Motilität von humanen endometrialen Stromazellen
– Rolle in der Implantation und Plazentation –
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
an der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften,
Fachbereich Biologie
der Universität Hamburg
vorgelegt von
Maren Schwenke
Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden im Endokrinologikum Hamburg unter Anleitung von Frau Dr. rer. nat. Birgit Gellersen durchgeführt.
1. Gutachter: Dr. rer. nat. Birgit Gellersen 2. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Hartwig Lüthen Tag der Disputation: 08.11.2013
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS ... I
ABSTRACT ... V
ZUSAMMENFASSUNG ... VI
1. EINLEITUNG ... 1
1.1. Das humane Endometrium ... 1
1.1.1. Histologischer Aufbau des humanen Endometriums ... 1
1.1.2. Zyklische Differenzierung des humanen Endometriums ... 1
1.1.2.1. Die Menstruationsphase ... 2
1.1.2.2. Die proliferative (follikuläre) Phase ... 2
1.1.2.3. Die sekretorische (luteale) Phase ... 3
1.2. Die Dezidualisierung der endometrialen Stromazellen ... 4
1.2.1. Morphologische Differenzierung der endometrialen Stromazellen ... 5
1.2.2. Induktion der Dezidualisierung ... 5
1.2.3. Biochemische Differenzierung in Folge der Dezidualisierung ... 6
1.2.4. Umstrukturierung der extrazellulären Matrix (EZM) ... 8
1.2.5. Dezidualisierung endometrialer Stromazellen in vitro ... 8
1.3. Die Implantation und Invasion der Blastozyste... 9
1.3.1. Das Implantationsfenster ... 9
1.3.2. Die Invasion der Blastozyste in das maternale Endometrium ... 10
1.4. Faktoren der Trophoblast-Endometrium Interaktion ... 12
1.4.1. Adhäsionsproteine und Proteinasen ... 13
1.4.2. Zytokine ... 15
1.4.2.1. Chemokine ... 15
1.4.2.2. Die Interleukin-6 Familie ... 16
1.4.2.3. Die pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β, TNF-α und MIF ... 17
1.4.3. Wachstumsfaktoren ... 19
1.4.3.1. Das IGF-System ... 19
1.4.3.2. Die EGF-Familie (EGF und HB-EGF) ... 19
1.4.4. Angiogenetische Wachstumsfaktoren ... 21 1.4.4.1. Die PDGF-Familie ... 21 1.4.4.2. VEGF und PLGF ... 22 1.4.4.3. TGF-β1... 23 1.5. Zellmigration ... 24 1.5.1. Das Aktin-Zytoskelett ... 24
1.5.2. Molekulare Regulation der Migration ... 26
1.5.3. Motilität der humanen endometrialen Stromazellen ... 28
1.6. Arbeitshypothese und Zielsetzung ... 30
2. MATERIAL ... 32
2.1. Zellkultur... 32
Inhaltsverzeichnis
II
2.1.2. Humane Zelllinien ... 33
2.1.2.1. Die extravillöse Trophoblastzelllinie AC-1M88 ... 33
2.1.2.2. Die endometriale Stromazelllinie St-T1b ... 33
2.1.3. Primäre humane endometriale Stromazellen (hESC) ... 33
2.2. Behandlungsfaktoren ... 34
2.2.1. Käuflich erworbene Behandlungsfaktoren ... 34
2.2.2. Überstandsmedium von primären Chorionzotten-Explantaten (Pl-ÜM)... 35
2.3. Antikörper ... 36
2.3.1. Primärantikörper ... 36
2.3.2. Sekundärantikörper ... 37
2.3.3. Neutralisierende Antikörper ... 37
2.4. Inhibitoren und Antagonisten ... 37
2.5. Angesetzte Puffer und Lösungen ... 38
2.6. Primer ... 40 2.7. Sonstige Chemikalien ... 40 2.8. Geräte ... 41 2.9. Software... 41
3. METHODEN ... 42
3.1. Zellbiologische Methoden ... 423.1.1. Kultivierung von humanen endometrialen Stromazellen ... 42
3.1.1.1. In vitro Dezidualisierung von humanen endometrialen Stromazellen ... 42
3.1.2. Kultivierung der extravillösen Trophoblastzelllinie AC-1M88 ... 42
3.1.3. Zellzahlbestimmung mittels Neubauer Zählkammer ... 43
3.1.4. Produktion von AC-1M88 Überstandsmedium (T-ÜM) ... 43
3.1.5. Färbemethoden für Zellen ... 43
3.1.5.1. Diff-Quik Färbung fixierter Zellen ... 43
3.1.5.2. Fluoreszenzfärbung mit Vybrant Lebendfarbstoffen... 44
3.1.5.3. Färbung mit Kristallviolett ... 44
3.1.5.4. Fluoreszenzfärbung mit Vision Blue ... 44
3.1.5.5. Fluoreszenzfärbung mit Calcein AM ... 45
3.1.6. CellTiter-Glo Lumineszenz Assay ... 45
3.1.7. Verwendete Methoden zur Analyse von Zellmotilität ... 46
3.1.7.1. Untersuchung von Chemotaxis: Der Transwell-Migrationsassay ... 46
3.1.7.2. Untersuchung von Chemotaxis: Der FluoroBlok-Migrationsassay ... 48
3.1.7.3. Untersuchung von Chemokinese: Der Oris-Migrationsassay ... 48
3.1.7.3.1. Auswertung des Oris-Migrationsassays mittels Calcein AM ... 49
3.1.7.3.2. Auswertung des Oris-Migrationsassays mittels Diff-Quik Färbung ... 50
3.1.8. Kurzstimulation ... 52
3.1.9. Statistische Auswertung ... 53
3.2. Proteinbiochemische Methoden ... 53
3.2.1. Gewinnung von Proteinextrakten nach Kurzstimulation ... 53
3.2.2. Gewinnung von Proteinextrakten mittels RIPA-Extraktionspuffer... 53
3.2.3. Bestimmung der Proteinkonzentration in RIPA-Extrakten ... 54
3.2.4. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 54
3.2.5. Westernblot-Analyse ... 55
3.2.5.1. Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran ... 55
3.2.5.2. Immundetektion ... 55
3.2.5.3. Strippen der Antikörper von PVDF-Membranen ... 56
Inhaltsverzeichnis
III
3.2.6.1. Verwendete Proben für den Proteome Profiler Array ... 56
3.2.6.2. Durchführung des Proteome Profiler Arrays ... 57
3.2.6.3. Auswertung des Proteome Profiler Arrays ... 57
3.2.7. Quantitative Bestimmung der Prolaktin-Sekretion ... 58
3.3. Molekularbiologische Methoden ... 59 3.3.1. RNA-Extraktion ... 59 3.3.2. cDNA-Synthese ... 60 3.3.3. PCR ... 60 3.3.4. Agarose-Gelelektrophorese ... 62
4. ERGEBNISSE ... 64
4.1. Etablierung und Optimierung der Methoden ... 64
4.1.1. Optimierung des Transwell-Migrationsassays ... 64
4.1.1.1. Die Vybrant Zellfarbstoffe ... 64
4.1.1.1.1. Untersuchung der Stabilität der Vybrant Fluoreszenz... 65
4.1.1.1.2. Untersuchung der Proportionalität und Sensitivität der Vybrant Fluoreszenz... 67
4.1.1.2. Der lumineszente Zellviabilitätsassay CellTiter-Glo ... 69
4.1.1.2.1. Untersuchung der Sensitivität von CellTiter-Glo ... 69
4.1.1.2.2. Optimierung des Transwell-Migrationsassays mit CellTiter-Glo ... 69
4.1.1.3. Test des Farbstoffs Kristallviolett ... 70
4.1.2. Etablierung des FluoroBlok-Migrationsassays ... 71
4.1.2.1. Die Fluoreszenzfärbung mit Vision Blue ... 72
4.1.2.2. Test der Sensitivität von Calcein AM ... 72
4.1.2.3. Optimierung des FluoroBlok-Migrationsassays ... 73
4.1.3. Etablierung des Oris-Migrationsassays ... 77
4.1.3.1. Optimierung der Rahmenbedingungen des Oris-Migrationsassays ... 78
4.1.3.2. Optimierung des Oris-Migrationsassays ... 80
4.1.4. Nachweis und Charakterisierung der Dezidualisierung ... 84
4.1.5. Entzug des Dezidualisierungsstimulus in St-T1b Zellen ... 87
4.2. Charakterisierung der Migration von humanen endometrialen Stromazellen ... 89
4.2.1. Analyse der Chemotaxis nicht dezidualisierter und dezidualisierter endometrialer Stromazellen ... 89
4.2.2. Analyse der Chemokinese nicht dezidualisierter und dezidualisierter endometrialer Stromazellen ... 95
4.2.3. Charakterisierung der Signalkaskaden ... 96
4.3. Analyse der Funktion von HB-EGF in Migrationsprozessen ... 99
4.3.1. Analyse der HB-EGF-Rezeptorexpression in endometrialen Stromazellen ... 99
4.3.2. Analyse der EGFR-Aktivierung ... 101
4.3.3. Auswirkung einer HB-EGF Neutralisierung auf die Chemotaxis... 103
4.3.4. Auswirkung der Inhibierung des Rezeptors EGFR und der Blockierung von HB-EGF auf die Chemotaxis ... 104
4.4. Proteom-Analyse der Zell-Überstandsmedien ... 106
4.4.1. Analyse der Sekretionsprodukte von AC-1M88 Zellen und St-T1b Zellen ... 107
4.4.2. Analyse der Sekretionsprodukte von Chorionzotten-Explantaten ... 110
4.5. Analyse der Wirkung von Trophoblast-Sekretionsprodukten auf Migrationsprozesse ... 114
4.5.1. Einfluss der Trophoblast-Sekretionsprodukte auf die Chemotaxis ... 114
4.5.1.1. Auswirkung der Neutralisation von PDGF auf die Chemotaxis ... 117
4.5.2. Analyse der Trophoblast-Sekretionsprodukte in der Chemokinese... 119
4.5.3. Effekte der Überstandsmedien und Sekretionsprodukte auf die Signaltransduktion... 121
4.6. Aufschlüsselung migrationsrelevanter Signalwege ... 123
4.6.1.Test der Spezifität und Konzentration der Inhibitoren ... 123
4.6.2. Wirkung der Inhibition auf die Chemotaxis von endometrialen Stromazellen ... 128
Inhaltsverzeichnis
IV
5. DISKUSSION ... 133
