12.1 Sekundärstoffe aus Stamm BS 6612 Kultivierung und Aufarbeitung
Die Kultivierung wurde in P-Kolben unter Verwendung des Mediums G20+ durchgeführt.
Hierzu wurden fünf 5 L P-Kolben mit jeweils einem Liter des Nährmediums befüllt und mit einer Schaumstoffkappe verschlossen. Die P-Kolben wurden nach dem Autoklavieren mit jeweils einem fünftel einer ca. 2 Wochen alten Agarkultur inokuliert. Die Kultivierung erfolgte bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 28 d. Eine starke Luftmyzelbildung und ein pH-Wert von 5.4 wiesen auf eine ausreichende Kultivierungszeit hin.
Durch Zentrifugation wurden Myzel und Kulturfiltrat getrennt. Der Extrakt des Kulturfiltrats wurde erhalten indem dreimal mit jeweils 5 L Ethylacetat ausgeschüttelt, die vereinigten organischen Phasen im Vakuum eingeengt und der Rückstand lyophilisiert wurde. Für die Extraktion des Myzels im Ultraschallbad wurden zweimal 1 L Aceton verwendet. Erneut wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und lyophilisiert.
Isolierung von Aphidicolin (25)
Durch Waschen des Kulturfiltrat-Extraktes wurden die unlöslichen Bestandteile entfernt.
Hierfür gab man 2.0 mL Aceton zum Rohextrakt und extrahierte diesen für 5 min im Ultraschallbad. Der Überstand konnte nach Zentrifugation mittels einer Watte-gefüllten Pipette aufgenommen werden. Das Myzel-Extrakt wurde ebenfalls wurde für die Chromatographie vorbereitet indem er in jeweils 100 mL CHCl3/MeOH 9:1 bzw 4:1 aufgenommen und filtriert wurde. Die Rückstande konnten nach DC-Kontrolle (Kieselgel, CHCl3/MeOH 9:1) verworfen werden. Die löslichen Bestandteile führten anhand folgenden Schemas zu 25:
3. Sephadex LH-20 Aceton
4. Kieselgel CHCl3/MeOH Gradient 95:5 → 4:1
KF (65 mg)
73 60 mg 25
8 mg 25
5 mg Myzel (803mg)
Kieselgel CHCl3/MeOH Gradient 95:5 → 4:1
Sephadex LH-20 Aceton
Abbildung 51: Isolierungsschema der Sekundärstoffe aus n. b. Stamm BS 6612.
12.2 Sekundärstoffe aus Pleospora sp. Stamm BS 6631
Es wurde eine Festphasenkultivierung auf Agarplatten durchgeführt. Dazu verteilte man ca.
12 L des agarhaltigen Biomalz-Nahrmediums auf ca. 250 Agarplatten. Die Aufarbeitung erfolgte indem die Agarplatten lyophylisiert und anschließend dreimal mit 1 L Chloroform/Methanol 9:1 extrahiert wurden. Die vereinigten organischen Phasen wurden im Vakuum eingeengt. Der so erhaltene Rohextrakt wurde mittels Schwerkraftchromatographie (Kieselgel, CHCl3/MeOH 19:1) fraktioniert. Trennung der lipophilen Fraktion an Sephadex LH-20 (CH2Cl2/MeOH 1:1) ergab 12.5 mg 28 und 53.4 mg 73.
12.3 Sekundärstoffe aus Beauveria sp. Stamm BS 6750 Kultivierung und Aufarbeitung
Es erfolgte eine Kultivierung in den Medien Bio+ und SGG unter Verwendung von P-Kolben.
Es wurden jeweils 5 L Nährmedium angesetzt und in Portionen von 1L auf 5L P-Kolben verteilt. Diese wurden anschließend mit einer Schaumstoffkappe verschlossen, autoklaviert und mit einem Fünftel einer zwei Wochen alten Agarkultur (Biomalz) beimpft. Die Fermentation geschah unter Lichtausschluss bei einer Temperatur von 30 °C und führte in beiden Fällen zu einem ca. 0.5 cm dicken, an der luftzugewandten Seite weißen, Luftmyzel.
