2. THEORETISCHER HINTERGRUND
2.6. Verwendung chromatographischer Trenntechniken für die Matrix Kakao
mittels NP-LC-online-DPPH
Neben dem kolorimetrischen DPPH-Assay zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität von Lebensmittelproben als Summenparameter, können auch einzelne oligomere PA und deren antioxidative Kapazität bestimmt werden. Mittels NP-LC-online-DPPH werden oligomere PA im ersten Schritt chromatographisch voneinander getrennt und in einem zweiten Schritt über
40 eine Nachsäulenderivatisierung ihre antioxidative Kapazität ermittelt. Die Bestimmung mittels NP-LC-online-DPPH erlaubt es, einzelne PA in ihrer gesamten Matrix zu bewerten.
Die in dieser Arbeit angewandte Methode lehnt sich an dem LC-online-TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) Grundaufbau nach Koleva et al. (2001) an. Hierbei wurden Pflanzenextrakte über ein RP-LC System injeziert und deren antioxidative Kapazität mittels Nachsäulenderivatisierung über ABTS bestimmt. Bei der LC-online-TEAC Methode wird auf den Gebrauch eines internen Standards zurückgegriffen, wobei Trolox als relative Bezugsgrösse zur Berechnung herangezogen wird (Riehle et al., 2013). Phenolische Substanzen werden somit als Troloxäquivalente wiedergegeben. Die Verwendung eines internen Standards wird häufig zur Quantifizierung eingesetzt, wobei er nicht nur die Qualität des Verfahrens einschätzen soll, sondern auch eventuelle Probenverluste während des Analysenverfahrens. Die Konzentration des Analyten kann über die Wiederfindungsrate des internen Standards korrigiert werden und so systematische oder zufällige Fehler aufdecken.
Die qualitative Bestimmung von PA mittels RP-Säulen gestaltet sich als schwierig, da sie wegen ihrer Grösse und ihren komplexen Verzweigungsstellen nur ungenügend mit dem Säulenmaterial wechselwirken und eine Separation deswegen unmöglich macht (Hellström und Mattila, 2008). Für die Separation von oligomeren PA werden NP-Säulen herangezogen, wobei PA hier in ihre homologe Reihe von PG = 1 bis PG 10 voneinander getrennt werden können (Rigaud et al., 1993; Hammerstone et al., 1999; Gu et al., 2002; Robbins et al., 2009;
Robbins et al., 2012).
Die nun voneinander getrennten PA werden in eine Reaktionskapillare geleitet, in der die beschriebenen Reaktionen stattfinden. Durch die Wasserstoff- und Elektronenübertragung kommt es zu einem Abbau des violetten DPPH-Radikals, welches bei einer Wellenlänge von 515 nm gemessen werden kann. Vordergründig werden zwei Signale detektiert und in der Software verarbeitet, wobei ein positives Signal bei 280 nm für die Bestimmung der oligomeren PA steht und ein negatives Signal bei 515 nm die antioxidative Kapazität der isolierten PA wiedergibt.
2.6.2. Fraktionierung oligomerer Proanthocyanidine mittels semipräparativer NP-LC
Eine Methode zur vollständigen Identifizierung phenolischer Substanzen stellt die Isolierung mittels semipräparativer NP-LC und anschliessender Charakterisierung mittels LC-MS dar.Auf Basis des zuvor beschriebenen analytischen Systems kann über ein up-scaling eine semipräparative LC aufgestellt werden. Hierbei können die gesammelten Fraktionen
41 aufgefangen und für weitere Analysenzwecke bereitgestellt werden. Dafür muss sowohl die Probenaufarbeitung, die Probenbeladung und die anschließende Fraktionierung auf das semipräparative NP-LC angepasst werden.
