11.3 Aufarbeitung der Eluate zur Bestimmung der Freisetzungsraten
11.3.3 Wiederfindungen
Die Mittelwerte und Standardabweichungen für die Wiederfindungen der PCB und PAK nach der Aufarbeitung der Eluate können Tab. 8 entnommen werden. Wie auch schon beim Wiederfindungsversuch für die Soxhletextraktion beschrieben, wurde jeweils ein Isomer der Schadstoffgruppen für diesen Versuch ausgewählt und auf die Verwendung der OH-PCB verzichtet. Das Gemisch des Wiederfindungsstandards enthielt die gleichen Konzentrationen und Substanzen wie im Kapitel 10.2.1 beschrieben. Da insgesamt sechs Ansätze (vier Ansätze mit Standard) bearbeitet wurden, wurde die doppelte Menge des Standards angesetzt.
Wiederfindungen
Wasser Bodeneluat Standardsubstanz MW
[%]
Stabw.
[%]
MW [%]
Stabw.
[%]
2,4-DiCl-BP 112 3 92 24
2,4,4'-TriCl-BP 110 5 80 29
2,2',5,5'-TetraCl-BP 96 1 84 21
2,2',4,5,5'-PentaCl-BP 80 5 69 15
Pyren 159 17 101 40
Phenanthren 167 5 134 36
Tab. 8: Wiederfindungen für die Aufarbeitung der Eluate mit der SPE-Methode.
Drei Ansätze enthielten je 700 mL deionisiertes Wasser, wovon zwei mit jeweils 300 µL des Standards versetzt wurden und der dritte Ansatz als Blindwertkontrolle diente. Die anderen drei Ansätze enthielten je 700 mL eines Bodeneluats, das mit deionisiertem Wasser erzeugt wurden war (Kapitel 11.2). Ebenfalls wurden zwei der Bodeneluat-Ansätze mit 300 µL des Standards versetzt und der dritte Ansatz als Blindwert mitgeführt.
Alle Ansätze wurden vor der Festphasen-extraktion mit konzentrierter HCl auf pH = 3,5 angesäuert.
12 Statistik
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit der Software STATISTICA für Windows Version 5.1 – Studenten-Version 1997 (StatSoft, Inc., Tulsa, USA).
Die Komplexität der Versuche mit bis zu 3 variierbaren Faktoren ermöglicht die Auswertung der Datensätze in univariaten (1-faktorielle) bis hin zu multivariaten (2- und 3-faktorielle) ANOVA. Diese Tests setzen voraus, dass die Daten zufällig und unbeeinflusst gesammelt wurden, die Werte normalverteilt sind und außerdem Varianzengleichheit vorliegt (Sokal und Rohlf, 1997). Die Normalverteilung der Daten wurde im Shapiro-Wilk-Test ermittelt und die Varianzenhomogenität im Bartlett-Chi2-Test für univariate Datensätze oder im Box-M-Test für multivariate Datensätze. Konnten die Testbedingungen nicht erfüllt werden, wurde der entsprechende Datensatz durch Transformation (meistens log10) umgewandelt, womit in den meisten Fällen beide testbaren Bedingungen erfüllt waren. Allerdings ist auch die ANOVA wie der doppelte t-Test relativ robust gegenüber Abweichungen von den Modellvoraussetzungen.
Für nicht zu kleine und nicht zu unterschiedliche Stichprobenumfänge in den Gruppen kann von einer F-Verteilung der Teststatistik ausgegangen werden.
In Tab. 9 sind die in der vorliegenden Arbeit verwendeten ANOVA mit den entsprechenden Modellen und Hypothesen dargestellt.
