Bei der Suche nach Sekundärstoffen mit interessanten biologischen Aktivitäten sind endophytische Pilze eine reichhaltige Quelle dar165. Die im Rahmen dieser Arbeit bearbeiteten Stämme wurden bereits im Vorfeld einem biologischen und chemischen Screening unterzogen, wodurch alle bearbeiten Organismen mindestens einen Sekundärstoff mit interessanter Struktur oder biologischer Aktivität lieferten. Ausgehend von den Ergebnissen der von der BASF durchgeführten Mikrotests auf fungizide, herbizide und insektizide Wirksamkeit, ist es fast ausnahmslos gelungen, die aktiven Komponenten der bearbeiteten Stämme zielgerichtet zu isolieren. Ebenso konnten viele der im chemischen Screening auffälligen Sekundärstoffe in Reinform erhalten werden. Bei keinem der ausschließlich aufgrund des chemischen Screening isolierten Naturstoffe konnte im Nachhinein eine biologische Aktivität nachgewiesen werden. Hierdurch wird die hohe Aussagekraft der Mikrotests der Extrakte deutlich unterstrichen. Besonders ergiebig für die Isolierung physiologisch aktiver Naturstoffe waren erwartungsgemäß jene Stämme, die in beiden Screeningverfahren als äuffällig eingestuft wurden.
Die Strukturaufklärung der Reinsubstanzen hat jedoch gezeigt, dass keiner der isolierten Naturstoffe eine neuartige Struktur aufwies. Viele der Verbindungen waren bereits seit Jahrzehnten in der Literatur bekannt, zwei waren in Form von chemisch leicht modifizierten Derivaten beschrieben. Dieses Ergebnis erscheint verwunderlich, werden doch Pilze in den letzten Jahren als die für die Naturstoffforschung aussichtsreichsten Produzenten eingestuft166. Die Isolierung bekannter Sekundärstoffe spiegelt jedoch einen in den letzten Jahren verstärkt beobachteten Trend der Naturstoffchemie wieder, denn die Zahl der isolierten Verbindungen völlig neuen Types nimmt immer weiter ab (vgl. Einleitung). Daran konnte auch die Entwicklung vollautomatisierter und somit enorm durchsatzstarker Verfahren, wie z.B. des von der pharmazeutischen Industrien favorisierten High-Troughput-Screenings (HTS), oder die Durchführung von umfangreichen Bioassays auf immer neue biologische Wirkungen nichts ändern. Beispielsweise konnten aus den 70 zwischen 1995 und 2000 von der Firma GlaxoSmithKline durchgeführten HTS-Kampagnen lediglich fünf Leitstrukturen für antibakterielle Wirkstoffe erhalten werden167. Aufgrund der hohen Kosten für diese Ansätze verwundert das zwischenzeitlich stagnierende Interesse der Industrie an antibakteriellen Naturstoffen keineswegs168. Ob diese von der Industrie für die Suche nach neuen Naturstoffen angewandten Strategien den richtigen Ansatzpunkt darstellen ist ebenfalls in Frage zu stellen.
Dennoch erscheint die Erforschung pilzlicher Sekundärstoffe weiterhin als aussichtsreich.So hat die kürzliche Sequenzierung des Genoms von Fusarium graminearum exemplarisch gezeigt, dass das Biosynthesepotential selbst gründlich erforschter Pilze wesentlich größer zu sein scheint als bisher angenommen und belegt wurde169. Die Funktionsanalyse der Gene hat ergeben, dass verteilt über das gesamte Genom die Gencluster von 15 Polyketidsynthasen codiert sind170. Bisher konnten nur für fünf dieser Enzyme eine Beteiligung an der Biosynthese von Zearalenon, Aurofusarin, Fusarin C sowie an der Pigmentbildung in den Fruchtkörpern nachgewiesen werden. Die durch die verbleibenden 11 PKS-Enzyme produzierten Sekundärstoffe sind bisher nicht bekannt. Für die Aktivierung dieser stillen Biosynthesewege bieten sich verschiedene Herangehensweisen. Eine Möglichkeit liegt in der Kultivierung der Organismen unter OSMAC-Bedingungen. Durch die Variation der Kultivierungsbedingungen gelingt es vielmals diese Biosynthesewege zu aktivieren und so zu bisher nicht produzierten Substanzen des Sekundärstoffwechsels zu gelangen. Bei Aspergillus ochraceus gelang es auf diese Weise neben den unter Standardbedingungen produzierten Aspinonen 15 weitere Sekundärstoffe zu isolieren, die über fünf unabhängige Biosynthese-Wege gebildet werden171. Erneut lieferte die Genetik einen Beweis für die Richtigkeit dieses Ansatztes, indem bei Pilzen für die Sekundärstoffproduktion spezifische Transkriptionsfaktoren identifiziert werden konnten. Die Produktion dieser Proteine wird über einen komplexen Regulationsmechanismus gesteuert und geschieht unter anderem in Abhängigkeit der verfügbaren Nährstoffe und des pH-Werts. Erst wenn es in Zukunft gelingt, die Transkriptionsfaktoren von bisher inaktiven Biosyntheseclustern durch Sequenzierung der DNA zu identifizieren und weitere Kopien dieser Genabschnitte im Genom zu platzieren, könnte eine Aktivierung der ruhenden Biosynthesapparate auch ohne den OSMAC-Ansatz gelingen. Für die Aflatoxine konnte bereits gezeigt werden, dass es auf diesem Weg möglich ist, die Expression der Biosynthese-Proteine und damit die Produktion dieses Mycotoxins anzuregen172.
