Das Inaktivieren des Zym1 hat keine Erhöhung der Metallsensitivität zur

hinsichtlich ihres Wachstums unter verschiedenen Bedingungen ist ein initialer Schritt zur Untersuchung der Funktion von Metallothioneinen. In der vorliegenden Arbeit wurde das MT aus S. pombe in mehreren Stämmen und Mutanten inaktiviert (Abb. 3.1-2). Anschließend wurde das Wachstumsverhalten untersucht. Dabei konnten für alle im Minimalmedium (EMM-Medium) angezogenen MT knock-out Mutanten eine Erhöhung der Toleranz gegenüber Cadmium, Kupfer, Zink, Nickel und Kobalt ermittelt werden (siehe Kapitel 3.2).

Die Mutante ∆zym1 zeigte selbst bei Cadmiumkonzentrationen, die höher als 500 µM CdCl2

waren, keine Wachstumsinhibierung (Abb. 3.2-2A). Der IC50-Wert des Wildtyps hingegen lag bei 30 µM CdCl2. Die Toleranz der ∆zym1 Mutante waren für Kupfer und Zink etwa 1,5fach bzw. circa 2,5fach gesteigert (Abb. 3.2-3A u. Abb. 3.2-4A).

Durch die Transformation von pSLF172/zym1 konnte ausgeschlossen werden, daß die ermittelten Toleranzsteigerungen unabhängig vom inaktivierten Zym1 sind. Die

Transformanden sind zwar immer noch cadmiumtoleranter als der Wildtyp, zeigen aber gegenüber der ∆zym1 Mutante eine geringere Toleranzsteigerung (Abb. 3.12-2).

Die eben beschriebenen Resultate stehen im klaren Widerspruch zu allen bisher veröffentlichten Daten von MT knock-out Mutanten. In keiner dieser Mutanten verursachte das Inaktivieren eines MT, als potentiellen Chelators, eine Steigerung in der Toleranz gegenüber Schwermetallen. Vielmehr resultierte das Fehlen eines funktionellen MT in einer erhöhten Schwermetallsensitivität. Untersuchungen des S. cerevisiae MT knock-out ∆cup1 ergaben eine drastisch erhöhte Kupfersensitivität im Vergleich zum Wildtyp (Hamer et al., 1985). Während der Wildtyp nur eine leichte Wachstumsinhibierung bei 60 µM CuCl2 zeigte, ist ∆cup1 bei solchen Konzentrationen nicht mehr in der Lage zu wachsen. Diese MT knock-out Mutante erfährt eine 50 %ige Inhibierung des Wachstums bei etwa 15 µM CuCl2 (Jensen et al., 1996). Auch für Säuger konnte eine verminderte Toleranz vor allem für Cadmium beobachtet werden. MT-I und MT-II Null-Mäuse reagierten sensitiver auf die toxischen Effekte des Cadmiums als Kontrollmäuse (Masters et al., 1994). Auf der anderen Seite konnte durch die Überexpression von MT-I in Mäusen bzw. MT-II in menschlichen Fibroblastzellen eine Toleranz gegenüber höheren Konzentrationen an Cadmium erreicht werden (Liu et al., 1995); (Karin et al., 1983). Auch Borrelly und Ko-Autoren zeigten, daß die Überexpression des zym1, den zinksensitiven Phänotyp der ∆zhf Mutante im EMM-Medium zu komplementieren vermag (Borrelly et al., 2002). Jedoch wurden bei diesen Untersuchungen Zinkkonzentrationen gewählt, bei denen ein Wachstum der zinksensitiven Stämme überhaupt gar nicht mehr möglich war. Die eingesetzten Zinkkonzentrationen waren mehr als zehnmal höher als die in der vorliegenden Arbeit ermittelten IC50-Wertkonzentrationen. Zusätzlich dazu ist es nicht möglich im EMM-Medium mit millimolaren Zinkkonzentrationen zu arbeiten, da Zink, vermutlich durch die hohe Konzentration an Phosphat im Medium (Tabelle 3.6-3), schon bei 600 µM ZnCl2 ausfällt. Die Aussagekraft dieser Daten ist daher stark anzuzweifeln.

Während eine Zunahme der Toleranz gegenüber Übergangsmetallen bei Anzucht im Minimalmedium beobachtet wurde, konnte im Komplexmedium (YE-Medium) ein solches Wachstumsverhalten nicht gezeigt werden (Abb. 3.2-2B, Abb. 3.2-3B u. Abb. 3.2-4B). In diesem Fall verhält sich das Wachstum der MT knock-out Stämme wie das der MT-Wildtypstämme. Das Metallothionein trägt demnach nicht zu einer Erhöhung der Schwermetalltoleranz bei und ist nicht an Detoxifizierungsprozessen beteiligt. Allerdings wurden von Borrelly und Ko-Autoren für den ∆zym1 sowohl eine verringerte Toleranz

gegenüber Cadmium als auch Zink im Komplexmedium gezeigt (Borrelly et al., 2002).

Beides konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente nicht bestätigt werden.