5.1. Etablierung der Methoden ... 133
5.1.1. Versuche zur Analyse der Chemotaxis ... 133
5.1.2. Etablierung des Oris-Migrationsassays zur Analyse von Chemokinese... 135
5.1.3. Analyse der Dezidualisierung... 136
5.2. Charakterisierung der Motilität humaner endometrialer Stromazellen ... 137
5.2.1. Das Migrationspotential humaner endometrialer Stromazellen ... 137
5.2.2. Einfluss von Trophoblast-Überstandsmedium auf die Migration ... 137
5.3. Identifikation von migrationsauslösenden Faktoren im Implantationsdialog ... 138
5.3.1. Die Proteom-Analyse ... 138
5.3.2. Migratorisch negativ getestete Faktoren ... 140
5.3.2.1. Die VEGF-Familie ... 140
5.3.2.2. CXCL12, MIF und weitere Zytokine im Implantationsdialog ... 141
5.3.3. Mögliche migratorisch wirksame Trophoblast-Produkte ... 143
5.3.3.1. Die PDGF-Familie ... 143
5.3.3.2. HB-EGF ... 144
5.4. Analyse potentieller Signalwege der Migration... 146
5.4.1. Der EGF/HB-EGF-Rezeptor EGFR ... 146
5.4.2. An der Regulation von Chemotaxis und Chemokinese beteiligte Signalkaskaden ... 149
5.4.3. Inhibierung der Rac1- und ROCK-Signaltransduktion ... 152
5.5. Fazit: Motilität endometrialer Stromazellen während der Implantation ... 155
6. AUSBLICK ... 158
7. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 160
8. LITERATURVERZEICHNIS ... 164
9. DANKSAGUNG ... 182
LEBENSLAUF ... 183
PUBLIKATIONSLISTE... 184
EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG ... 185
Abstract
V
Abstract
Successful implantation of a human blastocyst and formation of the placenta requires deep invasion of the trophoblast into the decidualized endometrium. It is assumed that decidualized tissue forms a passive barrier that limits trophoblast invasion. Recently, it became evident that human endometrial stromal cells also have remarkable motile and invasive capacities, which may facilitate the extensive tissue remodelling associated with implantation and placentation.
In the present study, directed migration (chemotaxis) and random migration (chemokinesis) of non-decidualized and decidualized human endometrial stromal cells were characterized. Local factors, present in the uterine environment at the time of implantation, and trophoblast-derived factors were tested for their ability to modulate stromal cell motility. Further, involved signalling pathways were dissected.
A modest increase of basal motility was observed in human endometrial stromal cells upon decidualization. Among the factors inducing chemotactic migration, solely PDGF-BB also elicited a chemokinetic response. Chemotaxis towards HB-EGF was increased in decidualized human endometrial stromal cells compared to non-decidualized human endometrial stromal cells, coincident with up-regulation of the HB-EGF receptor EGFR. Chemotaxis of endometrial stromal cells was stimulated by supernatants prepared from the trophoblast cell line AC-1M88 and from first trimester villous explant cultures. Proteome profiling of trophoblast supernatants revealed PDGF-AA as a chemotactic component, whereas other prominent trophoblast secretions, including MIF, PLGF, TGF-β1 and VEGF, were ineffective. PDGF-BB and HB-EGF were not detectable as trophoblast secretory products.
By using specific pathway inhibitors, signalling through ERK1/2, PI3K/Akt(Ser473) and p38 were demonstrated to be involved in chemotaxis. Chemokinesis, on the other hand, appeared to depend mainly on activation of the PI3K/Akt(Ser473) pathway. Chemotaxis and chemokinesis were both massively stimulated by inhibition of the RhoA/ROCK signalling cascade.
In conclusion, we postulate the following scenario for early human pregnancy: Trophoblast-derived products, including PDGF-AA, induce a chemotactic response in decidualized endometrial stromal cells towards the implanting intruder. Within the developing decidua, various cell populations produce factors like HB-EGF and PDGF-BB, which trigger endometrial stromal cell migration in response to local gradients. PDGF-BB additionally stimulates random endometrial stromal cell motility. In concert, these processes contribute to tissue remodelling at the fetal-maternal interface.
Zusammenfassung
VI
Zusammenfassung
Für die erfolgreiche Implantation einer humanen Blastozyste und Ausbildung der Plazenta ist die tiefe Invasion der Trophoblastzellen in das Endometrium Grundvoraussetzung. Neuere Studien zeigen, dass dezidualisierte endometriale Stromazellen ebenfalls ein migratorisches Potential besitzen. Hierdurch könnte die Umstrukturierung des Gewebes und die Einnistung der Blastozyste aktiv unterstützt werden. In dieser Arbeit wurde die gerichtete (Chemotaxis) und die ungerichtete (Chemokinese) Migration nicht dezidualisierter und dezidualisierter humaner endometrialer Stromazellen verglichen. Faktoren, welche zum Zeitpunkt der Implantation lokal im uterinen Milieu nachgewiesen worden waren, sowie Trophoblast-Sekretionsprodukte wurden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Migration untersucht. Zusätzlich sollten die beteiligten Signaltransduktionen aufgeschlüsselt werden.
Es zeigte sich, dass die Dezidualisierung das basale migratorische Potential endometrialer Stromazellen leicht erhöhte. Unter den Chemotaxis auslösenden Faktoren war einzig PDGF-BB in der Lage, auch eine chemokinetische Motilität der endometrialen Stromazellen zu induzieren. Die chemotaktische Antwort auf HB-EGF wurde durch Dezidualisierung der Zellen verstärkt, was mit einer erhöhten Expression seines Rezeptors EGFR korrelierte. Überstandsmedium sowohl von der Trophoblastzelllinie AC-1M88 als auch von primären Chorionzotten-Explantaten löste eine Chemotaxis aus. Anhand einer Proteom-Analyse wurde PDGF-AA als chemotaktisch aktive Komponente der Trophoblast-Überstände identifiziert, wohingegen die Sekretionsprodukte MIF, PLGF, TGF-β1 und VEGF unwirksam waren. PDGF-BB und HB-EGF wurden in den Trophoblast-Überstandsmedien nicht aufgefunden. Inhibitor-Studien zeigten, dass Signalkaskaden unter Beteiligung von PI3K/Akt(Ser473), ERK1/2 und p38 für die Chemotaxis relevant sind, während eine Chemokinese vorrangig von der Aktivierung des PI3K/Akt(Ser473)-Weges abhängig ist. Sowohl Chemotaxis als auch Chemokinese wurden durch Inhibierung der RhoA/ROCK-Signaltransduktion massiv stimuliert.
Zusammenfassend könnte folgendes Modell postuliert werden: Vom Trophoblasten ausgehende chemotaktische Signale, unter anderem PDGF-AA, veranlassen die sich in der Nähe des Invasionsortes befindlichen dezidualisierten Stromazellen, sich in Richtung des „Eindringlings“ zu bewegen. In der sich ausbildenden Dezidua führen von verschiedenen Zelltypen produzierte Faktoren, wie HB-EGF und PDGF-BB, zu einer Migration in Richtung lokaler Gradienten, und PDGF-BB stimuliert darüber hinaus die generelle ungerichtete Motilität der endometrialen Stromazellen. Insgesamt unterstützen diese Prozesse den für Implantation und Plazentation erforderlichen Gewebeumbau.
1. Einleitung
1
1. Einleitung
1.1. Das humane Endometrium
1.1.1. Histologischer Aufbau des humanen Endometriums
Der Uterus ist in drei Gewebeschichten unterteilt, das Endometrium (Tunica mucosa), das Myometrium (Tunica muscularis) und das umkleidende Perimetrium (Tunica serosa). Das Myometrium bestreitet den größten Teil des Uterus und besteht aus Schichten glatter Muskulatur. Angrenzend an das Myometrium folgt die der Uterushöhle anliegende Gebärmutterschleimhaut, das Endometrium (1, 2).
Das Endometrium wird wiederum unterteilt in eine dem Myometrium anliegende basale Schicht (basalis) und eine äußere funktionelle Schicht (functionalis), die mit einer einzelligen Epithelschicht (luminales Epithel) zur Uterushöhle abschließt (3). Die geweblichen Bestandteile des Endometriums sind das stromale Kompartiment aus fibroblast-ähnlichen Zellen mesenchymalen Ursprungs, Drüsengänge (glanduläres Epithel) und Spiralarterien, welche das Stromagewebe durchziehen. Zusätzlich befinden sich Immunzellen, wie T-Lymphozyten, uterine natürliche Killerzellen (uNK) und Makrophagen im Endometrium (1).
