7.1. Zusätzlich benötigtes Material
• Destilliertes Wasser
• Natriumhypochlorit (Natronbleichlauge) und Natriumbicarbonat
• Saugfähige Papiertücher
• Einweghandschuhe
• Klebefolie
• Schutzbrille
• Einwegröhrchen
• Automatische oder halbautomatische Pipetten oder Multipipetten, variabel oder fest, zum Abmessen und Verteilen von 25 µl, 75 µl, 80 µl und 100 µl
• Zylinder mit Maßeinteilung für 25 ml, 100 ml und 1000 ml. Rührgerät Typ Vortex
• Automatisches, halbautomatisches oder manuelles Mikrotiterplatten-Waschsystem (*)
• Wasserbad oder entsprechender Mikrotiterplatten-Inkubator, mit Thermostat auf 37 °C ± 1 °C einstellbar (*)
• Behälter für infektiösen Abfall.
• Mikrotiterplatten-Lesegerät, mit 450 nm-, 490 nm- und 620-700 nm-Filtern ausgestattet (*) (*) Genaue Auskunft über empfohlene Geräte erteilt Ihnen unser Technischer Service.
7.2. Vorbereitung der Reagenzien
7.2.1. Gebrauchsfertige Reagenzien Reagenz 1 (R1): MikrotiterplatteJeder Rahmen mit 12 Streifen ist in einem versiegelten Folienbeutel verpackt. Den Beutel mit einer Schere oder einem Skalpell 0,5 - 1 cm über der Versiegelung abschneiden. Den Beutel öffnen und den Rahmen herausnehmen. Die unbenutzten Streifen wieder in den Beutel zurückgeben. Den Beutel sorgfältig verschließen und bei +2-8 °C lagern.
Reagenz 3 (R3): Negative Kontrolle
Reagenz 4 (R4): Anti-HIV-positive Kontrolle Reagenz 5 (R5): HIV Ag-positive Kontrolle Reagenz 6 (R6): Konjugat 1
Reagenz 10 (R10): Stopplösung
7.2.2. Zu rekonstituierende Reagenzien:
Reagenz 2 (R2): Waschlösung (20-fach konzentriert)
Um die gebrauchsfertige Waschlösung herzustellen, im Verhältnis 01:20 mit destilliertem Wasser verdünnen.
800 ml für eine Platte mit 12 Streifen vorbereiten.
Reagenz 7a (R7a) + Reagenz 7b (R7b): Arbeitslösung von Konjugat 2
Das Fläschchen mit dem lyophilisierten Konjugat 2 (R7a) vorsichtig auf die Arbeitsfläche klopfen, um Rückstände am Gummiverschluss zu lösen.
Den Verschluss vorsichtig abnehmen und den Inhalt eines Fläschchens mit Konjugatverdünnungsmittel (R7b) in das Fläschchen mit dem lyophilisierten Konjugat (R7a) füllen. Das Fläschchen verschließen, 10 Minuten stehen lassen und von Zeit zu Zeit behutsam schütteln und wenden, um die Auflösung zu beschleunigen.
Reagenz 8 (R8) + Reagenz 9 (R9): Enzymentwicklungslösung:
Das Chromogen (R9) 1:11 in Substratpuffer (R8) verdünnen (z. B. 1 ml Reagenz R9 + 10 ml Reagenz R8).
Für 12 Streifen werden 10 ml benötigt. Homogenisieren.
7.3. Testverfahren
Das Testverfahren strikt befolgen.Verwenden Sie zum Validieren der Testergebnisse für jede Messreihe die negative (R3), die Anti-HIV-1-positive (R4) sowie die HIV-Ag-Anti-HIV-1-positive (R5) Kontrolle.
Es sind folgende GLP-Richtlinien einzuhalten:
1) Probenverteilung und Identifikationsplan sorgfältig festlegen.
2) Die verdünnte Waschlösung R2 und die Konjugat-2-Arbeitslösung (R7a + R7b) vorbereiten (siehe 7.2).
3) Den Rahmen und die benötigte Anzahl an Streifen (R1) aus der Schutzpackung nehmen.
Unbenutzte Streifen zurück in die Packung geben. Den Beutel verschließen und bei +2-8 °C lagern.
4) Die Verteilung in den Vertiefungen erfolgt in dieser Reihenfolge (empfohlene Plattenverteilung), ohne die Platte vorher zu waschen:
• 25 µl Konjugat 1 (R6) in jede Vertiefung
• 75 µl der HIV-Ag-positiven Kontrolle (R5) in Vertiefung A1
• 75 µl der Anti-HIV-positiven Kontrolle (R4) in Vertiefung B1
• 75 µl der negativen Kontrolle (R3) in die Vertiefungen C1, D1 und E1
• 75 µl Probe 1 in Vertiefung F1
• 75 µl Probe 2 in Vertiefung G1, etc.