Der nicht vorhandene Anteil neuer Strukturen aus den in dieser Arbeit diskutierten Pilzen ist also nicht auf die Wahl der Organismen aus einer falschen Quelle zurückzuführen. Marine Mikroorganismen und im Besonderen endophytische Pilze liefern eine gute Grundlage für die Isolierung von interessanten Naturstoffen173. Die im biologisch-chemischen Screening erhaltenen Ergebnisse waren dementsprechend viel versprechend. Das Problem stellt die sehr zeitintensive Aufreinigung sowie spektroskopische Erfassung der Reinsubstanzen und damit die geringe Anzahl der bearbeiteten Pilze dar. Dies sei am Beispiel der aus
Beauveria sp.Stamm BS 6750 isolierten Decarestrictine veranschaulicht. Für die Kultivierung und Aufarbeitung des Stammes können ca. 4 Wochen veranschlagt werden. Für die Aufreinigung der Substanzen müssen eine Rohproduktsäule sowie zwei Trennungen an Sephadex LH-20 durchgeführt werden, was eine weitere Woche Arbeitszeit in Anspruch nimmt. Die Messung der NMR-Experimente (1H-, 13C-, COSY-, HSQC-, HMBC- und 2D-NOE-Spektren) veranschlagte eine reine Messzeit von ca. 24 Stunden und erfolgte über den Zeitraum einer Wochen. Die Auswertung der NMR-Spektren, die Suche nach Literatur, die Messung der IR- und MS-Spektren sowie die Bestimmung des Drehwerts benötigt bei Bearbeitung durch eine einzelne Person weitere drei Tage. Es muss also davon ausgegangen werden, dass von der Kultivierung bis zur Aufklärung einer literaturbekannten Struktur mindestens 6 Wochen vergehen. In vielen Fällen ist die tatsächlich benötigte Zeit aufgrund von parallel durchgeführten Arbeiten, Problemen bei der Trennung und Wartezeiten für die Messungen der NMR- und MS-Experimente wesentlich länger.
Es erscheint somit unumgänglich die Kriterien, die zur Kultivierung eines Stammes im großen Maßstab und zur Isolierung der Sekundärstoffe durch konventionelle Chramotographiemethoden führen, neu zu überdenken. Das Auffinden einer biologischen Aktivität in einem Rohextrakt oder einer interessanten Zone in einem Dünschichtchromatogramm wird wohl auch in Zukunft das erste Kriterium bleiben, wenn es darum geht das Biosynthese-Potential eines Organismus einzuschätzen. Allerdings sollte durch geeignete Methoden möglichst schnell überprüft werden, ob es sich bei den Hauptmetaboliten des Sekundärstoffspektrums tatsächlich um potentiell neue Sekundärstoffe handelt. Um eine Re-Isolierung von bekannten Verbindungen zu vermeiden bietet es sich an, auf gekoppelte Analytikverfahren zurückzugreifen. Die im Institut für Organische und Biomolekulare Chemie der Universität Göttingen derzeit verfügbaren technischen Möglichkeiten bieten dazu nur eingeschränkte Möglichkeiten. Zwar ist eine LC-MS-Analytik von Rohprodukten und angereicherten Fraktionen möglich, doch kann diese nur durch Kombination einer DAD-HPLC mit einer ESI-Ionenquelle und Quadrupol-Ionenfalle erfolgen. Die Aussagekraft der so erhaltenen Daten kann durch die zum Teil insuffiziente Ionisierung und die Ungenauigkeit der Molmassenbestimmung eingeschränkt. Eine Datenbank, mit der die erhaltenen korrelierten Daten abgeglichen werden können, ist nicht verfügbar. Auf diese Weise ist eine Isolierung der Sekundärstoffe im mg-Maßstab weiterhin unumgänglich, wenn eine eindeutige Struktur-Bestimmung durch NMR-Experimente erreicht werden soll. Bereits durch den Einsatz einer weiteren Ionenquelle, wie z. B. API, oder eines
Massenanalysators mit höherer Auflösung (vgl. Einleitung) könnte die Effizienz der LC-MS-Analytik von Sekundärstoffmischungen deutlich verbessert werden. Die Verwendung von LC-NMR und LC-MSn erscheint zum jetzigen Zeitpunkt aufgrund der hohen Kosten für die Anschaffung / Instandhaltung der Geräte und der Kinderkrankheiten dieser modernen Verfahren im universitären Betrieb nicht angebracht. Die Isolierung der Reinsubstanzen sollte nur dann durchgeführt werden, wenn ausgehend vom biologisch-chemischen Screening sowie einer verbesserten LC-MS-Analytik die Präsenz eines attraktiven Sekundärstoffs angenommen werden kann.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass endophytische Pilze und andere Mikroorganismen auch weiterhin eine viel versprechende Quelle neuer Naturstoffe repräsentieren. Man geht davon aus, dass heute nur ca. 1% der weltweit vorkommenden Mikroorganismen und Pilze isoliert und sogar nur 0.1% auf ihre Sekundärstoffproduktion überprüft wurden, so dass trotz allen Pessimismus der pharmazeutischen Industrie noch sehr viele neue Naturstoffe auf ihre Entdeckung warten. Aufgrund der enormen Diversität dieser Organismen, können die Auswahlkriterien für eine Bearbeitung nach konventionellen Methoden sehr eng gesteckt werden. Durch eine sorgfältigere Auswahl der zu bearbeiteten Spezies und eine weitere Verbesserung der Dereplikations-Techniken sollte in Zukunft der Anteil der neuen Naturstoffe erhöht und die Re-Isolierung bekannter Verbindungen verringert werden.