1.1.2. Zyklische Differenzierung des humanen Endometriums
Das humane Endometrium ist ein hoch dynamisches Gewebe und unterliegt einem standardisierten Zyklus von 28 Tagen (Abb. 1) (3). Hypothalamus, Hypophyse und Ovar produzieren Hormone, die im Endometrium Apoptose, Proliferation, Differenzierung und Sekretion zeitlich steuern. Die resultierende zyklische Umstrukturierung der funktionellen Schicht schafft eine geeignete Struktur für einen Konzeptus, welcher eine bestimmte Entwicklungsphase durchlaufen hat. Dabei ist der essentielle Kontrollpunkt der endometrialen Zyklizität der Hypothalamus, welcher pulsatil Gonadotropin-freisetzendes Hormon (GnRH) ausschüttet. Über das Pfortadersystem gelangt GnRH zum Hypophysenvorderlappen (Adenohypophyse) und steuert hier die Sekretion des luteinisierenden Hormons (LH) und des follikelstimulierenden Hormons (FSH) (3-6).
Unterteilt wird der menschliche Zyklus in drei Phasen: die Menstruationsphase (Tag 1 bis 4), die proliferative (Follikel-) Phase (Tag 5 bis 14) und die sekretorische (Luteal-) Phase (Tag 14 bis 28). Dabei wird der erste Tag des Zyklus mit dem Beginn der Abstoßung der funktionellen Schicht festgelegt. Die Ovulation erfolgt an Tag 14 und markiert den Wechsel von der proliferativen zur sekretorischen Phase (3, 4).
1. Einleitung
2
Abb. 1: Übersichtsschema des humanen Menstruationszyklus.
Veränderungen des endometrialen Gewebes (unteres Panel) unter Einfluss der Hormone (oberes Panel) Estrogen (perforierte Linie) und Progesteron (volle Linie) über den normalisierten Zyklus von 28 Tagen. Modifiziert nach (3).
1.1.2.1. Die Menstruationsphase
Beim Ausbleiben der Implantation einer Blastozyste kommt es im Endometrium zum Ende eines Zyklus zu einer Absenkung der Estrogen- und Progesteron-Konzentration und zum Influx von uNKs aus dem vaskulären System, welche schließlich bis zu 40 % der Gesamtzellmasse der funktionellen Schicht ausmachen. Durch diese spezifischen uNKs wird eine Entzündungsantwort und durch die Aktivität von Prostaglandinen eine Kontraktion des Myometriums hervorgerufen. Dies führt zu einer Ablösung der funktionellen Schicht von der basalen Schicht. Durch Zellmigration und kontrollierte Apoptose, unterstützt von Matrix-degenerierenden Proteinasen, Wachstumsfaktoren und Zytokinen, wird zunächst das luminale Epithel wieder hergestellt und mit dem Wiederaufbau der funktionellen Schicht die proliferative Phase eingeleitet (3, 4).
1.1.2.2. Die proliferative (follikuläre) Phase
Das Endometrium besteht am 5. Tag des Zyklus aus einer ca. 1 mm dünnen basalen Schicht, die von engen und kleinen Drüsengefäßen durchzogen ist.
In jedem Zyklus differenziert sich im Ovar eine Kohorte von 6-12 Primordialfollikel, bestehend aus einer Oozyte, einer einzelligen Epithelschicht (Vorläufer der Granulosazellen) und einer äußeren Basalmembran, weiter zu Primärfollikel. Das in der Adenohypophyse gebildete FSH gelangt über die Blutbahn zum Ovar und führt hier zu einer fortsetzenden Reifung der Primärfollikel zu Sekundär- und Tertiärfollikel. Ein Tertiärfollikel besitzt schließlich eine mehrzellige Epithelschicht (Granulosazellen) und zwei Schichten mesenchymaler Thekazellen. Letztere befinden sich außerhalb der Basalmembran.
1. Einleitung
3 Granulosazellen exprimieren hauptsächlich den FSH-Rezeptor und weniger den Rezeptor für LH. Thekazellen exprimieren nur den LH-Rezeptor. Das ebenfalls in der Adenohypophyse gebildete LH aktiviert in den Thekazellen eine Steroidsynthese, so dass aus Cholesterin Androgene (z.B. Androstendion, Testosteron) synthetisiert werden. FSH aktiviert in den Granulosazellen eine Aromatase und somit die Bildung von Estrogen aus den thekalen Androgenen. Zusätzlich erhöht sich in den Granulosazellen durch Bindung von FSH die Expression des FSH-Rezeptors. Die Follikel selber produzieren das Peptidhormon Aktivin, das in der Hypophyse wiederum die FSH-Ausschüttung stimuliert. Auf diese Wiese steigt die Estrogen-Konzentration im Körper kontinuierlich an (5, 6).
In der proliferativen Phase werden die beiden Estrogen-Rezeptoren (ER) ER-α und ER-β maximal exprimiert. Die dominierende Isoform ER-α wurde in den Epithelzellen wie auch in den Stromazellen der funktionellen Schicht nachgewiesen. Estrogen führt im Verlauf der proliferativen Phase zu einer Erhöhung der Expression der Progesteron-Rezeptoren (PR) PR-A und PR-B. Dabei liegt vor allem PR-A als dominante Isoform der Stromazellen im Endometrium vor, während PR-B in den glandulären Epithelzellen exprimiert wird. Estrogen regt eine Mitose aller endometrialen Zelltypen an, so dass sich bis zum Ende der proliferativen Phase eine bis zu 4 mm dicke funktionelle Schicht aufbaut (3).
Durch den langsamen Anstieg der Estrogen-Konzentration wird die Produktion von FSH gehemmt (negative Estrogen Rückkopplung) und somit das Follikelwachstum reduziert. Dies wird zusätzlich durch das Peptidhormon Inhibin unterstützt, welches in den Granulosazellen produziert wird. Nur der dominante Follikel mit der höchsten FSH-Rezeptorexpression kann den folgenden FSH-Mangel bewältigen. Die übrigen Follikel akkumulieren aufgrund mangelnder Aromatase-Aktivität die produzierten Androgene und gehen schließlich zugrunde.
Der dominante Follikel wächst weiter und steigert seine Estrogen-Produktion bis ein Maximum zwischen dem 10. und 13. Tag des Zyklus erreicht wird. Dies führt wiederum zur Freisetzung von LH und FSH (positive Estrogen Rückkopplung). Die steigende Estrogen-Konzentration führt auch zu einer induktion der Expression des LH-Rezeptors in den Granulosazellen. Eine Bindung von LH induziert in Granulosazellen die Produktion von Progesteron (5-7).
1.1.2.3. Die sekretorische (luteale) Phase
Am 14. Tag des Zyklus findet die Ovulation statt. Dies ist der Beginn der sekretorischen bzw. lutealen Phase. Auslöser der Ovulation ist der plötzliche LH-Anstieg, der von einem leichten FSH-Anstieg begleitet wird. LH, Progesteron und Prostaglandine erhöhen die Konzentration von Plasmin und Kollagenase. Dies führt zu einer Ruptur der Follikelwand und „Auslaufen“ der Oozyte mit der umgebenden Glykoproteinhülle (Zona pellucida) aus dem Ovar. Die im
1. Einleitung
4 Ovar verbleibende Follikelwand bildet sich zum Gelbkörper (Corpus luteum) weiter. Die Granulosazellen und Thekazellen des Gelbkörpers werden nun in ihrer Gesamtheit als Lutealzellen bezeichnet. Die Lutealzellen der sekretorischen Phase produzieren weiter Estrogen, aber vor allem auch hohe Mengen Progesteron (Lutealisierung) (5, 6). Bei steigender Progesteron-Konzentration sinkt die Expression des Estrogen-Rezeptors und damit die Estrogen-induzierte Mitoseaktivität in der funktionellen Schicht des Endometriums (3).
Etwa 8 bis 10 Tage nach der Ovulation und Beginn des LH induzierten Anstiegs der Progesteron-Konzentration beginnt die Differenzierung der funktionellen Schicht des Endometriums. Während dieses Prozesses vergrößern und verlängern sich die nun gewundenen Drüsengefäße. Die Sekretion von Glykogenen der glandulären Epithelzellen erhöht sich, die Spiralarterien bilden sich weiter aus und es kommt zu einem Influx spezifischer Immunzellen, der uNKs und Makrophagen. Ebenfalls beginnen sich die endometrialen Stromazellen zu differenzieren, ein Prozess, der als Dezidualisierung bezeichnet wird. Die Dezidualisierung beendet das Zeitfenster für eine mögliche Implantation einer Blastozyste (Implantationsfenster), welches im regelhaften Zyklus eine Rezeptivität zwischen dem 20. und 24. Zyklustag gewährleistet (3, 4, 6, 7).
Wenn keine Implantation stattfindet, kann die Dezidualisierung nicht lange fortgeführt werden. In Kombination mit dem ebenfalls sinkenden Estrogen-Spiegel fällt die GnRH-Ausschüttung im Hypothalamus, gefolgt von einer reduzierten LH-GnRH-Ausschüttung. Hierdurch senkt sich ca. 7 Tage nach der Ovulation die Sekretion von Progesteron im Gelbkörper. Der Gelbkörper degeneriert schließlich 10 bis 12 Tage nach der Ovulation zum Weißkörper (Corpus albicans). In Folge des sinkenden Progesteron-Spiegels wird eine proteolytische und apoptotische Degradation der funktionellen Schicht eingeleitet, die zur Menstruation führt.
