kurzer Dauer. Die Integrin-vermittelte Adhäsion einer Zelle an einer anliegenden Zelle oder an extrazelluläre Matrixkomponenten beeinflusst die Migration wesentlich. Dabei bindet

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26 Integrin mit seiner extrazellulären Domäne an seinen Liganden, während die zytoplasmatische Domäne mit einer Vielzahl zellulärer Struktur- und Signalproteine sowie dem Aktin-Zytoskelett, interagieren kann. Intrazelluläre Proteine, wie Talin und Vinculin, wirken auf den zytoplasmatischen Teil der Integrine und induzieren so eine Konformationsänderung der extrazellulären Domäne. Dadurch können weitere Liganden und Rezeptoren an die extrazelluläre Seite der Integrine binden. Auf diese Weise besteht bei Integrinen eine „outside-in“ sowie eine „inside-out“ Kommunikation (88, 199).

Während der Migration entstehen Integrin-Adhäsionen an der Zellfront, innerhalb der Lamellipodien, als fokale Komplexe. Die fokalen Komplexe werden, während sich die Zelle über sie hinwegbewegt, wieder aufgelöst (195, 200). Statische oder langsam migrierende Zellen lösen die fokalen Komplexe nicht auf, sondern bilden diese weiter zu fokalen Adhäsionen aus. Die fokalen Adhäsionen sind dynamische Makromoleküle, welche extrazelluläre Signale an die FAK weiterleiten können (201).

1.5.2. Molekulare Regulation der Migration

Zellmigration kann durch ein extrazelluläres Signal initiiert werden. Ein solches Signal entsteht durch Bindung eines Faktors (z.B. Hormon, Zytokin, Wachstumsfaktor, EZM-Komponente oder eine benachbarte Zelle) an einen transmembrangebundenen Rezeptor.

Aufgrund der Vielzahl der möglichen extrazellulären Faktoren und ihrer Rezeptoren ist die Regulation der Migration komplex.

Die Aktivierung eines migrationsrelevanten Rezeptors führt unter Generierung von sekundären Botenstoffen zu einer Aktivierung nachgestellter Signalkaskaden, welche wiederum Ras homolog (Rho)-GTPasen durch Rekrutierung von guanine-nucleotide-exchange factors (GEF) aktivieren können (88, 195). Mitglieder der Proteinfamilie der kleinen Rho-GTPasen, wie Ras homolog gene family member A (RhoA), Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) und cell division control protein 42 homolog (Cdc42), sind wichtige Regulationsmoleküle für die Zellmigration. Sie sind beteiligt an Kontraktion, Adhäsion und Ausbildung der Lauffront. Rho-Proteine sind aktiv, wenn sie Guanosintriphosphat (GTP) gebunden haben. Die Bindung wird durch die Aktivität von GEF induziert. In seiner aktiven Form kann ein Rho-Protein mit einer Vielzahl von Zielproteinen interagieren und ist vor allem an der Regulation der Aktin-Polymerisierung beteiligt. Eine Hydrolyse des GTP zu Guanosindiphosphat (GDP) wird durch GTPase aktivierende Proteine (GAP) eingeleitet und bringt das Rho-Protein in seine inaktive, GDP-gebundene Form. Von der Vielzahl der GEFs und GAPs kann jedes mindestens eine Rho-GTPase, meist jedoch mehrere verschiedene Rho-GTPasen aktivieren bzw. inaktivieren (88, 195, 202).

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27 Die Formierung der Lamellipodien der migrierenden Zellen wird durch die Aktivität des Proteins Rac1 gesteuert, wohingegen Cdc42 für die Zellpolarisation und Polymerisierung in den Filopodien relevant ist.

Rac1 wird durch PI3K aktiviert, welches wiederum durch die Aktivität von Tyrosinkinasen, GPCR oder Integrin-Interaktion aktiviert wird. Durch Rac1-Interaktion mit dem Strukturprotein insulin receptor tyrosine kinase substrate p53 (IRSp53), welches über seine Src-homology 3 (SH3) Domäne mit Proteinen der Wiskott-Aldrich syndrome family protein (WAVE/Scar)-Familie interagiert, wird der Arp2/3-Komplex und somit eine vernetzende Polymerisierung induziert. Das Protein IRSp53 ist gleichzeitig ein cross-linker mit weiteren Proteinen, wie Cdc42 und RhoA. Zusätzlich beeinflusst Rac1 die Depolymerisierung durch Aktivierung von p21 aktivierter Kinase (PAK). PAK aktiviert die LIM-Kinase (LIMK), welche wiederum Cofilin phosphoryliert und somit deaktiviert (195).