Der pH-Wert der stark gedunkelten Kulturbrühe betrug am Ende der 28-tägigen Kultivierungszeit 5.3(Bio+) bzw. 7.8 (SGG).
Die Aufarbeitung beider Ansätze erfolgte nach dem gleichen Verfahren. Das Kulturfiltrat konnte vom sehr festen Myzel durch Dekantieren getrennt werden und wurde durch Zugabe von 2 M HCl auf pH = 4.5 eingestellt. Die Extraktion mit Ethylacetat erfolgte dreimal mit dem 1.5fachen des KF-Volumens. Der so erhaltene Extrakt wurde im Vakuum eingeengt und anschließend lyophylisiert. Dreimaliger Aufschluss des Myzels mit 1.5 L Aceton im Ultraschallbad für 15 min lieferte nach dem Entfernen des Lösesmittels im Vakuum einen öligen Extrakt.
Isolierung der Sekundärstoffe Medium Bio+:
Aus dem Kulturfiltrat wurden anhand der in Abbildung 52 dargestellten Reinigungsschritte die in Kapitel 3.3 angegebenen Reinsubstanzen isoliert. Die Chromatographie des Myzelextrakts erfolgte an Kieselgel unter Verwendung eines Eluentgradienten (Chloroform/Metanol 9:1 → 4:1) und führte zu 378 mg Ergosterol (73).
Kieselgel
Abbildung 52: Isolierungschema der Sekundärstoffe von Beauveria sp. Stamm BS 6750 aus der P-Kolben-Kultivierung im Nährmedium Bio+.
Medium SGG:
Anhand der in Abbildung 53 dargestellten Reinigungsschritte führten der Extrakt des Kulturfiltrats und des Myzels zu den in Kapitel 3.3 beschriebenen Reinsubstanzen.
31
Abbildung 53: Isolierungschema der Sekundärstoffe von Beauveria sp. Stamm BS 6750 aus der P-Kolben-Kultivierung im Nährmedium SGG.
12.4 Sekundärstoffe aus Phoma sp. Stamm BS 6771 Kultivierung und Aufarbeitung
Es wurden insgesamt 12 L Biomalz-Nährmedium aufgeteilt auf ca. 250 Agarplatten verwendet. Die Kultivierung erfolgte über einen Zeitraum von 28 Tagen bei Raumtemperatur.
1. Kieselgel CHCl3/MeOH Gradient 19:1 → 4:1 2. Sephadex LH-20
MeOH Extrakt aus 12 L Agarkultur
73
64 mg 50 124.5
Nachdem die Agarplatten lyophilisiert worden waren, erfolgte eine dreifache Extraktion mit je 1 L Ethylacetat/Methanol (9:1). Anschließend wurde der Extrakt im Vakuum eingeengt.
Isolierung der Sekundärstoffe
Der Extrakt wurde der in Abbildung 54 dargestellten Chromatographie unterzogen.
Abbildung 54: Isolierungschema der Sekundärstoffe aus Phoma sp. Stamm BS 6771.
12.5 Sekundärstoffe aus Chaetomium sp. Stamm Gö 212
Die Kultivierung erfolgte im 4 L-Maßstab in P-Kolben unter Verwendung des Nährmediums G20. Hierzu wurde das Nährmedium auf vier 5 L P-Kolben verteilt, diese mit einer Stoffkappe verschlossen und anschließend autoklaviert. Die Inokulation der Kolben erfolgte jeweils mit einem Viertel einer gut bewachsenen und ca. 3 Wochen alten Agarplatte (Bio+) des Stamms. Die Fermentation erfolgte über einen Zeitraum von 28 Tagen und wurde bei Raumtemperatur unter Tageslicht durchgeführt. Das schwarze Kulturfiltrats wurde vom weißen Myzel durch Zentrifugation getrennt. Der pH-Wert des Kulturfiltrats betrug 7.2 und machte somit vor der dreifachen Extraktion mit dem gleichen Volumen an Ethylacetat das Ansäuern (2 M HCl) auf pH = 4.5 notwendig. Der erhaltene Extrakt wurde im Vakuum eingeengt und anschließend lyophylisiert. Zur Extraktion des Myzels wurde dieses zweimal mit 1 L Aceton im Ultraschallbad aufgeschlossen. Nach dem Entfernen des Lösesmittels wurde ein öliger Myzelextrakt erhalten, welcher aufgrund des hohen Fettgehalts nicht lyophylisiert werden konnte.