Eine implantierende Blastozyste produziert das an den LH-Rezeptor bindende Hormon humanes Choriongonadotropin (hCG), welches die Progesteron-Produktion im Gelbkörper bis zur 20. Schwangerschaftswoche (SSW) aufrechterhält, ehe die Plazenta diese Funktion übernimmt. Da so die Degeneration des Gelbkörpers verhindert wird, entwickelt dieser sich zum Corpus luteum graviditatis. Die Dezidualisierung der Stromazellen schreitet weiter fort, so dass sich bei einer erfolgreichen Implantation eine funktionelle Dezidua (Endometrium der Schwangerschaft) ausbildet (3, 5-7).
1.2. Die Dezidualisierung der endometrialen Stromazellen
Die Dezidualisierung versetzt das endometriale Stroma in die Lage, eine kontrollierte Invasion des semiallogenen Trophoblasten und die Ausbildung der hämochorialen Plazenta
1. Einleitung
5 zuzulassen sowie oxidativen Stress zu überstehen (8-10). Neuere Studien zeigten zusätzlich, dass die Dezidualisierung endometriale Stromazellen für die Erkennung von entwicklungsgestörten Blastozysten sensibilisiert (11, 12).
1.2.1. Morphologische Differenzierung der endometrialen Stromazellen
Endometriale Stromazellen sind mesenchymalen Ursprungs und weisen während der proliferativen Phase einen länglichen fibroblastartigen Phänotyp auf. Ihre morphologische Veränderung während der Dezidualisierung beginnt in der Nähe der Spiralarterien etwa am 24. Zyklustag, ehe sie sich im weiteren Verlauf auf die angrenzenden Zellen ausbreitet. Diese Veränderungen sind durch eine Vergrößerung und Abrundung von Zelle und Zellkern charakterisiert. Zusätzlich steigt die Anzahl der Nucleoli, die Ausbreitung des sekretorischen Apparats in Kombination mit einer Erweiterung des rauen endoplasmatischen Retikulums und des Golgi-Komplexes sowie die Einlagerung von Glykogenen und Lipiden im Zytoplasma (3, 13, 14).
1.2.2. Induktion der Dezidualisierung
Beim Menschen ist die Dezidualisierung des endometrialen Stromas maternal induziert und wird nicht, wie z.B. bei Nagern, von der Anwesenheit einer Blastozyste gesteuert (15). Die durch steigende Progesteron-Konzentration modulierte Dezidualisierung setzt ein vorgestelltes Estrogen-Priming voraus (3, 16). Die Initiierung der Dezidualisierung selbst ist abhängig von einem steigenden intrazellulären Spiegel des sekundären Botenstoffs zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) sowie der anhaltenden Aktivierung des Holoenzyms Proteinkinase A (PKA) (17-19). Der PKA-Signalweg wird durch das erhöhte cAMP-Level aktiviert, indem jeweils zwei Moleküle cAMP an je einer der beiden regulatorischen Untereinheiten der PKA binden. Durch die Bindung erfolgt eine Konformationsänderung und dadurch begünstigte Ablösung der katalytischen von der regulatorischen Untereinheit. Diese katalytischen Untereinheiten aktivieren durch Phosphorylierung im Zytoplasma oder im Zellkern Zielmoleküle, wie den Transkriptionsfaktor CREB (cAMP-response element binding protein). CREB kontrolliert die Genexpression durch Bindung an palindromische CRE-Sequenzen (cAMP-response elements) von Promotoren cAMP-ansprechbarer Gene (19, 20). Für eine anhaltende Dezidualisierung ist Progesteron erforderlich (17, 21-24). Durch cAMP wird die Expression und Aktivität von verschiedenen Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise forkhead box protein O1 (FOXO1), reguliert, welche mit dem aktivierten Progesteron-Rezeptor interagieren und ein multimerisches Transkriptom formen, welches wiederum die Transkription dezidualisierungs-spezifischer Gene kontrolliert (17).
1. Einleitung
6 Faktoren, welche die Adenylatzyklase aktivieren und somit die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen, sind potentielle Modulatoren der Dezidualisierungsreaktion. Hierzu zählen Prostaglandin E2 (PGE2), die Gonadotropine LH und FSH, Corticotropin-freisetzendes
Hormon (CRH), Aktivin A sowie das trophoblastäre hCG (25-30). Relaxin, ein Hormon, welches durch den Gelbkörper und durch Stromazellen der späten sekretorischen Phase produziert wird, führt zusätzlich zu einer Erhöhung der cAMP-Konzentration in der Zelle, indem es Phosphodiesterasen inhibiert, die cAMP zu AMP abbauen. Durch Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Signalkaskade führt Relaxin auch zu einer direkten Phosphorylierung von CREB (31).
1.2.3. Biochemische Differenzierung in Folge der Dezidualisierung
Von der Vielzahl der Gene, welche durch die Dezidualisierung reguliert werden, ist die Transkription des Prolaktin (PRL)-Gens mit am stärksten induziert. PRL ist eines der Hauptsekretionsprodukte der dezidualisierten endometrialen Stromazellen in vivo. Die de
novo Synthese und Sekretion von PRL beginnt in der mittleren sekretorischen Phase und
steigt im Falle einer Schwangerschaft bis zu einem Maximum in der 20. bis 25. SSW. Dabei erfolgt die Anreicherung im Fruchtwasser, nicht in der Zirkulation (32).
Eine gewebespezifische Regulation der PRL-Transkription erfolgt durch Nutzung eines alternativen Promotors. Das humane PRL-Gen besitzt insgesamt 6 Exons (Abb. 2) (19).
Abb. 2: Schema des humanen Prolaktin-Gens.
Das humane Prolaktin-Gen (oberes Panel) beinhaltet 6 Exons. Die proteinkodierenden Exons sind schraffiert, nicht proteinkodierende Bereiche schwarz dargestellt. Die Transkriptionsstartseite für das hypophysäre Prolaktin befindet sich an Exon 1, während sich 5’-flankierend die beiden Verstärkerregionen (enhancer) befinden. Diese als distal enhancer (DE) und proximal enhancer (PE) bezeichneten Regionen weisen für die effiziente Expression des hypophysären Prolaktin-Proteins zahlreiche Bindestellen für Transkriptionsfaktoren auf.Initiierung der Transkription an Exon 1a führt im Vergleich zum hypophysären Prolaktin zu einem am 5’-UTR verlängerten dezidualen Transkript (unteres Panel). Die proteinkodierende Region beider Transkripte (hypophysär und dezidual) ist jedoch identisch, so dass ein identisches Translationsprodukt resultiert (19).
Der Promotor mit der Transkriptionsstartstelle für das hypophysäre PRL befindet sich bei Exon 1. Im Endometrium wird die PRL-Transkription allerdings von einem alternativen
1. Einleitung
7 Promotor gestartet, welcher sich beim nicht kodierenden Exon 1a befindet und ca. 6 kb stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle des hypophysären PRL liegt (33, 34). Somit besitzt die deziduale PRL (dPRL) mRNA einen verlängerten 5’-UTR Bereich. Das resultierende Protein ist jedoch zum hypophysären PRL identisch (19, 33-35).
Die Aktivität der cAMP/PKA/CREB-Signalkaskade induziert eine frühe, aber schwache Induktion der Promotoraktivität des dezidualen PRL-Gens über die proximale Verstärkerregion und markiert den Beginn der Dezidualisierung. Im weiteren Verlauf erfolgt eine späte und anhaltende Aktivierung des dezidualen PRL-Promotors, die in Wechselwirkung mit Progesteron verstärkt und durch die distale Verstärkerregion vermittelt wird (19).
Der PRL-Rezeptor wird vor allem in den glandulären Epithelzellen, weniger in der proliferativen Phase, aber erhöht in der mittleren bis späten sekretorischen Phase exprimiert. Während der Schwangerschaft wird er auch in der Dezidua, in Zytotrophoblastzellen und Synzytiotrophoblastzellen nachgewiesen. Die Funktionen von PRL im Endometrium sind vielfältig. Zum Beispiel reguliert es die glanduläre Sekretion, Angiogenese und beeinflusst die Proliferation von Immunzellen. Auch reguliert PRL das Wachstum, die Differenzierung, die Adhäsion und Invasion von Trophoblastzellen(32).
Ein weiteres Protein, welches während der Dezidualisierung von den endometrialen Stromazellen erhöht exprimiert und ins Lumen sezerniert wird, ist das Insulin-like growth
factor binding protein-1 (IGFBP-1) (36). IGFBP-1 bindet die Proteine Insulin-like growth factor-1/-2 (IGF-1 und IGF-2) und reguliert somit deren Aktivität. Es wird diskutiert, dass
IGFBP-1 die Invasivität von Trophoblastzellen moduliert (37-39).
Sowohl IGFBP-1 wie auch PRL werden als Marker der Dezidualisierung der humanen endometrialen Stromazellen verwendet (40).
Weitere Beispiele für Proteine, welche während der Dezidualisierung in endometrialen Stromazellen erhöht exprimiert und sezerniert werden, sind Interleukin (IL)-11, IL-15 (41, 42),
coagulation factor III (TF), plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) (43) und vascular endothelial growth factor (VEGF) (44).
Paule et al. beobachteten in Antwort auf eine Dezidualisierung eine veränderte Expression von 88 unter 2714 Proteinen, von denen ein großer Teil in Zusammenhang mit einer Umstrukturierung des Zytoskeletts steht (45). Beispielsweise reduziert die Dezidualisierung die Expression von α-smooth muscle actin (αSMA) (46, 47) und von myosin light chain
kinase (MLCK), die Kinase der leichten Kette von Myosin (MLC2). Dadurch reduziert sich der
Phosphorylierungszustand von MLC2 und es folgt die Reorganisation des Zytoskeletts (48). Microarray-Analysen zeigten, dass die Dezidualisierung mit einer veränderten Transkription von Hunderten von Genen einhergeht und somit zu einer komplexen Modulation zellulärer
1. Einleitung
8 Prozesse wie Adhäsion, Signaltransduktion, Differenzierung, Metabolismus, Apoptose, Umstrukturierung des Zytoskeletts und Umbau der extrazellulären Matrix (EZM) führt (21, 42, 49-52).
