Zartheitsparameter

1. Myofibrill¨arer Fragmentationsindex

Der Myofibrill¨are Fragmentationsindex (MFI) wurde als photometrische Tr¨ubungsmessung mit einer modifizierten Methode nach Møller et al.

(1973),Olson et al. (1976) undK¨uhne (1990) ermittelt. Es wurden Mus-kelproben von 13 Tieren (Tier Nr. 5 und 8 – 19) an den 6 Untersuchungs-zeitpunkten 2. – 27. Tag p.m. untersucht, die Zahl untersuchter Proben betrug also insgesamt 78.

Die Proben wurden folgendermaßen verarbeitet:

• Einwaage von 2 g fett– und bindegewebsfreier, auf Erbsengr¨oße zer-kleinerter Rindermuskulatur in ein Zentrifugenglas.

• Auff¨ullen mit 20 ml Puffer, Zusammensetzung nach Møller et al.

(1973) und Olson (1976):

– 100 mM KCl – 20 mM K₂HPO₄ – 1 mM EDTA

– auf pH = 7,0 eingestellt.

• 30 Sekunden mit einem Ultra Turrax auf Stufe 5,5 zerkleinern.

• Zentrifugieren bei 3000 U/min (RZB = 1000 * g), 15 Minuten lang (Zentrifuge von Heraeus Christ, Cryofuge 20 - 3).

• Uberstand dekantieren, mit 10 ml Puffer auff¨¨ ullen und den Bodensatz mit Hilfe eines kleinen Spatels vollst¨andig resuspendieren.

• Filtern durch ein metallenes Sieb mit ca. 0,5 mm Maschenweite in ein weiteres Zentrifugenglas, Aussp¨ulen des ersten Zentrifugenglases und des Siebes mit 10 ml Puffer.

• Dieser Vorgang (Sedimentation, Dekantieren des ¨Uberstandes, Resus-pension und Filtration) wird noch dreimal wiederholt.

• Nach dem letzten Zentrifugieren wird nur noch einmal resuspendiert (die Filtration findet nicht mehr statt).

• An dieser Suspension wird die Biuret–Eiweiß–Bestimmung durchge-f¨uhrt.

– 0,85 ml der Eiweiß–Suspension und 0,15 ml einer 3molaren Tri-chloressigs¨aure in ein Zentrifugenglas pipettieren.

– Zentrifugation bei 6000 U/min, 10 min lang.

– Uberstand verwerfen, den Niederschlag in 5 ml Biuret–L¨¨ osung l¨osen.

– Nach 30 min und vollst¨andigem L¨osen des Niederschlags mit Aqua dest. auf 10 ml auff¨ullen.

– Die Extinktion dieser L¨osung wird im Photometer (Spectralpho-tometer Hitachi 100-80) bei 546 nm gemessen (Leerwert: 5 ml Biuret-L¨osung + 5 ml Aqua dest.). Der Proteingehalt der L¨osung wird nach folgender Formel berechnet:

Extinktion∗17

0,85 = mg Protein/ml

• Einstellen des Proteingehaltes der Suspension auf 0,4 mg/ml durch Verd¨unnen mit Puffer.

• Photometrische Extinktionsmessung (Tr¨ubungsmessung) bei 540nm gegen den Puffer als Leerwert. Der gemessene Extinktionswert dient als Maß f¨ur den MFI.

2. Sarkomerenl¨ange

Die Sarkomerenl¨angen wurden lichtmikroskopisch mit Hilfe eines

modifizier-ten Verfahrens nach Kim (1984) und K¨uhne (1990) gemessen. Es wurden an 6 Untersuchungszeitpunkten Proben von 12 Tieren (Tier Nr. 3, 5, 8 – 17) untersucht, sodaß sich eine Gesamtzahl von n = 72 untersuchten Proben ergibt.

Dazu wurden aus der Probe drei Muskelst¨ucke von etwa 2 cm L¨ange und 3–

4 mm Durchmesser herauspr¨apariert und zur Fixation in eine T¨upfelschale gegeben. Die Fixationsl¨osung setzte sich zusammen aus

• Phosphatpuffer 0,2 M mit pH = 7,0 (KH₂PO₄ und Na₂HPO₄ im Verh¨altnis 60:40)

• 2%iger Glutardialdehyd-L¨osung

• Saccharose 0,2 M

Die Fixationsl¨osung wurde auf einen pH von 7,0 eingestellt.

Nach 45-min¨utiger Fixationsdauer wurden die Proben entweder sofort un-tersucht oder zur Aufbewahrung in kleine Kunststofffl¨aschchen verbracht und bei −20 ^oC eingefroren.

