Vorversuche

Um die geeigneten Bedingungen für die Verseifung zu finden wurden Testreaktionen mit den Basen Natriumhydroxid, Natriumhydrogencarbonat, Natriummethanolat und Ammoniak durchgeführt. Als Lösungsmittel eignete sich Methanol aufgrund der mäßigen Löslichkeit von Simocyclinon D8 in lipophilen Solventien und der geplanten Verwendung von wässrigen Reagenzien am besten. Die Reaktionen wurden jeweils mit Lösung von 5.0 mg (0.005 mmol) Simocyclinon D8 (85) in 2.0 mL Methanol durchgeführt, um einen quantitativen und qualitativen Vergleich der Reaktionsgemische zu ermöglichen. Der Reaktionsverlauf der Vorversuche wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Mittels LC-MS wurden die Rohprodukte auf ihre Zusammensetzung überprüft und gegebenenfalls eine Gelchromatographie an Sephadex LH-20 durchgeführt, um die erhaltenen Reaktionsprodukte NMR-Experimenten zugänglich zu machen. Die Molmassen der zu erwartenden Spaltprodukte sind in Tabelle 9 angegeben. Es muss auch beachtet werden, dass aufgrund des gewählten Reagenzien eine Bildung der Methylester möglich ist und nicht die freie Carbonsäure erhalten wird. Für die geplanten Aktivitätstest stellen sowohl die freie Säure als auch der Methylester interessante Verbindungen dar.

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Abbildung 47: Fragmentierung von (85) unter basischen Bedingungen.

Tabelle 9: Zu erwartende Molmassen und ESI-Ionen der möglichen Spaltprodukte. Die gewünschten Spaltprodukte sind in der Tabelle grau hinterlegt.

Fragment Molmasse

5.0 mg (0.005 mmol) Simocyclinon D8 (85) wurden in methanolischer NaOH-Lösung (pH = 10) gelöst und bei RT für drei Stunden gerührt. Nach Neutralisation mit verdünnter Salzsäure wurde die Reaktionslösung mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organische Phasen mit ges. Natriumchlord-Lösung gewaschen. Auswertung der Dünnschicht-chromatogramme ergab eine unselektive Zersetzung von 85 in zahlreiche Produkte. Auf eine weitere Analytik wurde daher verzichtet.

Spaltung mit Natriumhydrogencarbonat

Zu einer methanolischen Lösung von 85 (5.0 mg, 0.005 mmol) wurde ein Gewichstsäquivalent gepulvertes Natriumhydrogencarbonat (5.0 mg, 0.060 mmol) gegeben und bei Raumtemperatur gerührt. Da nach zwei Stunden kein Umsatz des Edukts zu erkennen war, wurde die Reaktion weitere 30 Minuten unter Rückfluss erhitzt und anschließend analog der Umsetzung mit Natriumhydroxid aufgearbeitet. Die LC-MS-Analytik zeigte, dass es sich hierbei im wesentlichen um Fragment C (R = 7.1 min) handelt. Das A+B Fragments oder t

seine Methylesters konnten auch durch gezielte Suche der Ionen in den LC-MS-Chromatogrammen nicht nachgewiesen werden.

Spaltung mit Natriummethanolat

Das in Methanol gelöste Simocyclinon (5.0 mg, 0.005 mmol) wurde unter Rühren mit vier Äquivalenten einer 0.1 M Natriummethanolat-Lösung (200 μL , 0.020 mmol) umgesetzt. Die Reaktion erfolgte zunächst bei -20 °C, wonei kein Umsatz des Edukts erfolgte. Erst nach langsamem Erwärmen auf Raumtemperatur konnte man die Bildung von Spaltprodukten bei der Reaktionskontrolle erkennen. Der Abbruch der Reaktion erfolgte nach ca. vier Stunden indem die Reaktionslösung in 5 mL eiskalte 1 M HCl gegossen wurde. Extraktion mit Ethylacetat und Waschen der organischen Phase lieferte das Rohprodukt, welches durch LC-MS-Analytik auf seine Zusammensetzung überprüft wurde. Hauptkomponente war nicht umgesetztes 85 mit einer Retentionszeit von 16.8 min. Die gewünschten Produkte konnten in geringem Umfang mit Rt = 7.2 min (Fragment C) und 15.5 min (Methylester des Fragments A+B) nachgewiesen werden. Minderkomponenten der Reaktion waren Fragment A (Rt = 20.2 min) und der Dimethylester von Fragment B (Rt = 12.7 min).

