3. Ergebnisse
3.8. Bestimmung der Phytochelatingehalte
Das Vorhandensein eines externen Chelators, wie Glutathion, konnte nicht als Ursache für das unterschiedliche Wachstums- und Toleranzverhalten des MT knock-out Stammes in Abhängigkeit vom Medium herangezogen werden. Daher sollte untersucht werden, ob die Konzentration von internen Chelatoren Auswirkungen auf das Wachstum und die Toleranz von Wildtyp und ∆zym1 hat. In S. pombe stellen die Phytochelatine eine wichtigen Chelator
für Cadmium und auch Kupfer dar. Das Inaktivieren der Phytochelatinsynthase geht daher auch mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber Cadmium und Kupfer einher (Clemens et al., 1999). Auch für die Hefe C. glabrata wurden PC als wichtige Cd-Chelatoren beschrieben.
Kupfer wird jedoch durch Metallothioneine gebunden (Mehra et al., 1988). Auch in S. pombe sind beide Chelatoren parallel vertreten. Es sollte daher zum einen untersucht werden, welche Auswirkungen die Inaktivierung des Zym1 auf die PC-Bildung hat. Diese Untersuchungen wurden besonders unter Berücksichtigung der Erkenntnisse, daß nicht nur „freie“
Metallionen, sofern sie innerhalb einer Zelle überhaupt vorkommen, sondern auch Metallthiolate an der Aktivierung der PCS beteiligt sind, vorgenommen (Vatamaniuk et al., 2000). Neben Metall-Bisglutathionatkomplexen konnten auch Thiolate, die keine Substrate der PCS darstellen, eine Aktivierung dieser Enzyme bewirken (Oven et al., 2002). Es sollte daher überprüft werden, ob auch Zym1 an der Aktivierung der Phytochelatinsynthase aus S. pombe beteiligt ist. Andererseits sollte überprüft werden, ob die PC-Bildung in den einzelnen Stämmen und Medien mit der Aufnahme von Cadmium und Kupfer korreliert und somit als indirekter Beweis für die Ionenaufnahme fungieren kann. Unterschiede in der PC-Bildung könnten Aufschluß über Defekte, z. B. im Schwefelstoffwechsel, geben
Die einzelnen S. pombe Stämme wurden in der logarithmischen Phase gemäß ihrer IC50-Werte mit Cadmium und Kupfer behandelt (siehe Tabelle 3.2-1). Die derivatisierten Extrakte wurden, wie unter 2.5.7 und 2.5.8 beschrieben, erhalten und für die Umkehrphasen-HPLC eingesetzt (2.5.9). Zur Identifizierung von Glutathion, PC2 und PC3 wurden entsprechende Standards synthetisiert und die Retentionszeiten der jeweiligen Verbindung ermittelt.
Abb. 3.8-1Chromatogramm der Glutathion- (GSH-), PC2- und PC3-Standards: Die Thiolverbindungen wurden mit Monobrombiman konjugiert und mittels Umkehrphasen-HPLC getrennt. Die Anregung der derivatisierten Verbindungen erfolgte bei 380 nm, die Fluoreszenzdetektion der SH-Verbindungen bei 480 nm.
Die Derivatisierung von Thiolverbindungen mit Monobrombiman und ihre anschließende Detektion über Fluoreszenz ist eine geeignete und sensitive Methode für den Nachweis von Glutathion und Phytochelatinen. Im Chromatogramm (Abb. 3.8-1) sind deutlich GSH, PC2 und PC3 bei Retentionszeiten von ca. 11, 15 und 17 Minuten zu erkennen. Eine Quantifizierung der Phytochelatingehalte konnte über die Integrale der Peakflächen vorgenommen werden.
A B
Abb. 3.8-2 Chromatogramm von S. pombe Wildtypextrakten: Die Proteinextrakte von unbehandelten (A) und mit 30 µM CdCl2 (B) behandelten S. pombe Wildtypkulturen wurden mit Monobrombiman derivatisiert und mittels Umkehrphasen-HPLC getrennt. Die Anregung der derivatisierten Verbindungen erfolgte bei 380 nm, die Fluoreszenzdetektion der SH-Verbindungen bei 480 nm.
In der Abb. 3.8-2 ist deutlich zu erkennen, daß die Phytochelatinsynthase Metallionen für ihre Aktivierung benötigt. Während in den Kontrollextrakte (Abb. 3.8-2A) keine PCS vermittelte Synthese von PC2 bzw. PC3 zu beobachten ist, konnte in der mit 30 µM CdCl2 behandelten Probe sowohl PC2 als auch PC3 detektiert werden (Abb. 3.8-2B). Die Retentionszeiten stimmen mit denen der synthetisierten Standards überein. Die Identität des Peaks bei ca. 15 Minuten in der Kontrollprobe (Peak 1) ist nicht geklärt. Er konnte bei fast allen unbehandelten Proben wie auch in den Extrakten von PCS knock-out Stämmen gezeigt werden. Da hier eine PC-Synthese durch die PCS ausgeschlossen werden kann, wird dieser Peak als background-Peak betrachtet. Da trotzdem nicht ausgeschlossen werden kann, daß es sich hierbei um PC handelt, werden die Integrale dieser Peaks in die Auswertung mit einbezogen.
Der in der unbehandelten und mit Cadmium behandelten Probe detektierte Peak X konnte als Monobrombimanderivat identifiziert werden.