Die Ausbildung der schwach adhärenten, fokalen Komplexe innerhalb der Lamellipodien ist durch Rac1 und Cdc42 gesteuert. Die Bildung der stark adhärenten fokalen Adhäsionen wird durch RhoA und Myosin-Kontraktion reguliert. Allerdings sind Rac1 und die Kinasen PAK, Src und FAK auch an der Auflösung, dem „turn over“, der Adhäsionen und Loslösung der Zelle vom Substrat beteiligt (196). Weitere Signaltransduktionen, wie ERK1/2, können ebenfalls an der Regulation der Adhäsion und Auflösung beteiligt sein (203). Da auch Raf1 und MAPK/ERK-Kinase 1 (MEK1) durch PAK aktiviert werden, wird auf diese Weise der ERK1/2-Signalweg zusätzlich verstärkt. Rac1 und Cdc42 sind auch Aktivatoren von JNK und p38 (202).

Die Kontraktion einer Zelle, d.h. das Ineinandergleiten der lateralen Aktinfilamente, wird durch eine Konformationsänderung des Aktin-gebundenen Myosin-2 erzielt. Reguliert wird diese ATP-abhängige Konformationsänderung durch Phosphorylierung von MLC2. Während RhoA am hinteren Ende der Zelle und in der Peripherie die Phosphorylierung von MLC2 stimuliert, reguliert Rac1 über PAK die Aktin-Myosin-Kontraktion der Zellfront (88, 195). Zwar kann Rac1 über PAK Phospho (p)-MLC2 erhöhen, aber es agiert über unbekannte Rückkopplungsschleifen antagonistisch zur Aktivität von RhoA (196, 200, 204). Aktiviertes RhoA bindet an die Kinase Rho-associated protein kinase (ROCK). Das aktivierte Protein ROCK führt direkt und indirekt zu einer Erhöhung von phosphorylierten und somit aktiven MLC2. Zum einen inhibiert ROCK die myosin light chain phosphatase (MLCP) (205), zum anderen phosphoryliert ROCK MLC2 direkt (195, 206, 207).

ROCK kann auch, ähnlich wie PAK, die LIMK aktivieren und somit Cofilin inhibieren, so dass aufgrund der inhibierten Depolymerisierung F-Aktin akkumulieren kann (208).

Zusammenfassend führt die Aktivität von ROCK durch Kontraktion nicht nur zu einer Erhöhung der Migration, es kann auch den statischen Phänotyp begünstigen, indem es die

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28 Myosin-2 abhängige Bildung der stabilen Stressfasern und die Bildung fokaler Adhäsionen bewirkt (88).

1.5.3. Motilität der humanen endometrialen Stromazellen

Das migratorische Potential humaner endometrialer Stromazellen wurde lange Zeit nur im Kontext der Endometriose beschrieben und analysiert. Endometriose ist eine weit verbreitete, benigne Dislokation von endometrialen Zellen außerhalb des Uterus (209).

Vermutet wird, dass die Migration endometrialer Stromazellen in der frühen proliferativen Phase zur Wiederherstellung der funktionellen Schicht eine Rolle spielt (171, 194, 210).

Grewal et al. entdeckten jedoch, dass die Migration endometrialer Stromazellen auch für die Implantation der Blastozyste kritisch zu sein scheint (211).

Bei der Implantation und Invasion der Blastozyste in die funktionelle dezidualisierende Schicht des Endometriums sind migratorische Prozesse allgemein von großer Bedeutung.