In Vorversuchen war vorher sichergestellt worden, daß das Tiefk¨uhlen der fi-xierten Proben das Untersuchungsergebnis nicht beeintr¨achtigt, dazu waren einige Proben sofort nach dem Fixieren untersucht und dann tiefgefroren worden. Einige Tage sp¨ater wurden diese tiefgek¨uhlten Proben dann noch-mals untersucht, wobei die gleichen Ergebnisse ermittelt wurden.

F¨ur die Untersuchung wurden dann aus den frisch fixierten bzw. aufge-tauten Proben schonend mehrere Muskelfasern herauspr¨apariert, auf einen Objekttr¨ager gebracht und mit einem Tropfen Aqua dest. sowie einem Deckgl¨aschen bedeckt. Die Deckgl¨aschen wurden seitlich mit einem Strei-fen Tesafilm fixiert. Die mikroskopische Untersuchung erfolgte mit einem

Lichtmikroskop (Fa. Leitz, Wetzlar) mit 100×Objektiv. Zur Messung wur-de ein Schrauben–Mikrometerokular wur-der Fa. Leitz mit 12,5facher Vergr¨ oße-rung verwendet (Vergr¨oßerung insgesamt 1250fach). Zur Bestimmung der Sarkomerenl¨angen wurden zw¨olf Messungen jeweils an einer Gruppe von zehn Sarkomeren an verschiedenen Fasern vorgenommen und der arithme-tische Mittelwert gebildet.

3. Kochsaftverlust

F¨ur die Bestimmung des Kochsaftverlustes und die anschließende Messung der Scherkraft wurden von den Muskelproben weitgehend fett– und bin-degewebsfreie gleichf¨ormige St¨ucke von ca. 200 g Gewicht abgetrennt. Dies geschah an den 6 Untersuchungszeitpunkten vom 2. – 27. Tag p.m. an Mus-kelproben von 13 Tieren (Tiere Nr. 5 und 8 –19).

Diese Proben wurden exakt gewogen und in luftdichte, hitzebest¨andige, eng anliegende Poly¨athylenbeutel vakuumverpackt und in einem Wasser-bad (Sch¨uttelwasserbad Typ 3047, Fa. K¨ottermann, H¨anigsen) zwei Stun-den lang bei 80^oC erhitzt. Dieses Erhitzungsverfahren hatte sich als am geeignetsten erwiesen, um die mit 200 g recht großen Muskelproben scho-nend auf eine Kerntemperatur von ca. 70^oC gleichm¨aßig durchzuerhitzen;

bei dieser Temperatur sind dann nach Seuss und Honikel (1987) weit

¨

uber 90 % der Proteine in der Muskulatur denaturiert.

Danach k¨uhlten die Beutel im K¨uhlschrank ab. Die Auswaage fand dann nach Abgießen des entstandenen Kochsaftes, Abtupfen des Fleisches mit einem Handtuch und einer ca. 15–min¨utigen Trockenphase bei Zimmer-temperatur statt.

4. Scherkraft

F¨ur die Scherkraftmessung wurden die f¨ur dieselben, f¨ur die

Kochverlust-Bestimmung bereits erhitzten Proben verwendet; die Probenanzahl ist ent-sprechend.

Nach der Bestimmung des Kochsaftverlustes und dem Abtrocknen bei Zim-mertemperatur wurden mit einer Metallstanze l¨angs zur Faserrichtung des Fleisches etwa 4–5cm lange Zylinder mit einem Durchmesser von 12 mm aus den Proben ausgestochen.

An diesen Proben wurde eine Textur-Profil-Analyse mithilfe des “Texture Analyzers” TA-XT2 (Fa. Stable Micro Systems, Haslemere, Surrey, Eng-land) durchgef¨uhrt. Der “Texture Analyzer” war zu diesem Zweck mit einem Aufsatz in Form eines metallenen Scherblattes mit einer dreiecki-gen Aussparung versehen worden. Die wie oben beschrieben aufbereiteten Proben (zylinderf¨ormig) wurden l¨angs unter diese Aussparung des Scher-blattes gelegt, soddaß sie quer zur Faserrichtung geschert und teils auch durchtrennt wurden. Die Deformationsgeschwindigkeit betrug 2 mm/sec.

Die Auswertung der gemessenen Daten erfolgte auf einem angeschlossenen PC mit der zum Texture Analyzer geh¨origen Software “XT.RA Dimensi-on”. Die Deformation der Proben wurde dabei in einem Kraft [N] / Weg [%]

– Diagramm dargestellt. Der Meßwert der Kraft in Newton an der ersten Spitze dieser Kurve (“Peak 1”) dokumentiert dabei die Bruchfestigkeit des Untersuchungsguts und wurde als Maß f¨ur die Scherkraft herangezogen.