3.8.1. Phytochelatinsynthese im EMM-Medium
WT PC2
WT PC3
∆zym1PC2
∆zym1PC3
∆SpPCS PC2
∆SpPCS PC3
∆SpPCS ∆zym1 PC2
∆SpPCS ∆zym1 PC3
∆zhf PC2
∆zhf PC3
∆zhf ∆zym1 PC2
0 ∆zhf ∆zym1 PC3
5000 1 104 1.5 104 2 104 2.5 104 3 104 3.5 104
PC-Gehalt (Peakfläche/mg TG) A
0 5000 1 104 1.5 104 2 104 2.5 104 3 104 3.5 104
PC-Gehalt (Peakfläche/mg TG)
B
0
5000 1 104 1.5 104 2 104 2.5 104 3 104 3.5 104
PC-Gehalt (Peakfläche/mg TG)
C
Abb. 3.8-3 PC2 und PC3-Gehalt der S. pombe Stämme im EMM-Medium: Die verschiedenen S. pombe Stämme wurden bis in die frühe logarithmische Wachstumsphase im EMM-Medium wachsen gelassen und für zwei weitere Stunden ohne Metallzugabe (A), mit Cadmium (B) oder mit Kupfer (C) inkubiert. Dabei wurden die einzelnen Stämme mit den für sie ermittelten IC50-Werten behandelt (Tabelle 3.2-1). Die Proteinextrakte wurden mit Monobrombiman derivatisiert. Die Fluoreszenzdetektion erfolgte nach der Umkehrphasen-HPLC bei einer Wellenlänge von 480 nm, wobei bei 380 nm angeregt wurde. (n = 2)
Für alle Stämme konnte auch in den nicht mit Metall behandelten Proben Peaks detektiert werden, die mit den ermittelten Retentionszeiten der PC übereinstimmten (Abb. 3.8-2A).
Eine deutlich gesteigerte PC-Bildung konnte für Wildtyp, ∆zym1, ∆zhf und ∆zhf ∆zym1 nach Cadmium- und Kupferzugabe gezeigt werden (Abb. 3.8-2B und Abb. 3.8-2C). Für beide PCS knock-out Stämme konnte auch hier nur das Hintergrundlevel an thiolhaltigen Verbindungen detektiert werden.
∆zym1 zeigte im Gegensatz zum Wildtyp eine um den Faktor zwei gesteigerte Synthese von PC2 und PC3 nach Cadmiumzugabe. Berücksichtigt man aber hier die unterschiedlichen Cadmiumkonzentrationen, die zu den jeweiligen Stämmen zugegeben wurden, und zieht die unter Kapitel 3.5.2 durchgeführten Untersuchungen hinzu, so korreliert diese Zunahme mit der erhöhten Cadmiumaufnahme der ∆zym1 Mutante im EMM-Medium. Für die Stämme
∆zhf und ∆zhf ∆zym1 wurden vergleichbare Konzentrationen von PC2 und PC3 ermittelt.
Allerdings zeigten diese Stämme eine sehr geringe PC3-Bildung.
Für die kupferbehandelten Kulturen ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in der PC-Bildung. In diesem Fall zeigt ∆zym1 keine gesteigerte Syntheseleistung im Vergleich zum Wildtyp. Die Aktivität der PCS nach Kupferzugabe ist generell geringer. Der Gehalt an PC3 ist in allen vier Stämmen niedriger als nach Cadmiumbehandlung.
3.8.2. Phytochelatinsynthese im YE-Medium
Auch in den im YE-Medium angezogenen Kulturen ist die PCS ohne die Zugabe von Schwermetallionen inaktiv. Aber auch konnten background-Peaks detektiert werden (Abb.
3.8-4A).
WT PC2
WT PC3
∆zym1PC2
∆zym1PC3
∆SpPCS PC2
∆SpPCS PC3
∆SpPCS ∆zym1 PC2
∆SpPCS ∆zym1 PC3
∆zhf PC2
∆zhf PC3
∆zhf ∆zym1 PC2
∆zhf ∆zym1 PC3
0
5000 1 104 1.5 104 2 104 2.5 104 3 104 3.5 104
PC-Gehalt (Peakfläche/mg TG)
A
0 5000 1 104 1.5 104 2 104 2.5 104 3 104 3.5 104
PC-Gehalt (Peakfläche/mg TG) B
0
5000 1 104 1.5 104 2 104 2.5 104 3 104 3.5 104
PC-Gehalt (Peakfläche/mg TG)
C
Abb. 3.8-4 PC2 und PC3-Gehalt der S. pombe Stämme im YE-Medium: Die verschiedenen S. pombe Stämme wurden bis in die frühe logarithmische Wachstumsphase im YE-Medium wachsen gelassen und für zwei weitere Stunden ohne Metallzugabe (A), mit Cadmium (B) oder mit Kupfer (C) inkubiert. Dabei wurden die einzelnen Stämme mit den für sie ermittelten IC50-Werten behandelt (Tabelle 3.2-1). Die Proteinextrakte wurden mit Monobrombiman derivatisiert. Die Fluoreszenzdetektion erfolgte nach der Umkehrphasen-HPLC bei einer Wellenlänge von 480 nm, wobei bei 380 nm angeregt wurde. (n = 2)
Eine Aktivierung der PCS war nur nach Cadmiumzugabe möglich (Abb. 3.8-4B). Hierbei wiesen Wildtyp und ∆zym1 bzw. ∆zhf und ∆zhf ∆zym1 eine vergleichbare Syntheserate von
PC2 und PC3 auf. Die PC3-Konzentrationen waren im Gegensatz zum EMM-Medium im Wildtyp und ∆zym1 reduziert.
In den kupferbehandelten Kulturen konnte generell keine PC-Synthese beobachtete werden.
Die Konzentration der Phytochelatine blieb unverändert zur unbehandelten Kontrolle.