Das Reaktionsgemisch durch mindestens 3-faches Aufsaugen mit einer 75-µl-Pipette oder durch Schütteln der Mikrotiterplatte für 5 Sekunden homogenisieren. Die Proben müssen sofort nach Pipettieren von Konjugat 1 verteilt werden. Wenn die Verteilung der Proben länger als 30 Minuten dauert, empfiehlt es sich, die negativen und positiven Kontrollen nach den zu testenden Proben in die Vertiefungen zu geben.
Je nach System ist es möglich, die Position der Kontrollen oder die Verteilungsreihenfolge zu verändern.
ANMERKUNG: Nach der Verteilung der Proben wechselt die Farbe in der Vertiefung mit Konjugat 1 zu gelb-grün bis blau. Das Vorhandensein von (Probe + Konjugat 1) in den Vertiefungen kann spektrophotometrisch bei 620 nm gelesen werden (siehe Abschnitt 7.7).
5) Sofern möglich, die Mikrotiterplatte mit frischer Klebefolie abdecken.
6) Die Mikrotiterplatte 1 Stunde (± 4 Min.) bei 37 °C ± 1 °C inkubieren.
7) Den Klebefilm ggf. entfernen. Den Inhalt aller Vertiefungen in ein Behältnis für infektiösen Abfall absaugen (Behälter sollte Natriumhypochlorit enthalten). In jede Vertiefung mindestens 0,370 ml Waschlösung geben. Mindestens 30 Sekunden einwirken lassen. Erneut absaugen. Diesen Vorgang mindestens zwei Mal wiederholen (d. h. es werden insgesamt 3 Waschdurchgänge durchgeführt). Das Restvolumen muss weniger als 10 µl betragen (die Platte ggf. trocknen, indem sie auf einem saugfähigen Papier umgedreht wird). Wenn ein automatisches Waschgerät verwendet wird, auf dieselbe Weise vorgehen.
8) In jede Vertiefung der Platte rasch 100 µl Konjugat 2 (R7a + R7b) pipettieren. Vor der Verwendung muss das Konjugat vorsichtig geschüttelt werden. Gegebenenfalls mit frischer Klebefolie abdecken und 30 Minuten (± 4 Min.) bei Raumtemperatur (18-30 °C) inkubieren.
ANMERKUNG: Das Konjugat 2 ist rot. Das Vorhandensein von Konjugat 2 in den Vertiefungen kann spektrophotometrisch bei 620 nm überprüft werden (siehe Abschnitt 7.7).
9) Die ggf. vorhandene Folie entfernen, den Inhalt aller Vertiefungen absaugen und wie oben beschrieben mindestens fünfmal waschen.
10) Die Enzymentwicklungslösung (R8+R9) vorbereiten.
11) 80 µl der vorbereiteten Enzymentwicklungslösung (R8 + R9) schnell in jede Vertiefung pipettieren. Für die Entwicklung der Reaktion die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur (18-30 °C) (18-30 Minuten (± 4 Min.) stehen lassen.
Während dieser Inkubation keine Klebefolie verwenden
.ANMERKUNG: Die Verteilung der pinkfarbenen Entwicklungslösung kann bei diesem Schritt optisch kontrolliert werden: Es gibt einen deutlichen Farbunterschied zwischen leeren Vertiefungen und Vertiefungen, die bereits pinkfarbene Entwicklungslösung enthalten (siehe Abschnitt 7.7).
12) Rasch 100 µl Stopplösung (R10) in der gleichen Reihenfolge und Verteilungsmenge wie die Entwicklungslösung zugeben.
ANMERKUNG: Die Verteilung der farblosen Stopplösung kann bei diesem Schritt optisch kontrolliert werden:
Die Substratfarbe (pink bei negativen Proben bzw. blau bei positiven Proben) verblasst in den Vertiefungen, die nach Zugabe von Stopplösung farblos (negative Proben) oder gelb (positive Proben) werden.
13) Den Boden der Platte sorgfältig abwischen. Bis zum Ablesen des Ergebnisses nach Zugabe der Stopplösung mindestens 4 Minuten warten, die optische Dichte jedoch innerhalb von 30 Minuten nach Stoppen der Reaktion mit einem Plattenleser bei 450/620-700 nm ablesen.
14) Alle Ergebnisse hinsichtlich der Übereinstimmung zwischen den spektrophotometrischen und den visuellen Messungen sowie gegen die Platten- und Probenverteilung und die Identifikationspläne prüfen.
7.4. Qualitätskontrolle
Bei jedem Testdurchgang Positiv- und Negativkontrollen verwenden, um den Test zu validieren (siehe Abschnitt 7.5).
7.5. Kriterien für die Testvalidierung
Dieser Test ist valide, wenn die folgenden Bedingungen erfüllt sind:
1) Bzgl. der Negativkontrolle R3
Die Extinktion jeder negativen Kontrolle (R3) muss kleiner als 0,170 sein:
OD R3 < 0,170
Die mittlere Extinktion der negativen Kontrollen (R3) muss kleiner als 0,150 sein:
OD R3 < 0,150
Liegt eine negative Kontrolle außerhalb dieses Bereiches, muss diese ignoriert und der Mittelwert aus den zwei übrigen Werten berechnet werden.