1.2.4. Umstrukturierung der extrazellulären Matrix (EZM)
Die EZM ist eine verbindende Struktur, welche sich im interzellulären Raum befindet. Sie bildet ein Gewebe-stabilisierendes Netz, bestehend aus Kollagenen, Laminin, Elastin, Fibronektin, Proteoglykanen und Glykosaminoglykanen. Proteine der EZM können eine RGD-Sequenz, bestehend aus den drei Aminosäuren Arginin, Glycin und Asparaginsäure, enthalten und so mit Integrinen und anderen Zelloberflächenrezeptoren interagieren. Auf diese Weise kann in der Zelle eine Signalkaskade zur Regulation von Adhäsion, Wachstum und Migration aktiviert werden (53).
Immunhistochemische Studien zeigten, dass die Kollagene I, III und VI während des gesamten Zyklus und in der Schwangerschaft von endometrialen Stromazellen exprimiert werden (54). Während der Dezidualisierung erhöhen endometriale Stromazellen jedoch die Expression von Hyaluronsäure, Kollagen V, Thrombospondin-1 und Endostatin. Weiter werden Laminin, Kollagen IV, Fibronektin, Fibrilin-1 und Heparansulfat von den dezidualisierenden Zellen produziert. Letztendlich ähnelt die deziduale EZM, die jede einzelne Stromazelle umgibt, aufgrund des hohen Anteils an Kollagen IV, Heparansulfat und Laminin einer Basalmembran, die normalerweise Epithelzellen von Stromazellen abgrenzt. Die durch die Dezidualisierung veränderte Zusammensetzung der EZM im Endometrium bildet schließlich ein verdichtetes Netzwerk, welches eine physikalische Barriere für trophoblastäre Zellen darstellt (3, 37, 54-57).
1.2.5. Dezidualisierung endometrialer Stromazellen in vitro
Die Dezidualisierung von humanen endometrialen Stromazellen in vitro kann neben der charakteristischen morphologischen Veränderung des Phänotyps anhand der erhöhten Transkription, Translation und Sekretion der Dezidualisierungsmarker (d)PRL und IGFBP-1 bestätigt werden. Für die in vitro Dezidualisierung werden die isolierten Zellkulturen, nach einem optionalen und Behandlungs-verkürzenden Estrogen-Priming, über mehrere Tage mit Estrogen und Progesteron behandelt (3, 58).
Alternativ kann die in vitro Dezidualisierung durch Zugabe von cAMP bzw. einem stabilen cAMP-Analogon schneller und effizienter induziert werden (14, 17, 42). Die alleinige Zugabe von cAMP führt zunächst zu einem schnellen Anstieg der Transkription und der Sekretion von PRL und IGFBP-1 innerhalb von 2 bis 4 Tagen. Die Dezidualisierung kann jedoch durch
1. Einleitung
9 cAMP nicht über längere Zeit aufrecht erhalten werden und die Sekretion von PRL und IGFBP-1 reduziert sich schließlich nach ca. 6 Tagen (23, 59).
Ein verbreitetes Protokoll zur anhaltenden in vitro Dezidualisierung ist die Kombination von cAMP mit einem Progestin. Die Verwendung von Progesteron in der Zellkultur ist allerdings mit einigen Komplikationen verbunden, da es von der Zelle metabolisiert wird. Zum Beispiel wurde in der Brustkrebszelllinie T47D für Progesteron eine Halbwertszeit von 2 bis 4 Stunden unter physiologischen Konzentrationen sowie eine Halbwertszeit von 18 Stunden unter pharmazeutischen Konzentrationen nachgewiesen (60). Zusätzlich zu dieser Instabilität von Progesteron wurde beobachtet, dass primäre endometriale Stromazellen PR nur über wenige Passagen exprimieren und die Expression dieses Rezeptors bei Zelllinien zum Teil nicht nachweisbar war (59, 61-63). Als Alternative zu Progesteron wird verbreitet das stabile Gestagen Medroxyprogesteronazetat (MPA) verwendet, das jedoch neben dem PR auch andere Steroidhormonrezeptoren aktivieren kann (40, 58, 59, 64).
1.3. Die Implantation und Invasion der Blastozyste
1.3.1. Das Implantationsfenster
Nach der Ovulation wird die Oozyte von den Fimbrien des Tubentrichters aufgenommen, ehe sie unterstützt durch die Flimmerbewegung der Zilien des Tubenepithels und Kontraktion der Tubenmuskulatur durch die Tube transportiert wird. Nach der hier stattfindenden Fertilisation (24 bis 48 Stunden nach der Ovulation
)
wandert die Zygote bzw. der Konzeptus weiter durch die Tube und vollzieht hierbei die ersten Zellteilungen (7, 65). Bis zum 8-Zell-Stadium sind die Blastomeren des Konzeptus totipotent, ihre Anwesenheit ist jedoch durch Detektion der hCG mRNA schon nachweisbar (66). Innerhalb von drei Tagen nach der Fertilisation erreicht der Konzeptus das 8- bis 16-zellige Morula-Stadium. Die Morula wandert in das uterine Lumen und entwickelt sich zur nicht adhärenten, freien Blastozyste, bestehend aus 32 bis 64 Zellen, weiter. Schließlich separiert sich der Embryoblast vom Trophoblast (extraembryonische Struktur), so dass die Blastozyste aus einer inneren embryonalen Zellmasse (32 bis 56 Zellen), einer flüssigkeitsgefüllten Blastozystenhöhle und dem peripheren Trophoektoderm bzw. Trophoblast besteht. Die Blastozyste verliert die Zonapellucida bis zum 6. Tag nach der Fertilisation, und das Trophoektoderm, welches der
Anheftungsseite der Blastozyste an das luminale Epithel anliegt, differenziert sich weiter in einen Zytotrophoblast und in das Synzytium bzw. Synzytiotrophoblast. Das vielkernige, äußere Synzytium wird durch Zellfusion der darunter liegenden einkernigen Zytotrophoblastzellen gebildet und kann als initialer Prozess der Plazenta-Entwicklung angesehen werden (7, 56, 65, 67, 68).
1. Einleitung
10 Durch die steigende Progesteron-Konzentration in der sekretorischen Phase bildet das luminale Epithel des Endometriums Pinopodien aus, an denen der erste physikalische Kontakt (Apposition) des Synzytiotrophoblasten der Blastozyste, sechs bis sieben Tage nach der Fertilisation, über dessen apikale Mikrovilli erfolgt. Dieser Kontakt leitet die Implantation der Blastozyste ein. Der zunächst schwache instabile Kontakt entwickelt sich zu einer stabilen Adhäsion, gefolgt von der Auflösung der begrenzenden Basalmembran des luminalen Epithels und dem Eindringen (Invasion) der Synzytiotrophoblastzellen in das endometriale Stroma. Die Blastozyste ist 10 Tage nach der Fertilisation vollständig von endometrialen Stromazellen umgeben und das uterine Epithel wieder hergestellt (56, 67, 69, 70).
Der Erfolg einer Implantation hängt von der Synchronisierung des endometrialen Zyklus mit der Entwicklung der Blastozyste ab (4). Die rezeptive Phase des Endometriums ist nur zwischen dem 20. und 24. Tag des Zyklus gegeben und wird daher als Implantationsfenster bezeichnet (3). Mit fortschreitender Dezidualisierung der endometrialen Stromazellen der funktionellen Schicht schließt sich das Implantationsfenster wieder (15).
1.3.2. Die Invasion der Blastozyste in das maternale Endometrium
Nachdem die Blastozyste in das maternale Endometrium eingedrungen ist und in Kontakt mit den dezidualisierenden Stromazellen tritt, beginnen die Zytotrophoblastzellen mit einer massiven Proliferation und führen durch weitere Zellfusionen zu einer Ausbreitung des Synzytiotrophoblasten sowie Bildung von Hohlräumen bzw. Lakunen innerhalb der Synzytium-Struktur. In den Lakunen bilden sich durch weitere Proliferation der Zytotrophoblastzellen primäre Chorionzotten (Primärvilli) aus. Diese fingerartigen Strukturen können entweder frei schwimmend vorliegen oder im endometrialen Stroma verankert sein. In der 4.-5. SSW wandern Mesenchymzellen aus dem, zwischen der embryonalen Keimscheibe und dem Trophoektoderm liegenden, extraembryonalen Mesoderm in die Primärvilli ein. Die Primärvilli differenzieren sich somit weiter zu Sekundärvilli mit bindegewebsartigem Stroma. Sekundärvilli sind schließlich nur noch von einem zweischichtigen villösen Trophoblast umgeben, welcher aus dem Synzytium und den darunter liegenden Zytotrophoblastzellen besteht. Durch die anhaltende Proliferation von Zytotrophoblast-Stammzellen bilden sich innerhalb der verankerten Sekundärvilli an der Kontaktzone mit den dezidualisierenden Stromazellen Trophoblast-Zellsäulen aus, an deren Spitze sich eine weitere nicht proliferative Trophoblast-Unterpopulation differenziert. Diese werden als extravillöse Trophoblastzellen (EVTs) bezeichnet und verlassen die Sekundärvilli (Abb. 3-A). Der Beginn einer Neubildung von Blutgefäßen ab der 5. bis 6. SSW beschreibt die Weiterentwicklung der Sekundärvilli zu Tertiärvilli (7, 56, 67, 69).