Die Sekundärstoffe wurden aus den Extrakten erhalten indem diese jeweils an Kieselgel (Chloroform/Methanol 9:1 → 4:1) chromatographiert wurden. Die mit 59 angereicherten Fraktionen wurden in Chloroform/Methanol 1:1 umkristallisiert. Aus dem Kulturfiltrat wurden 305 mg, aus dem Myzel 1192 mg 59 isoliert werden, was einer Ausbeute von 374 mg/L Kulturbrühe entspricht.
12.6 Sekundärstoffe aus Nodulisporium sp. Stamm Gö 223
Das Ansetzen der Kulturen erfolgte analog zu Chaetomium sp. Gö 212. Es wurde jeweils einmal mit den Medien E2 und 1158 im 5 L-Maßstab kultiviert. Die Kultivierungszeit wurde auf 21 Tage verkürzt, da Nodulisporium sp. Gö 223 ein schnelleres Wachstum zeigte. Alle anderen Fermentationsbedingungen wurden beibehalten. Die dunkelbraune Kulturbrühe war zum Zeitpunkt der Ernte mit lückenhaft mit einem weißen Luftmyzel bedeckt und hatte einen pH-Werte von 7.3 (E2) bzw. 7.4 (1158). Die Aufarbeitung erfolgte wie für Chaetomium sp.
Gö 212 beschrieben. Um die stark lipophilen Substanzen aus den Extrakten zu entfernen wurden diese in 100 mL kaltem Pentan aufgenommen und filtriert. Für die weiteren Arbeiten wurden nach DC-Kontrolle nur die in Pentan unlöslichen Rückstände verwendet. Aufgrund der sehr ähnlichen Zusammensetzungen der Extrakte aus den beiden Fermentationsansätzen wurden diese zwar separat aber unter Verwendung der gleichen Chromatographietechniken aufgetrennt (vgl. Abbildung 55). Da die Auswaage der Rohextrakte sehr hoch war wurden jeweils nur ca. 2.5 g für die Chromatographie verwendet. Man erhielt die in Tabelle 11 angegeben Mengen der Reinsubstanzen. Die nicht verwendeten Reste der Rohextrakte wurden vereinigt und führten nach Chromatographie an Kieselgel (CH3Cl/MeOH 6:1) und Gelchromatographie an Sephadex LH-20 (MeOH) zu 7.6 mg 72.
Tabelle 11: Aus Nodulisporium sp. Stamm Gö 223 isolierte Sekundärstoffe und auf den Gesamtansatz hochgerechnete Ausbeute.
72 60 75 74 76 Kulturfiltrat
(9.8 g)
1.1 mg 40.2 mg 4.9 mg 1.3 mg 10.9 mg Myzel
(16.8 g)
0.7 mg x x x x
Medium E2 Ausbeutea 1.8 mg/L 31.5 mg/L 3.9 mg/mL 1.0 mg/mL 8.5 mg/L
Kulturfiltrat
(5.7)b 0.9 mg 19.8 mg 4.2 mg 3.5 mg x
Myzel (12.6)b
0.5 mg x x x x
Medium 1158 Ausbeutea 0.9 mg/L 18.3 g/L 1.9 mg/mL 1.6 mg/,L x
x = nicht bestimmt; a Summe aus Kulturfiltrat- und Myzelextrakt; b nach Entfettung
74
KF-Extrakt Myzelextrakt
1. Kieselgel CHCl3/MeOH Gradient 9:1 → 4:1 2. LH-20
Aceton
72 76
75 60
72
LH-20 MeOH
Mitteldruck RP18 Aceton/H2O 1:1 1. LH-20
MeOH 2. LH-20 Aceton Kieselgel CHCl3/MeOH Gradient 9:1 → 4:1
Abbildung 55: Isolierungschema P-Kolben von Nodulisporium sp. Stamm Gö 223 (LH-20 = Sephadex LH-20).