Ist Zym1 ein zinkbindendes Metallothionein?

Metallothioneine nehmen eine Sonderstellung unter den metallbindenden Proteinen ein. Bis zu 30 % der Aminosäuren sind Cysteine, aromatische AS-Reste fehlen völlig und Histidine sind äußerst selten in den Primärsequenzen von MT zu finden (Hamer, 1986). Das Fehlen aromatischer Aminosäuren ermöglicht erleichterte Untersuchungen der Metallbindung unter Verwendung spektroskopischer Methoden wie Lumineszenz, UV-Absorptionsspektroskopie und Circulardichroismus. So kann die Bindung von Metallen einfach durch die erwähnten spektroskopischen Techniken verfolgt werden. Hierbei verursacht der Übergang vom freien zum metallbindenden Thiol eine Wellenlängenverschiebung, die in den Bereichen zwischen 220 nm bis 350 nm liegt (Stillman, 1995). Beim Vorhandensein aromatischer AS wäre dieser Bereich komplett maskiert und könnten nicht für Analysen herangezogen werden.

Generell konnte die Bindung an Metallothioneine in vivo nur für die Metalle Cadmium, Kupfer, Zink gezeigt werden. Dabei konnte für die MT tierischer Organismen von Invertebraten bis hin zu Säugern hauptsächlich Zink- und Cadmiumbindung beschrieben werden (Shaw et al., 1991). Dieses spiegelt sich auch in der Toleranz dieser Organismen wieder. Generiert man MT Null Mäuse, so resultiert dieses in einer erhöhten Cadmium-sensitivität. Cadmiumbindung wurde neben Säuger-MT beispielsweise auch am MT des Anneliden Lumbricus rubellus nachgewiesen (Stürzenbaum et al., 2001).

Alle bisher untersuchten Hefen zeigten hauptsächlich Kupferbindung. So ist das MT aus S. cerevisiae ursprünglich als Cu proteine bezeichnet worden (Hamer et al., 1985). Für eine weitere Hefe C. glabrata konnte ein kupferbindendes MT nachgewiesen werden, während Cadmium durch Phytochelatine gebunden wird (Mehra et al., 1988).

Das von Borrelly und Ko-Autoren als Zym1 für zinc yeast metallothionein bezeichnete MT aus S. pombe würde somit das erste zinkbindende Hefe-MT darstellen (Borrelly et al., 2002).

Da Zinkbindung für diese Klasse von MT untypisch ist, keine erhöhte Sensitivität nach Zinkbehandlung ermittelt wurde und Veränderungen der Elementzusammensetzung des Wildtyps nur nach Kupferzugabe nachgewiesen wurde, sollte die Metallbindung nochmals näher untersucht werden. Während in der erwähnten Publikation das MT gereinigt und Zinkbindung spektrophotometrisch nachgewiesen wurde, sollte in der vorliegenden Arbeit Metallbindung auf dem klassischen Weg untersucht werden. Auf Grund der großen Instabilität des MT wurde auf eine Reinigung dieses Proteins verzichtet. Die erhaltenen Proteinextrakte wurden nur durch Azetonfällung behandelt, um die Proteine höherer Molekulargewichte zu entfernen und das Proteinmuster der chromatographische Trennung auf niedermolekulare Proteine zu reduzieren. Direkt nach der Fällung wurden die Extrakte durch Gelfiltration nach Molekulargewichten getrennt und die Metallgehalte mittels Atomabsorptionsspektroskopie bestimmt. Hierbei konnte weder für Cadmium noch für Zink ein erhöhter Ionengehalt in den durch vorherige Kalibrierung bestimmten Fraktionen ermittelt werden (Abb. 3.10-2B u. D und Abb. 3.10-3B u. D). Für die mit Kupfer behandelten Kulturen wurde die Induktion eines Proteinpeaks, in dem fast das gesamte Kupfer akkumulierte, gezeigt (Abb. 3.10-4B u. D). Dieses Ergebnis wurde für beide Medien analog erhalten.

Um sicher zu gehen, daß es sich nicht um ein anderes Protein handelt, wurde auch der MT knock-out untersucht. Erstaunlicherweise wurde auch hier ein Kupferpeak ohne das Vorhandensein des Proteinpeaks detektiert (Abb. 3.10-5A u. B). Allerdings erstreckte sich die Kupferbindung über einen größeren Molekulargewichtsbereich als beim Wildtyp zu beobachten war. Es kann also angenommen werden, daß speziell im ∆zym1 andere Proteine an der Kupferbindung beteiligt sein können. Da die massenspektrometrischen Untersuchungen der putativen MT-haltigen Gelfiltrationsfraktionen keine Ergebnisse lieferten, sollte der MT knock-out FY261 ∆zym1 mit pSLF172/zym1 transformiert werden. Im Plasmid pSLF172 wird zym1 mit einem Hämagglutinin-Tag (HA-Tag) fusioniert, so daß die Detektion des zym1-HA Genproduktes leicht mit dem für den Tag spezifischen HA-Antikörper vorgenommen werden konnte.