1. Einleitung
11 Während der Synzytiotrophoblast biologisch aktives hCG produziert, wurde bei EVTs die Produktion von hyperglykosyliertem hCG nachgewiesen, welches ihre Invasivität moduliert (71, 72). Die interstitiellen EVTs wandern invasiv in das maternale Endometrium ein und dringen dabei bis zum inneren Drittel des Myometriums vor. Im Myometrium verlieren die EVTs ihre Invasivität und verschmelzen zu vielkernigen plazentalen Riesenzellen (69, 73).
Abb. 3: Schematische Darstellung der Invasion der humanen extravillösen Trophoblastzellen aus den Villi in das Endometrium.
Während des trophoblastären (blau) -maternalen (rot) Dialogs der ersten sechs SSW (A) bildet die implantierte Blastozyste in der Dezidua (decidua) verankerte Chorionzotten (anchoring villus), an deren
Kontaktseite durch Proliferation trophoblastäre Zellsäulen (cell column) entstehen. Die
Zytotrophoblastzellen der Zellsäule differenzieren sich zu nicht proliferativen, aber invasiven EVTs (interstitial extravillous trophoblast) aus, welche bis zur 20. SSW (B) das deziduale Gewebe bis zum Erreichen des Myometriums oder eines mütterlichen Gefäßes (uteroplacental artery) invadieren. Die EVTs innerhalb der Gefäße (endovascular trophoblast) führen zunächst zu einer Verstopfung und somit zu einer Hypoxie. Schließlich weiten sich die Gefäße und durch Austausch der Endothelzellen und Muskelzellen durch EVTs kommt es zum Verlust der maternalen Kontrolle. Durch diesen Dialog bildet sich im weiteren Schwangerschaftsverlauf die Plazenta, deren Basalplatte (basal plate) bei der Geburt von dem, im Endometrium verbleibenden, plazentalen Bett (placental bed) abgelöst wird (69).
Währenddessen durchwandern die endovaskulären EVTs ebenfalls das maternale Endometrium, um schließlich in die maternalen Spiralarterien und Venen einzudringen. Auch die EVT-Besiedlung der maternalen Gefäße von Seiten des Lumens wird diskutiert. Bis zur 10. bis 12. SSW verstopfen die endovaskulären EVTs die Spiralarterien und führen durch diese Unterbrechung des maternalen Blutflusses eine Hypoxie herbei. Schließlich weiten sich die besiedelten Gefäße, so dass arterielles Blut in den intervillösen Raum, welcher aus der Verschmelzung der Lakunen entstanden ist, fließen kann. Die Ernährung des Konzeptus erfolgt bis zur Weitung der Gefäße histiotroph durch maternale glanduläre Sekretprodukte, die über Diffusion aufgenommen werden. Der Kontakt der Chorionzotten mit maternalem Blut stellt die Versorgung ab der 10. SSW auf ein hämotrophes System um.
1. Einleitung
12 Ab der 10. bis zur 18. SSW ersetzen die endovaskulären EVTs progressiv das maternale Endothel innerhalb der Gefäßwand. Während dieses trophoblastären Umbaus der Wandstruktur wird die umgebende Muskelwand (Tunica media) vollständig aufgelöst, was einen Verlust der vaskulären Elastizität und Kontraktilität zur Folge hat (Abb. 3-B). Diese Erweiterung des Durchmessers in Kombination mit dem maternalen Kontrollverlust garantiert eine quantitative Blutversorgung, angepasst an den steigenden Verbrauch des sich entwickelnden Konzeptus (7, 56, 69, 74, 75).
Die schwankende Sauerstoffkonzentration ist ein wichtiger Regulationsmechanismus für die Trophoblast-Proliferation und -Differenzierung in den invasiven Phänotyp. Ein hoher Sauerstoffpartialdruck fördert die Invasion, während ein niedriger die Invasion inhibiert und die trophoblastäre Proliferation fördert. Dies führt zu einem schnellen Wachstum der plazentalen Zellen im Vergleich zur fetalen Zellmasse, erklärt jedoch nicht die hohe Invasivität der EVTs während des ersten Trimesters (7, 76).
Im Verlauf der Schwangerschaft bilden die maternalen Deziduazellen mit den trophoblastären Zellen einen Verbund, aus dem die Plazenta hervorgeht. Die maternale Komponte der Plazenta wird unterteilt in eine Basalplatte (basal plate), welche nach der Geburt mit der restlichen Plazenta abgegeben wird, und das im Endometrium verbleibende plazentale Bett (placental bed). Der nicht maternale Teil der Plazenta bildet sich aus den Chorionzotten, welche in engem Kontakt mit den Deziduazellen stehen (65, 69).
Schwangerschaftskomplikationen, welche erst verhältnismäßig spät in Erscheinung treten, haben ihre Ursache wahrscheinlich in einer fehlerhaften Interaktion zwischen trophoblastären und maternalen Zellpopulationen innerhalb des ersten Trimesters. Eine zu tiefe Invasion der EVTs in das Myometrium führt zu einer abnorm starken Anhaftung der späteren Plazenta an das Myometrium (Placenta accreta) oder zu deren Verwachsung (Placenta increta) bzw. eine Invasion über das Myometrium hinaus bis zur uterinen Serosa und anliegenden Organen (Placenta percreta) (67). Eine unzureichende Differenzierung des Zytotrophoblasten, gefolgt von einer unzureichenden Invasion der EVT und Umstrukturierung der Spiralarterien wird mit intrauteriner Wachstumsretardierung und Präeklampsie in Zusammenhang gebracht (56, 67, 69).
1.4. Faktoren der Trophoblast-Endometrium Interaktion
Für die erfolgreiche Implantation und Invasion der trophoblastären Zellen in das humane Endometrium und die Ausbildung einer funktionellen Plazenta muss die Adhäsion, die Migration, die Proliferation und die Differenzierung der Trophoblastzellen unter einer modulierten Immuntoleranz des maternalen Gewebes sowie eine Umstrukturierung des
1. Einleitung
13 vaskulären Systems koordiniert werden. An dieser Koordination sind neben den Trophoblast-Subpopulationen auch maternale Stromazellen, luminale und glanduläre Epithelzellen, vaskuläre Endothelzellen, Makrophagen und Leukozyten (speziell uNKs) beteiligt. All diese Zellen exprimieren für den trophoblastär-maternalen Dialog eine Vielzahl von verschiedenen Wachstumsfaktoren, Hormonen, Zytokinen, Chemokinen, Rezeptoren, Integrinen, Proteinasen und Proteinase-Inhibitoren. Die Expression kann lokal und zeitlich stark variieren und einzelne Faktoren können sowohl autokrin, parakrin als auch juxtakrin wirken (67).
Die humane Implantation und Plazentation sind somit sehr komplexe Prozesse, die noch immer unzureichend verstanden sind. Aufgrund ethischer Restriktion kommen die meisten Kenntnisse aus Tiermodellen und in vitro Zellkulturen. Tiermodelle weisen jedoch grundlegende Unterschiede zur menschlichen Implantation auf, so dass hier gewonnene Erkenntnisse nur eingeschränkt auf das humane System übertragen werden können (77). Eine Dezidualisierung kommt nur bei einigen Arten mit hämochorialer Plazentation vor, bei denen die implantierende Blastozyste das luminale Epithel durchbricht und das maternale Gewebe invadiert. Während Menschen, einige Altweltaffen, Elefantenspitzmäuse und einige Fledermäuse eine vom Konzeptus unabhängige Dezidualisierung durchführen, erfolgt bei anderen Säugetieren, wie der Maus oder Ratte, nur eine Dezidualisierung in Anwesenheit einer implantierenden Blastozyste. Hier muss zuvor das Endometrium durch Progesteron sensibilisiert werden, ehe es mittels Estrogen rezeptiv wird (3, 15). Auch ist die murine Trophoblast-Invasion im Vergleich zur humanen nur sehr oberflächlich (69, 78). Während beim Menschen Chromosomabnormalitäten häufig in der Blastozyste zu finden sind, sind diese bei der Maus selten (79).
1.4.1. Adhäsionsproteine und Proteinasen
Die Implantation im Menschen ist ein hoch invasiver Vorgang. Nachdem die Blastozyste das luminale Epithel durchbrochen hat, dringt sie invasiv in die funktionelle Schicht des Endometriums ein. Für die Durchwanderung der Dezidua und das Erreichen der Vaskulatur und des Myometriums müssen die EVTs das, von den dezidualisierten endometrialen Stromazellen produzierte, Protein-Netzwerk der EZM durchdringen. Hierbei verhalten sich die trophoblastären Zellen ähnlich wie maligne Tumorzellen, indem sie neben dem Verlust der Kontaktinhibition und einer induzierten Immuntoleranz, eine Sekretion proteolytisch aktiver Enzyme aufweisen (80).