2) Bzgl. der HIV-Antikörper-Positivkontrolle R4
Die Extinktion der HIV-Ab-positiven Kontrolle (R4) muss größer als 0,9 sein:
OD R4 > 0,9
3) Bzgl. der HIV-Antigen-Positivkontrolle R5
Die Extinktion der HIV-Ag-positiven Kontrolle (R5) muss größer als 0,9 sein:
OD R5 > 0,9
7.6. Berechnung/Interpretation der Ergebnisse
Der Grenzwert wird mit der Negativkontrolle (R3) bestimmt:Den Mittelwert der gemessenen Absorptionswerte für die Negativkontrolle (R3) berechnen.
OD (C1) + OD (D1) + OD (E1) OD R3 = —————————————
3 Den Grenzwert berechnen:
Grenzwert = OD R3 + 0,200
Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von HIV-Antigen oder HIV-1- bzw. HIV-2-Antikörpern wird durch den Vergleich der gemessenen Extinktion jeder Probe mit dem berechneten Grenzwert ermittelt.
Für jede Probe wird folgender Quotient berechnet:
Quotient = OD der Probe/Grenzwert
Proben, deren optische Dichte unter dem Grenzwert liegt (Quotient < 1), werden für negativ mit dem Genscreen™ ULTRA HIV Ag Ab befunden.
Ergebnisse knapp unterhalb des Grenzwerts (Grenzwert-10 % < OD < CO) sind allerdings mit Vorsicht zu interpretieren. Die entsprechenden Proben sollten in Doppelbestimmung erneut getestet werden, sofern die Systeme und Laborverfahren dies erlauben.
Proben, deren optische Dichte am oder über dem Grenzwert liegt (Quotient ≥ 1), werden für initial positiv mit dem Genscreen™ ULTRA HIV Ag-Ab befunden. Diese Proben sollten vor der endgültigen Interpretation erneut in Doppelbestimmung getestet werden.
Ist der Probenquotient mindestens einer Doppelbestimmung nach der Testwiederholung größer oder gleich 1, ist das anfängliche Ergebnis wiederholbar und die Probe gilt als positiv im Genscreen™ ULTRA HIV Ag-Ab. Ist der Probenquotient der Doppelbestimmungen kleiner als 1, ist das anfängliche Ergebnis nicht wiederholbar und die Probe gilt als negativ.
Nicht wiederholbare Reaktionen haben häufig folgende Ursachen:
• Nicht korrekt durchgeführte Waschgänge der Mikrotiterplatten,
• Kontamination negativer Proben durch Serum oder Plasma mit hoher Antikörperkonzentration,
• Kontamination der Substratlösung durch Oxidationsmittel (Bleiche, Metallionen etc.)
• Verunreinigung der Stopplösung.
Die Proben, die zweimal neu getestet und im Genscreen™ ULTRA HIV Ab-Ag negativ waren, bei denen aber ein Wert nahe dem Grenzwert liegt (Quotient zwischen 0,9 und 1) sollten unter Vorbehalt interpretiert werden. Der Patient sollte mit einer anderen Methode erneut getestet bzw. eine andere Probe getestet werden.
Bei einer sehr niedrigen optischen Dichte getesteter Proben (negative OD) und bei Überprüfung des Vorhandenseins von Proben und von Reagenz können die Ergebnisse als negativ interpretiert werden.
Es wird empfohlen, die positiven Proben nach den aktuellen nationalen Leitlinien und Algorithmen zu bestätigen.
7.7. Spektrophotometrische Überprüfung der Proben- und Konjugatpipettierung (optional)
Überprüfung der Pipettierung von Probe und Konjugat 1 (R6):
Das gleichzeitige Vorhandensein von Konjugat 1 (R6) und der Proben in der Vertiefung kann durch automatisches Ablesen bei 620 nm überprüft werden.
Jede Vertiefung, die Probe und Konjugat 1 (R6) enthält, muss eine OD über 0,600 aufweisen.
Überprüfung der Pipettierung der Arbeitslösung von Konjugat 2
Das Vorhandensein von Konjugat 2 (R7a + R7b) in den Vertiefungen kann durch automatisches Lesen bei 450/620 nm überprüft werden. Bei jeder Vertiefung muss der OD-Wert über 0,100 liegen (ein niedrigerer OD-Wert weist auf mangelhaftes Pipettieren des Konjugats hin).
Überprüfung der Pipettierung der Entwicklungslösung
Das Vorhandensein von pinkfarbener Entwicklungslösung in den Vertiefungen kann durch automatisches Ablesen bei 490 nm überprüft werden:
Bei einer Vertiefung, die Entwicklungslösung enthält, muss die OD über 0,100 liegen (eine niedrigere OD weist auf eine unzureichende Pipettierung der Entwicklungslösung hin).