Art der ANOVA Modell (Typ III QS)
Nullhypothese Alternative Hypothese
1-faktorielle ANOVA Yij = µ + αi + εij H0: αi = 0 HA: αi ≠ 0 2-faktorielle ANOVA
mit festen Effekten
Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij
+ εijk
H0: αi = 0; βj = 0;
(αβ)ij = 0
HA: αi ≠ 0; βj ≠ 0;
(αβ)ij ≠ 0 2-faktorielle ANOVA
mit gemischten Effekten
Yijk = µ + Ai + βj + (Aβ)ij
+ εijk H0: Ai = 0; βj = 0;
(Aβ)ij = 0
HA: Ai ≠ 0; βj ≠ 0;
(Aβ)ij ≠ 0 3-faktorielle ANOVA
mit gemischten Effekten
Yijkl = µ + αi + βj + Ck + (αβ)ij + (αC)ik + (βC)jk +
(αβC)ijk + εijkl
H0: αi = 0; βj = 0;
Ck = 0;
alle Interaktionen = 0
HA: αi ≠ 0; βj ≠ 0;
Ck ≠ 0;
alle Interaktionen ≠ 0
Tab. 9: Modelle und Hypothesen der in der statistischen Auswertung der Daten verwendeten ANOVEN.
Feste Effekte (α; β) sind Faktoren, die nicht zufällig variiert werden können bzw. keine Zufallsauswahl aus einer größeren Population darstellen, wie z.B. die Schadstoffgruppen, verwendete Salzlösungen oder Inkubationsarten. Bei den zufälligen Effekten werden die
Stufen des Einflussfaktors nicht systematisch und bewusst festgelegt oder vorgegeben, sondern zufällig ausgewählt, wie z.B. für den Faktor Temperatur (A; C). Die Kombinationen der Faktoren ergeben die jeweiligen Interaktionen (z.B. αβ), und ε bezeichnet den Fehler.
Die Unterscheidung in feste und zufällige Effekt beeinflusst die Auswertung der Statistik, da sich für die Modelle zum Teil unterschiedliche Prüfvarianzen ergeben.
Die Quadratsummen der ANOVA wurden jeweils nach dem Standard-Model-Typ III QS berechnet, das bei ausgeglichenen und unausgeglichenen ANOVA-Modellen ohne leere Zellen verwendet wird.
Die Nullhypothesen der ANOVA besagen, dass für die untersuchten Faktoren keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden können, während die alternativen Hypothesen davon ausgehen, dass die Ansätze verschieden sind. Die Nullhypothesen werden abgelehnt, wenn innerhalb des 95 %igen Vertrauensintervalls p < 0,05 ist (Rohlf und Sokal, 1995). Die daran anschließenden Post hoc-Tests wurden mittels des HSD-Test von Tuckey durchgeführt.
Weiterhin wurden Unterschiede in einigen Versuchen durch Vergleich der Mittelwerte im Student’schen t-Test ermittelt.
B ESCHREIBUNG DER V ERSUCHE
13 Nachweis der kinetisch kontrollierten Versuchsbedingungen
Die Vorraussetzung für die folgenden Bodenelutionsversuche war, dass unter kinetisch kontrollierten Bedingungen gearbeitet wurde, da die Durchführung von Säulenexperimenten unter Gleichgewichtsbedingungen trotz unterschiedlicher Einflussfaktoren zu gleichen Ergebnissen und somit Equifinalität führen kann (Wehrer und Totsche, 2003).
Es wurde mehrfach gezeigt, dass ungesättige, also Raten-limitierte Elutionsbedingungen durch Flussunterbrechungen beobachtet werden können (Brusseau et al., 1997; Weigand et al., 1999, 2001 und 2002; Münch et al., 2002; Wehrer und Totsche, 2003; Wehrer et al., 2003), da nach der Unterbrechung ein Anstieg der Konzentrationen von Stoffen im Eluat gemessen wird. Sollte diese Konzentrationserhöhung nicht beobachtet werden, müssen die Versuchsbedingungen z.B. durch Variation der Fliessgeschwindigkeit verändert werden. Die optimalen Bedingungen für ein Säulenexperiment lassen sich auch durch numerische Simulation ermitteln, wobei Ungleichgewichtsbedingungen nur in einem engen Bereich des Verhältnisses von Freisetzungsrate zu Transportgeschwindigkeit beobachtbar sind (Wehrer und Totsche, 2003).