Die extrazellulären Matrix-Metalloproteinasen (MMP) sind Endopeptidasen, welche die Komponenten der Basalmembran bzw. der interstitiellen Matrix degenerieren. MMPs können auf komplexe Weise die Invasion von Zellen durch Modellierung der Zell-Matrix-Interaktion, bzw. Zell-Zell-Interaktion, durch Freisetzung, Aktivierung/Inaktivierung autokriner und
1. Einleitung
14 parakriner Signalmoleküle und Rezeptoren steuern. Somit können MMPs die Invasion von Trophoblastzellen in das endometriale Stroma nicht nur durch Degeneration der EZM, sondern auch über Wachstumsfaktoren (z.B. Freisetzung von IGF), Zytokine und angiogenetische Faktoren beeinflussen. Der implantierende Trophoblast sezerniert vor allem MMP-2 und MMP-9, deren Substrat Kollagen IV ist. MMPs werden durch tissue inhibitors of
matrix metalloproteinases (TIMP) parakrin oder autokrin inhibiert. Die Freisetzung und
Aktivität von MMPs und TIMPs wird wiederum durch Wachstumsfaktoren und Zytokine reguliert (37). Auch endometriale Stromazellen exprimieren MMPs und TIMPs und modulieren somit ein Gleichgewicht der Aktivität dieser Enzyme (37, 41, 81-83).
Eine weitere parakrine Regulation zwischen trophoblastären und maternalen Zellen wird wahrscheinlich durch das Trophoblast-Produkt hCG bewirkt. Die Anwesenheit dieses Hormons reduziert in vitro die deziduale Expression von IGFBP-1 und PRL (11, 84). Während hCG in Zytotrophoblastzellen eine Erhöhung von MMP-2 und MMP-9 erzielt, senkt es die Expression von TIMPs in endometrialen Stromazellen (85).
EVTs exprimieren zusätzlich den Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (uPA) und Plasminogen. Da Trophoblastzellen nicht den Rezeptor uPAR exprimieren, kommt es wahrscheinlich zu einer Wechselwirkung von trophoblastärem uPA mit dem maternalen uPAR und somit zu einer erhöhten Aktivierung von Plasmin aus Plasminogen. Plasmin ist eine Serin-Proteinase, die Fibrin und Fibrinogen spaltet. Deziduale Stromazellen wiederum exprimieren den Inhibitor PAI-1, welcher die proteolytische Aktivität des Plasmins antagonisiert (37, 83). Die Dezidua und dezidualisierende Zellen produzieren weitere Proteinasen, wie die Serin-Proteinase HtrA3, welche ebenfalls die EVT-Invasion reduzieren (86).
Für den trophoblastär-maternalen Dialog sind Integrine besonders relevante Oberflächenrezeptoren. Integrine sind heterodimere Glykoproteine, die sich aus zwei Untereinheiten (-α und -β) zusammensetzen. Je nach Kombination der verschiedenen Untereinheiten binden Integrine an bestimmte Proteine und können so unterschiedliche Signaltransduktionen induzieren. Sie können beispielsweise mit ihrer extrazellulären Domäne an Glykoproteine der EZM oder parakrin an zelluläre Adhäsionsproteine und Oberflächenrezeptoren, wie epidermal growth factor receptor (EGFR), binden. Sie steuern die Aktivierung der MAPK-Signaltransduktion, Proteinkinase C (PKC) und Calmodulin, oder die Liganden-unabhängige Aktivierung der Tyrosinkinasen FAK (focal adhesion kinase) und Src (sarcoma kinase) (37, 87, 88).
Während endometriale Epithelzellen die Integrine α2β1, α3β1 und α6β4 (Rezeptoren für Kollagen und Laminin) exprimieren, wird in endometrialen Stromazellen Integrin-α5β1 (Rezeptor für Fibronektin und Vitronektin) permanent exprimiert (89). Die endometriale
1. Einleitung
15 Integrin Expression wird zum Teil durch Hormone reguliert, so dass eine zyklusabhängige Variation entsteht. Für die Implantation scheinen vor allem die Integrine αvβ3 und α4β1 (Rezeptoren für Fibronektin und Vitronektin) relevant zu sein (37, 89). In vitro Studien zeigten, dass 8-Bromoadenosin-3’,5’-zyklisches Monophosphat (8-Br-cAMP) die Expression von Integrin-αvβ3, aber nicht die der Untereinheiten Integrin-α1, -α4, -α5, -α6 und -β1 in humanen endometrialen Stromazellen erhöht (90).
Integrine werden auch vom implantierenden Trophoektoderm exprimiert. Während der Differenzierung vom nicht invasiven Zytotrophoblast bis zum invasiven EVT verändert sich das Muster der Integrin-Expression. Während Zytotrophoblastzellen Integrin-α6β4 und Integrin-α5β1 exprimieren, so ist Integrin-α6β4 in EVTs herunterreguliert. EVTs produzieren vor allem das Integrin-α5β1 und das Integrin-α1β1, die eine effiziente Wechselwirkung mit Kollagen IV, Laminin und Fibronektin ermöglichen (37, 87, 91). Die Differenzierung vom Zytotrophoblast zum EVT führt auch zu einer Reduktion des Zelladhäsionsmoleküls und Metastasensuppressors E-Cadherin (92). In dezidualisierten endometrialen Stromazellen an der trophoblastär-maternalen Kontaktstelle wird hingegen die Expression des Tetraspanins und Metastasensuppressors CD82 erhöht. CD82 wird nicht von trophoblastären, invadierenden Zellen exprimiert (93).
1.4.2. Zytokine
Zytokine und ihre Rezeptoren sind im humanen Endometrium zahlreich vertreten. Sie sind am Implantationsprozess und Modulation der Immunantwort beteiligt (41). Gezeigt wurde, dass von Leukozyten produzierte Zytokine Einfluss auf die Invasion von EVTs haben. Im trophoblastär-maternalen Dialog werden Zytokine allerdings auch von Trophoblastzellen und maternalen Zellen, welche nicht zu den Immunzellen zählen, produziert (56, 94).
1.4.2.1. Chemokine
Chemokine gehören zu den Zytokinen und werden in vier strukturelle Subtypen, basierend auf ihrem N-terminalen Cystein-Motif CC, C, CXC oder CXC3C, eingeteilt. Es sind wichtige Modulatoren des Influx von Makrophagen, Leukozyten und uNKs in das Endometrium (41, 70). Ähnlich wie Leukozyten können jedoch auch Trophoblastzellen auf Chemokine mit einer Chemotaxis antworten (70).
Im Endometrium treten eine Reihe von Chemokinen auf, die sowohl durch Immunzellen wie auch endometriale Stromazellen beigesteuert werden. Vor allem die Expression von CXCL1 (GRO1 oncogene, GROα) wird in humanen endometrialen Stromazellen in der sekretorischen Phase im Zuge der Dezidualisierung erhöht (95). Für die Chemokine CX3CL1, CCL2, CCL14, CCL4, CXCL8, CXCL10, CXCL16 und CCL21 konnte eine
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16 Stimulation der EVT-Migration nachgewiesen werden, so dass sie hierüber die Implantation beeinflussen könnten (41, 56, 70, 94, 96).
Chemokine werden jedoch auch von Trophoblastzellen selbst sezerniert. Die Sekretion von CXCL1, CXCL10 und CXCL8 wurde bei EVTs nachgewiesen (97). CXCL8 kann in endometrialen Stromazellen eine Proliferation induzieren (98), zudem erhöht CXCL8 die Aktivität von MMP-2 und MMP-9 in endometrialen Stromazellen und steigert ihre Invasivität (99). Das Chemokin CXCL12 wird von der Blastozyste und Trophoblastzellen sezerniert und fördert die Proliferation und Interaktion von Trophoblast und Dezidua (70, 100). Sein Rezeptor CXCR4 wird in der mittleren sekretorischen Phase im humanen Endometrium von Epithelzellen und Stromazellen sowie in der Dezidua des ersten Trimesters exprimiert (101-103). Eine Erhöhung der endometrialen CXCR4-Expression konnte durch Stimulation mit Trophoblast-Überstandsmedium oder hCG erzielt werden (101-103).
1.4.2.2. Die Interleukin-6 Familie
Der Leukämie inhibierende Faktor (LIF) und IL-11 gehören zu den Zytokinen, für die im Mausmodell eine kritische Funktion für die Implantation nachgewiesen wurde. Weibliche LIF
knockout Mäuse sind aufgrund einer fehlenden LIF-Expression in den luminalen
Epithelzellen und mangelhaften frühen Implantation der Blastozyste infertil (104). Dagegen sind weibliche Mäuse mit einem knockout für das IL-11 Rezeptor-Gen IL-11Rα aufgrund einer gestörten Invasion der implantierenden Blastozyste in das stromale Gewebe infertil (105).
LIF und IL-11 gehören der Interleukin-6 Familie an und sind Glykoprotein-130 Zytokine. Die Bindung von LIF oder IL-11 an den jeweiligen spezifischen Rezeptor (LIF-Rα bzw. IL-11Rα) führt zur Dimerisierung mit dem Signalprotein Glykoprotein-130 und Aktivierung des Januskinase (JAK)/signal transducers and activators of transcription (STAT), des extrazellulären Signal regulierten Kinase 1/2 (ERK1/2) oder des Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)/Proteinkinase B (Akt)-Signalwegs (96, 106). Auch wenn die Liganden-gebundenen Rezeptoren mit dem gleichen Signalprotein interagieren, so ist die induzierte Transduktion nicht identisch (107).
Im humanen Endometrium wurde die Expression von LIF und LIF-Rα in luminalen und glandulären Epithelzellen während des Implantationsfensters, zeitgleich mit dem Erscheinen der luminalen epithelialen Pinopodien, nachgewiesen. Auch endometriale Stromazellen exprimieren LIF über den Zyklus. Sowohl die mRNA von LIF als auch die seines Rezeptors werden in der Dezidua und in Chorionzotten des ersten Trimesters exprimiert, wohingegen LIF-Rα mRNA und Protein in villösen und invasiven Trophoblastzellen nachgewiesen worden ist(41, 96, 106).