Vor allem die Migration und Invasion von EVTs sind Gegenstand vieler Untersuchungen (76, 94, 212). Die Identifikation der Regulatoren, welche autokrin oder parakrin die Motilität von Trophoblastzellen und endometrialen Stromazellen adressieren, sind klinisch von großem Interesse, da neben der Endometriose (entartete Migration der endometrialen Stromazellen), auch Präeklampsie (unzureichende Migration und Invasion der EVTs) und habitueller Abort auf disregulierte Migrationsprozesse zurückzuführen sein könnten (69, 213, 214).

Zahlreiche Untersuchungen belegen einen Einfluss endometrialer Sekretprodukte auf migrationsrelevante Funktionen von EVTs. So wird in EVTs durch Überstandsmedium von Deziduazellen, jedoch nicht von nicht dezidualisierten endometrialen Stromazellen, die Expression von MMP-2, MMP-3 und MMP-9 und Integrinen erhöht (81, 215). In einer Ko-Kultur von EVTs mit dezidualisiertem Gewebe aus dem ersten Trimester konnte in den EVTs ebenfalls eine erhöhte Expression von MMPs beobachtet werden (216). Auch die Expression von weiteren Proteinen, wie die des Zelladhäsionsproteins carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), wird in EVT-Zellen nach Inkubation mit Überstandsmedium dezidualisierter humaner endometrialer Stromazellen erhöht (217).

Menkhorst et al. beobachteten in EVTs, dass Überstandsmedium von dezidualisierten endometrialen Stromazellen eher zu einer Erhöhung von Adhäsionsproteinen führte, während Überstandsmedium nicht dezidualisierter Zellen die Expression von Proteinasen verstärkte (97). Unsere Arbeitsgruppe stellte in vorangegangenen Versuchen eine erhöhte Expansion von trophoblastären Sphäroiden auf einem Stromazellrasen von dezidualisierten im Vergleich zu nicht dezidualisierten Zellen fest (217).

Reziprok wird das Expressionsmuster humaner endometrialer Stromazellen durch Anwesenheit trophoblastärer Produkte ebenfalls beeinflusst. In einer Ko-Kultur mit Ersttrimester Trophoblast-Explantaten wurde in nicht dezidualisierten endometrialen

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29 Stromazellen eine vermehrte Expression von 165 Genen detektiert, darunter Transkripte für CXCL1, CXCL2, CXCL8, Dickkopf-related protein 1 (DKK1), Pentraxin-related protein PTX3 (PTX3/TSG-14), IGF-2, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4 und EGFR (218). Nach Inkubation mit Trophoblast-Überstandsmedium verändern auch dezidualisierte endometriale Stromazellen innerhalb weniger Stunden ihre Genexpression. Eine Erhöhung wurde dabei unter anderem bezüglich der Transkripte für IL-1β, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCR4, CCL8, PTX3/TSG-14, IL-6, CCL2 und uPA, eine Reduktion bezüglich αSMA, Angiopoietin, IGF-1 und TGF-β1 beobachtet (101). Teklenburg et al. beschrieben, dass dezidualisierte, jedoch nicht undezidualisierte endometriale Stromazellen in Gegenwart einer abnormal entwickelten Blastozyste die Sekretion implantationsrelevanter Faktoren, wie IL-1β und HB-EGF, senkten (12). Ergänzend hierzu beobachtete unsere Arbeitsgruppe nach Zugabe von HB-EGF und IL-1β eine erhöhte Trophoblastsphäroid-Expansion auf nicht dezidualisierten endometrialen Stromazellen (217).

Die Platzierung einer Blastozyste auf einem endometrialen Zellrasen dient als in vitro Implantationsmodell zur Untersuchung des trophoblastär-maternalen Dialogs. In einem solchen Ansatz beobachteten Grewal et al., dass die Ausbreitung einer humanen Blastozyste auf einem Zellrasen dezidualisierter humaner endometrialer Stromazellen essenziell abhängig von der stromalen Motilität war. Diese Motilität wurde wiederum reguliert durch die Expression und Aktivität der migrationsrelevanten Rho-GTPasen Rac1 und RhoA.