Die Dot-Blotanalyse zeigte deutliche Signale nur in der kupferbehandelten Probe (Abb.

3.10-6F). Die Antikörperfärbung korrelierte hier mit den Fraktionen der Kupferakkumulation (Abb. 3.10-6E). Für die mit Zink und Cadmium behandelten Kulturen konnte Zym1-HA nur schwach detektiert werde (Abb. 3.10-6B u. D). Im Chromatogramm ist kein Proteinpeak zu

erkennen (Abb. 3.10-6Au. C). Allerdings ist die Verteilung der Metalle wie schon bei den Wildtypkulturen über ein breites Molekulargewichtsspektrum verteilt.

Welche der beiden für die Metallbindung herangezogene Methode die bessere ist, bleibt zu diskutieren. Die Reinigung des MT birgt die Gefahr der Degradierung des Proteins. Des weiteren ist es sehr schwierig, eine hochreine homogene Proteinpräparation zu erhalten. Bei einem Anteil von mehr als 3 % Zinkproteine im Proteinrohextrakt ist die Wahrscheinlichkeit einer Verunreinigung durch ein zinkbindendes Protein sehr hoch und kann zu artifiziellen Messungen führen. Allerdings wurde die Reinheit der Proteinpräparation mittels SDS-PAGE bestätigt und das Protein aminoterminal ansequenziert (Borrelly et al., 2002).

Auf der anderen Seite bergen auch die hier gezeigten Daten Risiken. Dadurch, daß mit dem Proteinrohextrakt, in dem nur höhermolekulare Proteinen präzipitiert wurden, gearbeitet wurde, muß für eine eindeutige und verläßliche Aussage zur Metallbindung das Protein in den kupferhaltigen Fraktionen sequenziert werden. Gerade hier sind im Vergleich mit der in Borrelly et al. verwendeten Methode Verunreinigungen durch andere Proteine der gleichen Molekularen Masse möglich. Besonders die Existenz eines nahezu vergleichbaren Kupferpeaks in der MT knock-out Mutante läßt keine verläßliche Aussage über die tatsächliche Metallbindung des MT zu. Eindeutig hingegen sind die Daten des transformierten

∆zym1. Ein Zym1-HA Peak konnte nur nach Kupferbehandlung detektiert werden. In diesem Peak ist nahezu das gesamte Kupfer akkumuliert. Erstaunlich sind die Daten, wenn man in Betracht zieht, daß das Plasmid pSLF172 über einen starken, konstitutiven und metallunabhängig regulierten Promotor, den nmt-Promotor, verfügt. Die Expression des zym1 und die Akkumulation seines Genproduktes sollten somit konstitutiv und unabhängig von der Metallbehandlung sein. Trotzdem konnte Zym1-HA nach Zink- und Cadmiumbehandlung der Kulturen kaum detektiert werden. Eine Ursache hierfür könnte die unterschiedliche Stabilität der metallbindenden MT sein. Aus der Literatur ist bekannt, daß Metallothioneine gegenüber Apothioneinen, der metallfreien Form der MT, stabilisiert und gegen Proteolyse geschützt sind (Winge et al., 1985). Sollte Zym1 Kupfer binden, so könnte dieses die Erklärung für die wesentlich stärkere Detektion des Proteins unter Kupferbedingungen sein.

Um diese Stabilisierungstheorie zu beweisen, wurden einfache Stabilitätsassays durchgeführt.

Hierbei wurde der turnover des Proteins unter verschiedenen Streß- und Normalbedingungen verglichen. Die Proteinextraktion und Azetonpräzipitation erfolgte analog zu den für die Gelfiltration eingesetzten Proben. Mittels Western-Blot sollte die Stabilität untersucht werden. Eine reduzierte Signalstärke, der auf eine gleiche Proteinkonzentration eingestellten Proben, sollte als Maß für die Stabilität gelten.

Entgegen der in den Gelfiltrationsexperimenten erhaltenen Ergebnisse konnte Zym1-HA in allen metallbehandelten Proben annähernd gleich stark detektiert werden (Abb. 3.11-1). Eine leichte Reduktion war nur in der H2O2 behandelten Probe zu verzeichnen. Die Komplexierung von Metallionen scheint entweder keinen Einfluß auf die Stabilität zu haben oder die Behandlung der Proben ist essentiell für den Verlust der Metallbindung. Für eine Vielzahl von Säulenmaterialen ist eine Affinität zu Schwermetallionen beschrieben. Sollte Zym1 Cadmium, Zink und Kupfer mit unterschiedlichen Komplexbildungskonstanten binden, so könnte dies die unterschiedlichen Ergebnisse erklären. Wenn die Komplexierung des Kupfers stärker als die des Cadmiums und Zinks wären, so könnte die Bindung der letzten beiden Metalle zum MT leicht gelöst werden und die Metalle auf der Säule verbleiben. Dieser Verlust des Metalls durch die chromatographische Methode könnte somit zu einer verringerten Stabilität führen und die Erklärung für das Fehlen der Proteinfraktionen, die Zym1-HA enthaltigen, darstellen.