Für diesen Versuch wurden 300 g Rieselfeldboden (Probe vom 18.09. 2002) in die Säule der Elutionsapparatur eingebracht und zunächst 93,5 Stunden (ca. 4 Tage) mit deionisiertem Wasser eluiert. Nach dieser Zeit wurde der Fluss durch die Säule gestoppt und nach 72 Stunden wieder gestartet. Die gesamte Elutionsdauer betrug 190 Stunden.
Während der Elution wurde die UV-Absorption bei 254 nm als Maß für die Freisetzung des gesamten organischen Materials beobachtet. An den ersten beiden Tagen der Elution wurde jeweils nach 24 Stunden das Eluat entnommen, und an den darauf folgenden Tagen vor und nach der Flussunterbrechung wurde das Eluat jeweils nach 12 Stunden entfernt, so dass insgesamt 9 Eluate erhalten wurden. Die Temperatur in der Klimakammer während der Elution betrug 15 °C.
In allen Eluaten wurde durch Auswiegen das Elutionsvolumen sowie der pH-Wert und
SAK254 nm bestimmt. Anschließend wurden die letzten drei 12 h-Eluate vor der
Flussunterbrechung und die drei 12 h-Eluate danach mit konzentrierter HCl auf pH = 3,5 angesäuert. Um die Freisetzung einzelner Schadstoffgruppen zu ermitteln, wurden davon jeweils 400 mL mittels Festphasenextraktion aufgearbeitet. Die Extrakte wurden bis zur Trockne eingedampft und mit 10 µL des internen Standards (Kapitel 10.2) versetzt.
Danach wurde mit 500 µL einer ätherischen Diazomethanlösung derivatisiert (Anhang A.
4), das überschüssige Diazomethan mit ca. 1 mg Kieselsäure deaktiviert und die Proben mittels GC-MS vermessen.
Es wurden insgesamt zwei gleiche Ansätze in diesem Versuch bearbeitet, um außerdem die Reproduzierbarkeit der Methode zu überprüfen.
14 Der Einfluss von Salzlösungen und Temperatur
In diesem Versuch sollte die Elution des Rieselfeldbodens (Bodenproben vom 18.09.
2002 und 08.01. 2003) mit verschiedenen Salzlösungen Aussagen darüber zulassen, inwieweit Salze die organische Bodenstruktur beeinflussen können und so zu einer vermehrten oder verringerten Freisetzung des gesamten organischen Materials im Vergleich zu der einzelner Schadstoffgruppen führen. Des Weiteren wird ein Einfluss der Temperatur während der Freisetzung vermutet.
Es wurden drei Salze ausgewählt, die als 50 mM wässrige Lösungen während der Bodenelutionen eingesetzt wurden – Natriumnitrat (NaNO3), Calciumnitrat (Ca(NO3)2) und ein Natriumphosphatpuffer mit pH-Wert ~6,5 (NaH2PO4/Na2HPO4). Die entsprechenden Einwaagen, pH-Werte und Leitfähigkeiten sind in Tab. 10 dargestellt. Die Elution der Böden mit diesen drei Salzlösungen erfolgte immer im Vergleich zur Elution mit deionisiertem Wasser, so dass pro Versuch jeweils vier Ansätze vorhanden waren.
Einwaage [g/L]
pH-Wert Leitfähigkeit [mS/cm]
deionisiertes Wasser n.b. 0,0005
NaNO3 4,25 5,7–5,8 4,8–5,5
Ca(NO3)2 (*4H2O) 11,81 5,7–5,8 8,5–9,7 NaH2PO4 / Na2HPO4 4,23 / 6,44 6,5–6,6*) 4,5–5,0
*) Einstellung des Puffer-pH-Wertes mit konz. HCl.