Spaltung mit Ammoniak

Für die Spaltung von 85 (5.0 mg, 0.005 mmol) mit Ammoniak wurde dieses in Methanol gelöst und bei 0 °C mit dem gleichen Volumen einer 7 M Lösung der Base, die zuvor durch Verdünnen einer 28%igen wässrigen Ammoniaklösung mit Methanol hergestellt wurde, umgesetzt. Bereits nach einer halben Stunde waren bei der Reaktionskontrolle zwei neue Zonen knapp ober- und unterhalb des Edukts zu erkennen. Die Intensität dieser Zonen nahm im Verlauf der nächsten sechs Stunden nur langsam zu. Weitere Reaktionsprodukte waren im DC nicht nachweisbar. Ein vollständiger Umsatz von 85 erfolgte auch nach dem Entfernen der Kühlung und Fortsetzen der Reaktion für weitere 12 Stunden nicht. Daraufhin wurde die Reaktion abgebrochen, indem die Reaktionslösung im Vakuum bis zur Trockne eingeengt wurde. Die LC-MS-Analyse des Rohprodukts ergab als Hauptprodukt der Reaktion den Methylester des gewünschten Fragments A + B (Rt = 15.6 min). In wesentlich geringerem Umfang konnte erstmals auch die freie Säure A + B (Rt = 14.3 min) nachgewiesen werden.

Als Nebenkomponenten wurden die Fragmente C (96) (Rt = 7.4 min) und A (Rt = 20.3 min) gebildet. Der Anteil des nicht umgesetzten Simocyclinon D8 (85) (Rt = 16.8 min) blieb weiterhin relativ hoch.

Diskussion der Vorversuche

Sowohl die Spaltungen mit Natriummethanolat als auch mit Ammoniak lieferten das Aminocoumarin mit der amidisch gebundenen Decatetraendisäure. Ein quantitativer Umsatz von (85) konnte im Rahmen der Vorversuche nicht erreicht werden. Aufgrund der relativ hohen Reaktivität des Methanolats zeigt sich eine hohe Tendenz zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte. Insbesondere die Spaltung der Amidbindung scheint unter diesen Bedingungen in höherem Maße statt zu finden. Aus diesen Gründen wurde eine Optimierung der Verseifung mit Ammoniak durchgeführt. Eine Konzentrationserhöhung der eingesetzten Reagenzien erschien wenig sinnvoll, da bereits bei den beschriebenen Bedingungen unerwünschte Nebenprodukte auftraten. Vielmehr sollte durch die Optimierung der Reaktionszeit eine Verbesserung der Ausbeute erreicht werden. Die Detektion von geringen Spuren der freien Säure des gesuchten Spaltprodukts erlaubt die Annahme, dass dieses nicht das bevorzugt gebildete Reaktionsprodukt ist. Unter den vorliegenden basischen Bedingungen und der Präsenz des als Lösungsmittel verwendeten Methanols erscheint die Spaltung durch Angriff eines in situ erzeugten Methanolat-Ions zu erfolgen. Diese in situ-Bildung scheint, im Vergleich zur direkten Spaltung mit Methanolat, durch die geringere Konzentration des reaktiven Nukleophils eine erhöhte Selektivität mit sich zu bringen. Aufgrund der geringen Umsatztrate ergab die Auftrennung der Reaktionsgemische an Sephadex LH-20 (Eluent:

MeOH) keine für die Spektroskopie ausreichenden Substanzmengen. Die Trennschärfe fiel trotz der großen Unterschiede in den Molmassen ungewöhnlich schlecht aus. Dieses Phänomen lässt sich auf die schlechte Löslichkeit des Edukts bzw. der Spaltprodukte in Methanol sowie auf deren strukturelle Verwandtschaft zurückführen. Aus diesem Grund wurde bei zukünftigen Versuchen ebenfalls eine Optimierung der Trennungen angestrebt.