Eine Inhibierung von Rac1 führte zu einer geringeren Expansion der Trophoblastzellen, während die Inhibierung von RhoA/ROCK zu einer Erhöhung führte. Diese Beobachtung spiegelte sich auch in der endometrialen Motilität wieder. Die Inhibierung von Rac1 reduzierte die Migration der endometrialen Stromazellen, während die Inhibierung von RhoA/ROCK sie erhöhte (211). Versuche, welche die Ausbreitung von Mausblastozysten auf dezidualisierten humanen endometrialen Stromazellen adressierten, bestätigten endometriales Rac1 als promigratorische Regulations-Komponente für Stromazellen und für die Trophoblast-Ausbreitung, während die RhoA/ROCK-Signalkaskade antagonistisch wirkte.

Die Inhibierung von Rac1 führte zum Anstieg von fokalen Adhäsionen in der Zellperipherie, eine Inhibierung von Cdc42 und der RhoA/ROCK-Signalkaskade führte zu einer Reduktion der fokalen Adhäsionen und Stressfasern (219). Mikroskopische Zeitrafferaufnahmen vermittelten den Eindruck, dass die erhöhte Motilität endometrialer Stromazellen, ausgelöst durch die Gegenwart von Trophoblastzellen, zu einer Entfernung der endometrialen Stromazellen von den invadierenden Trophoblastzellen der Blastozyste führte und so die Invasion aufgrund des vakanten Raumes erleichterten (211). Ergänzend zu dieser Annahme, dass die Motilität der endometrialen Stromazellen die Implantation und Invasion unterstützt, wurde in vitro bei Anwesenheit einer defekten Blastozyste eine Reduktion der Migration dezidualisierter endometrialer Stromazellen beobachtet (214). Unsere Arbeitsgruppe

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30 beobachtete, dass dezidualisierte endometriale Stromazellen, im Vergleich zu undezidualisierten Zellen, eine erhöhte chemotaktische Invasivität aufweisen, welche wahrscheinlich auf eine erhöhte Sekretion von MMP-2 und MMP-9 zurückzuführen ist. Die Verwendung von Überstandsmedium einer Trophoblastzelllinie erhöhte die chemotaktische Migration und Invasion endometrialer Zellen ebenfalls (82).

Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Trophoblastzellen Faktoren sezernieren, welche die Motilität humaner endometrialer Stromazellen beeinflussen. Trophoblastzellen stimulieren autokrin eine Migration und Invasion durch die Sekretion verschiedener Faktoren, eine parakrine Wirkung dieser Stimuli auf die Migration endometrialer Stromazellen wäre ebenfalls möglich. Zu den autokrin wirksamen Faktoren zählt das Hormon hCG (85, 220), welches durch Interaktion mit endometrialen Stromazellen von der Blastozyste vermehrt exprimiert wird (77). Weitere Beispiele sind HB-EGF (159), LIF (221) und VEGF-A (181, 187, 222).

Für nicht dezidualisierte endometriale Stromazellen wurde PDGF-BB, als ein potenter Stimulus der Proliferation, der Chemokinese und der Chemotaxis nachgewiesen (171).

PDGF-BB, EGF und 17β-Estradiol (E2) stimulieren in endometrialen Stromazellen eine Chemotaxis durch Aktivierung der PI3K/Akt- und der ERK1/2-Signalkaskaden, während die Gegenwart des Hormons Progesteron inhibitorisch auf die durch PDGF-BB induzierte Migration wirkt (173). Nach Behandlung mit PDGF-BB nehmen endometriale Stromazellen einen migratorischen Phänotyp an, welcher durch einen schnellen Abbau von F-Aktin Stressfasern und Ausbildung einer polarisierten Lauffront gekennzeichnet ist (198). Die Behandlung mit dem migrationsauslösenden E2 führt ebenfalls zu einer Reduktion der Stressfasern. Hierbei wurde die Beteiligung der RhoA/ROCK-Signalkaskade nachgewiesen (223).

Auch in endometriotischen Zellen kann durch PDGF-BB und E2 eine Chemotaxis induziert werden, diese wird jedoch durch eine Progesteron-Behandlung nicht erniedrigt (198). Die veränderte Ansprechbarkeit endometriotischer Zellen auf externe Faktoren spiegelt sich in einer abnormalen Aktivierung der RhoA/ROCK- und ERK1/2-Signalkaskaden wieder (224).