Tab. 10: Zusammensetzung der Eluenten für die Salz- und Temperatur-Versuche.
Jede Elution wurde außerdem bei drei verschiedenen Temperaturen (5, 15 und 20 °C) untersucht und jeweils zweimal wiederholt, so dass insgesamt 6 Versuche durchgeführt wurden. Da die Elutionsapparatur in einer Klimakammer aufgebaut war, konnten die gewünschten Umgebungstemperaturen konstant eingestellt werden. Vor Versuchsbeginn wurden sowohl die verwendeten Eluenten als auch alle Glasgeräte der Apparatur für 24 Stunden in der Klimakammer vortemperiert.
In die Säulen der Elutionsapparatur wurden je Ansatz 300 g Rieselfeldboden eingebracht.
Der Gehalt an Wasser und Schadstoffen dieses Bodens wurde bereits im Kapitel 8 und Kapitel 10.3 beschrieben.
Die Elution eines Ansatzes dauerte 96 Stunden. Während der gesamten Elutionsdauer wurde die Freisetzung des gesamten organischen Materials durch die Messung der Absorption bei 254 nm beobachtet. Nach jeweils 24 Stunden wurden die Eluate entfernt,
durch Auswiegen die Volumina ermittelt und pH-Wert und SAK254 nm bestimmt. Danach wurden die Eluate mit konzentrierter HCl auf pH-Wert 3,5 angesäuert und von jeweils 50 mL wurde der DOC gemessen. Die Freisetzung der einzelnen Schadstoffgruppen wurde ebenfalls in dem angesäuerten Eluat bestimmt. Dazu wurden jeweils 700 mL der Eluate vom Tag 3 und 4 mittels Festphasenextraktion aufgearbeitet. Die gleichen Fraktionen der beiden Tage wurden vereinigt, bis zur Trockne eingedampft und mit 10 µL des internen Standards (Kapitel 10.2) versetzt. Danach wurde mit 500 µL einer ätherischen Diazomethanlösung derivatisiert, das überschüssige Diazomethan mit ca.
1 mg Kieselsäure deaktiviert und die Proben mittels GC-MS vermessen.
15 Der Einfluss von Enzymen
Der Rieselfeldboden (Bodenprobe vom 04.02. 2004) sollte mit einem Enzym-Cocktail vorbehandelt und anschließend eluiert werden. Die ausgewählten Enzyme sollten die chemischen Eigenschaften und die Struktur des organischen Bodenmaterials derart beeinflussen, dass an diesen Strukturen angelagerte Schadstoffe im Elutionsschritt freigesetzt würden. Dies sollte Rückschlüsse zum Einfluss von Enzymen zur Schadstofffreisetzung zulassen und außerdem mögliche präferentielle Anlagerungsstrukturen dieser Kontaminanten im Boden aufzeigen. Da keine Erfahrungen über den Einfluss von zum Boden zugesetzten Enzymen vorliegen, sollte also zunächst ein Gemisch mehrerer ähnlicher Enzyme in relativ großen Mengen verwendet werden.
Die meisten käuflichen Enzyme sind bereits in geringen Mengen sehr teuer, weshalb der finanzielle Aspekt bei der Auswahl ebenfalls eine Rolle spielte.
Für den Enzym-Cocktail wurden 3 Enzyme ausgewählt, die in der Lage sind, Polysaccharid-Strukturen im Boden zu lysieren – Invertase, Xylanase und Carboxymethyl-Cellulase (CM-Carboxymethyl-Cellulase).
Auf den Einsatz von Pufferlösungen musste in diesen Versuchen verzichtet werden, da nur so verhindert werden konnte, dass die Elution der Schadstoffe bereits durch erhöhten Salzgehalt beeinflusst wurde. Das bedingte eventuell einen geringen Aktivitätsverlust der Enzyme, da nicht unter optimalen pH-Wert-Bedingungen gearbeitet werden konnte.