Es ergaben sich keine Unterschiede im Wachstum zwischen MT knock-out und Wildtyp nach Zink- und Cadmiumbehandlung im YE-Medium. Zusätzlich dazu konnten die Untersuchungen von ∆SpPCS und ∆SpPCS ∆zym1 herangezogen werden. Hier konnte ebenfalls keine unterschiedliche Toleranz ermittelt werden. Phytochelatine stellen einen Hauptentgiftungsmechanismus für Cadmium und Kupfer in S. pombe dar (Abb. 3.2-2). Ein Inaktivieren der Phytochelatinsynthase erhöht drastisch die Sensitivität gegenüber Cadmium und, wenn auch in geringerem Maße, gegenüber Kupfer (Clemens et al., 1999). Das Generieren einer ∆zym1 knock-out Mutante in ∆SpPCS resultiert ebenfalls nicht in einem geringeren Wachstum. Während man für den im Wildtyp generierten MT knock-out annehmen könnte, daß der Verlust des Zym1 durch die Bildung von Phytochelatinen kompensiert werden kann, ist das für ∆SpPCS ∆zym1 ausgeschlossen. Die in dieser Arbeit ermittelten Daten zeigen, im Unterschied zu Borrelly et al., eine unveränderte Toleranz gegenüber Cadmium in zwei verschiedenen genetischen backgrounds, dem cadmium-toleranten Wildtyp und der cadmiumsensitiven ∆SpPCS Mutante. Auch die Generierung einer zym1 knock-out Mutante im zinksensitiven ∆zhf Stamm ermöglichte verläßlichere Wachstumsuntersuchungen im Vergleich zur oben benannten Publikation. In dieser wurde das Wachstum des Wildtyps und der ∆zym1 Mutante in Zinkkonzentrationen verglichen, die keinen oder nur wenig Einfluß auf das Wachstumsverhalten der Stämme zeigten.

Aussagekräftigere Daten sind auch in diesem Fall durch die Untersuchungen sensitiver Mutanten, wie ∆zhf und ∆zhf ∆zym1 zu erwarten. Weiterhin muß angemerkt werden, daß auch die in der Publikation verwendeten Zink- bzw. Cadmiumkonzentrationen zu keinen mit der vorliegenden Arbeit vergleichbaren Ergebnissen führten.

Da Cadmium, Kupfer und Zink im EMM-Medium mit einer Erhöhung der Toleranz der MT knock-out Mutanten einherging und dieses im YE-Medium nicht gezeigt werden konnte, sollte überprüft werden, ob die Metallbindung durch Zym1 Einfluß auf das Wachstum hat.

Daher wurden auch Kobalt und Nickel für die Wachstumsuntersuchungen eingesetzt. Für beide Metalle wurde die Bindung an MT bisher nur in vitro, aber nicht in vivo gezeigt.

Auch nach Kobalt- und Nickelbehandlung zeigten die MT knock-out Mutanten ein gegenüber den MT-Wildtypstämmen gesteigertes Wachstum im Minimalmedium (Abb. 3.2-5). Es ist allerdings nahezu ausgeschlossen, daß Kobalt und Nickel durch Zym1 gebunden und somit detoxifiziert werden. Die nach Metallbehandlung gesteigerte Toleranz der MT knock-out

Mutanten ist demnach gänzlich unabhängig von der Art der Metallionen. Auf Grund der gesteigerten Toleranz der MT knock-out Mutanten nach Metallbehandlung ist eine Beteiligung des Zym1 an der Detoxifizierung von Metallen auszuschließen. Der von der Art des Metalls unabhängige Phänotyp der Mutanten läßt weiterhin eine Assoziation der erhöhten Toleranz mit einer Metallbindung durch Zym1 bezweifeln. Vielmehr könnten Komponenten des Minimalmediums als Ursache für die gezeigten Phänotypen der zym1 defizienten Stämme herangezogen werden. Auf diesen Aspekt wird in einigen Abschnitten der Diskussion eingegangen werden. Auf der anderen Seite waren für alle MT knock-out Mutanten ein wesentlich geringeres Wachstum auch unter Normalbedingungen ermittelt worden. Dieser Aspekt wird unter 4.1.3 genauer diskutiert. Auch das stark verlangsamte Wachstum kann Einfluß auf die Ausprägung des Phänotyps haben. Hier könnte man die Wirkung des Penicillins als Beispiel heranziehen. Dieses ß-Laktam-Antibiotikum verhindert die Vernetzung der Peptidoglykane in der Mureinschicht wachsender Zellen (Hänsel & Hölz, 1996). Daher wirkt dieses Antibiotikum toxisch nur auf sich teilende Zellen. Die Toxizität von Penicillin erscheint daher höher in wachsenden Zellen als in stationären. Nimmt man also an, daß besonders sich teilende Zellen von den toxischen Effekten der Metalle betroffen sind, so könnte das die erhöhte Toleranz der MT knock-out Mutanten im EMM-Medium erklären.

Alle MT-Wildtypstämme wiesen eine circa zweifach erhöhte Verdopplungszeit im Vergleich zu den ∆zym1 Mutanten auf (Abb. 3.2-1A; Abb. 3.4-1A). Die verminderte Toleranz aller MT-Wildtypen könnte daher wirklich durch das bessere Wachstum und die dadurch verstärkten Effekte von Schwermetallionen erklärt werde.

4.1.2. Glutathion als extrazellulärer Chelator hat keinen Einfluß auf das Wachstums-