1. Einleitung
17 Einer der wichtigsten direkten oder indirekten Regulatoren für die Expression von LIF und IL-11 in Primaten ist wahrscheinlich Progesteron (96, 106). Shuya et al. zeigten, dass in vitro Dezidualisierung endometrialer Stromazellen zu einer Erhöhung von LIF-Rα führt, so dass die LIF-Responsivität erhöht wird. LIF selber führt in in vitro dezidualisierten endometrialen Stromazellen zu einer Erhöhung von IL-15 und IL-6 (108). Die maternale Produktion von LIF wird weiter durch verschiedene Signalmoleküle reguliert (106). Ein Regulationsmechanismus erfolgt über Prokineticin-1 und seinen Rezeptor, welche beide in der mittleren sekretorischen Phase in Epithelzellen exprimiert werden. Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung führen in endometrialen Epithelzellen und in der Ersttrimester-Dezidua durch Aktivierung der Src/EGFR/MAPK-Signaltransduktion zu einer Induktion der LIF-Expression. Reguliert wird diese, durch Prokineticin-1 modulierte LIF Produktion, wiederum durch hCG (109).
Die Expression von IL-11 und IL-11Rα wurde im humanen Endometrium in stromalen sowie in luminalen und glandulären epithelialen Zellen nachgewiesen. IL-11 wird in der mittleren bis späten sekretorischen Phase vermehrt in luminalen und glandulären Epithelzellen exprimiert, während IL-11Rα keiner zyklischen Regulation unterliegt. Ein Maximum wird allerdings in dezidualisierten Zellen und in Chorionzotten des ersten Trimesters detektiert (107, 110-112). Eine Erhöhung der stromalen IL-11 mRNA-Expression und Sekretion erfolgt bei in vitro Dezidualisierung und kann durch ein cAMP-Analogon oder lokale Faktoren wie Relaxin und PGE2 ausgelöst werden (42, 113). Der Fortschritt der Dezidualisierung steht in einer
autokrinen Rückkopplung ebenfalls unter Einfluss von IL-11 (111, 113).
Die Produktion von IL-11 und seinem Rezeptor wurde in Synzytiotrophoblastzellen, Zytotrophoblastzellen und invasiven EVTs nachgewiesen (110-112, 114). In EVTs konnte gezeigt werden, dass IL-11 autokrin und parakrin die Migration über Aktivierung der Jun N-terminalen Kinase (JNK)/STAT-Signaltransduktion moduliert (114, 115).
1.4.2.3. Die pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β, TNF-α und MIF
IL-1β wird im humanen Endometrium in Stromazellen und Endothelzellen exprimiert. Das maximale Expressionslevel wird hierbei in der späten sekretorischen Phase erreicht. Nachgewiesen wurde IL-1β auch im ersten Trimester in villösen Zytotrophoblastzellen, im Synzytiotrophoblasten, in der Dezidua und in Makrophagen. Der Rezeptor wird in Stromazellen und in glandulären Epithelzellen exprimiert. Während der in vitro Dezidualisierung wurde eine erhöhte Expression des Rezeptors beobachtet, allerdings scheint IL-1β die Dezidualisierungsreaktion selbst zu inhibieren (41, 116). Eine zu hohe Konzentration von sezerniertem IL-1β im Endometrium korreliert mit einem negativen Schwangerschaftsverlauf (117). Teklenburg et al. beobachteten bei Anwesenheit einer defekten Blastozyste eine Reduktion von IL-1β in dezidualisierten endometrialen
1. Einleitung
18 Stromazellen (12). IL-1β stimuliert die MMP-9-Expression in endometrialen Stromazellen (118), beeinflusst die MMP-abhängige regulierte Invasion von Trophoblastzellen und fördert deren hCG-Sekretion (41). Weiter wurde in humanen endometrialen Stromazellen in Gegenwart von IL-1β in vitro eine erhöhte Produktion von PAI-1 und uPAR beobachtet (119). Auch stimuliert IL-1β in humanen endometrialen Stromazellen über Aktivierung der p38-Signaltransduktion die Produktion von Zytokinen wie IL-6, CXCL8, CCL2 und die Expression von Cyclooxygenase-2 mRNA; die Dezidualisierung schwächt diese Signalkaskade jedoch ab (120). Chemokine wie beispielsweise CCL2 können wiederum die Expression von IL-1β in dezidualisierten Stromazellen induzieren (70). Das Zytokin IL-11 stimuliert die Freisetzung von latentem, nicht aktivem IL-1β, welches durch die Aktivität von extrazellulären Proteinasen, wie MMPs, aktiviert wird (41).
Der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) wird von Makrophagen, Endothelzellen und Stromazellen sezerniert und reguliert Entzündungsprozesse sowie die Aktivierung von MMP-2 und MMP-9. Die Freisetzung von TNF-α wird von IL-1β stimuliert, mit dem TNF-α Ähnlichkeiten in der Wirkung auf Apoptose, Proliferation und Differenzierung aufweist. Die Relation zwischen den beiden Faktoren TNF-α und IL-1β scheint ein Indiz für die Rezeptivität des Endometriums zu sein (117).
Der macrophage migration inhibitory factor (MIF) ist ein Zytokin, dessen Expression in humanen glandulären Epithelzellen und Stromazellen über den Zyklus sowie in der Dezidua des ersten Trimesters und in Zytotrophoblastzellen nachgewiesen wurde (121-123). MIF spielt im Endometrium eine wichtige Rolle in der Modulation der Immunantwort und kann seine Expression in uNKs autokrin und parakrin induzieren (124). In endometrialen Stromazellen wird die MIF-Expression und Sekretion in vitro durch hCG (125), IL-1β (126) und TNF-α erhöht (127). MIF ist an einer Vielzahl von Prozessen, wie Proliferation, Angiogenese oder Stimulation von MMPs in verschiedenen Zelltypen beteiligt (128). Weiter induziert MIF die Proliferation und Invasivität von Tumorzellen (129). In vitro stimuliert MIF eine erhöhte Expression von Integrin-αvβ3 und VEGF in einer humanen Epithelzelllinie (130). MIF ist ein Ligand der Rezeptoren clusters of differentiation (CD) 74 und CD44 und kann hierüber die ERK1/2- und p38-Signaltransduktion aktivieren (128). In ektopen endometrialen Stromazellen von Endometriose-Patientinnen konnte über diese Signalkaskade ein Anstieg der angiogenetischen Faktoren VEGF, CXCL8 und CCL2 beobachtet werden (131). Weitere potentielle Rezeptoren für MIF sind die Chemokin-Rezeptoren CXCR4 und CXCR7 (132).
1. Einleitung
19 1.4.3. Wachstumsfaktoren
1.4.3.1. Das IGF-System
Das IGF-System ist im graviden Uterus vor allem bedeutend für das fetale und plazentale Wachstum. Während IGF-1 und IGF-2 Regulatoren für eine ausreichend entwickelte Plazenta und ein hohes Geburtsgewicht sind, so ist IGFBP-1 hierfür ein Gegenspieler, welcher die Aktivität der IGFs durch Bindung inhibieren kann (133).
IGF-2 wird sowohl von der humanen Dezidua wie auch villösen und invasiven Trophoblastzellen exprimiert. Während das Mitogen IGF-1 nicht migrations-fördernd wirkt, erhöht IGF-2 autokrin, oder in Kombination mit maternalem IGFBP-1 auch parakrin, die Migration von EVT-Zellen (134, 135).
IGFBP-1 ist eines der Hauptsekretionsprodukte der dezidualisierten endometrialen Stromazellen und ist an der Regulation der Trophoblast-Migration beteiligt (37, 116). Die Invasion der Trophoblastzellen kann durch Bindung von maternalem IGFBP-1 mit trophoblastärem Integrin-α5β1 reguliert werden (38, 39). Eine weitere Regulation erfolgt durch maternale Proteinasen, wie MMP-3 und MMP-9, die IGFBP-1 proteolytisch prozessieren. Das resultierende Produkt verliert aufgrund einer Konformationsänderung seine Bindungsfähigkeit für IGF-1. Deziduazellen produzieren jedoch auch α2-Makroglobulin, welches IGFBP-1 bindet und vor einer Proteolyse schützt (136).
1.4.3.2. Die EGF-Familie (EGF und HB-EGF)
EGF (epidermal growth factor) und HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor) sind Mitglieder der Familie der epidermalen Wachstumsfaktoren. Proteine dieser Familie binden mit unterschiedlicher Affinität an die vier eng verwandten Rezeptoren EGFR, human
epidermal growth factor receptor (HER) 2, HER3 und HER4, die zu den Tyrosinkinasen
gehören und untereinander dimerisieren. Während EGF an EGFR bindet, ist HB-EGF ein direkter Ligand von EGFR und HER4. Eine Bindung eines Liganden an seinen Rezeptor kann zu einer Transaktivierung weiterer Rezeptoren dieser Familie führen. Es folgt eine Autophosphorylierung des Rezeptors und die Liganden-spezifische Aktivierung verschiedener Signalwege, wie z.B. des PI3K/Akt-Signalweges (137). EGFR und HER4 wurden auf mRNA- und Proteinebene im humanen Endometrium nachgewiesen (138, 139). EGFR wird während der sekretorischen Phase vor allem von Stromazellen exprimiert, während HER4 in der mittleren bis späten sekretorischen Phase von glandulären und luminalen Epithelzellen exprimiert wird (138, 140, 141).
Im humanen Uterus wurde die EGF-Expression in Epithel- und Stromazellen über den Zyklus sowie in Deziduazellen und in Trophoblastzellen nachgewiesen (37, 142). Dabei scheint die