2.6.3. Fraktionierung phenolischer Substanzen mittels SCPC
Eine Möglichkeit der präparativen Fraktionierung und Isolierung wurde mittels Zentrifugaler Gegenstromverteilungschromatographie durchgeführt. Diese Trenntechnik wird vor allem zur Aufreinigung, Fraktionierung und Isolierung von labilen Naturstoffreagenzien eingesetzt. Die erste Anlage für die Gegenstromverteilungschromatographie (engl. counterurrent chromatography, CCC) wurde in den 60er Jahren zur Isolierung von Lymphozyten entworfen (Ito et al. 1966) und seitdem stetig weiterentwickelt. Wobei verschiedene Firmen wie Dynamics Extractions (UK), Armen Instruments (Saint-Avé, Frankreich) und Kromaton Technologies (Frankreich) sie zu einem schnellen, robusten und skalierbaren Instrument macht, welches langsam seinen Weg in die industrielle Produktion gefunden hat (Sutherland, 2007). Im Allgemeinen wird zwischen einer chromatographischen Trennung mit einer hydrodynamischen Säule (CCC-Chromatographie) respektive einer hydrostatischen Säule (CPC-Chromatographie) (engl. centrifugal partition chromatography, CPC) unterschiedenen (Sutherland et al., 2008).
Für eine CPC Trennung gebraucht man den üblichen LC-Geräteaufbau, wobei die LC-Säule von der hydrostatischen Säule ersetzt wird (Abbildung 20). Die CPC-Säule besteht aus vielen aneinander gereihten identischen Scheiben, die übereinandergestapelt sind. Jede Scheibe besteht aus einer in Serie miteinander verbundenen eingravierten kleinen Zellen.
Die letzte Zelle der einen Scheibe ist mit der ersten Zelle der nächsten Scheibe verbunden.
Die Säule wird auf einen Zentrifugenrotor platziert.
42 Abbildung 20: Aufbau einer SCPC-Anlage.
Die stationäre und mobile Phase kann durch die LC-Pumpe über Rotationsdichtungen in das System hineingepumpt werden. Hat man ein geeignetes Lösungsmittelsystem gefunden, wird die Säule zuerst mit der stationären Phase befüllt. Der Rotor wird gestartet und nachdem die Flussrate, sowie die Umdrehungszahl eingestellt wurden, kann die Säule mit der mobilen Phase befüllt werden. Die mobile Phase beginnt die stationäre Phase zu verdrängen, bis sich ein Gleichgewicht einstellt. Nach diesem Moment wird keine stationäre Phase mehr aus der Säule gespült, da diese von der Zentrifugalkraft im Rotor gehalten wird.
Die Probe kann nun injiziert werden. Die Analyten in der Probe durchlaufen die in Serie verbundenen Zellen, wobei die Trennung auf Verteilungsvorgängen des Analyten in dem Lösungsmittelsystem basiert. Im Detail kommt es hierbei zu permanenten Mischungs- und Entmischungsvorgängen der mobilen Phase mit der stationären Phase. Aus dieser Verteilung des Analyten zwischen mobiler und stationärer Phase resultieren tausende Verteilungsvorgänge pro Stunde. Die theoretische Bodenzahl N kann als Funktion der Flussrate der mobilen Phase wiedergegeben werden, wobei bei dem in der Arbeit verwendeten System (siehe Anhang) mit einer Flussrate von ca. 2 mL/min eine Bodenzahl N von ca 400 - 600 besteht (Rodrigues et al., 2015).
Eine erfolgreiche Trennung hängt mit der Auswahl eines geeigneten Lösungsmittelsystems zusammen (Winterhalter, 2007). Die Grundanforderung stellt in erster Linie ein Lösungsmittelsystem, bestehend aus zwei nicht miteinander mischbaren Flüssigkeiten, dar.
Eine Auswahl an typischen Zweiphasen Systemen sind Mischungen aus
Hexan-Ethylacetat-43 Methanol-Wasser oder MTBE-n-Butanol-Acetonitril-Wasser (Ito, 2005; Oka et al., 1991).
Darüber hinaus sollen die Zielanalyten unterschiedliche Verteilungskoeffizienten im System besitzen. Bei der Gegenstromverteilungschromatographie gilt das Nernst‘sche Verteilungsgesetzt. Damit sich ein Analyt optimal auftrennt, sollte der Verteilungskoeffizient k zwischen 0,5 und 1,5 liegen. Ist der Verteilungskoeffizient kleiner 0,5, kommt es zu einer verkürzten Trennzeit in der Säule und zu einer mangelhaften Auftrennung der Analyten. Ist der Verteilungskoeffizient größer, bleibt der Analyt länger in der Säule, wodurch es zu einer Peakverbreiterung kommt.
m s
c k = c
C stationäre Phase = Konzentration des gelösten Stoffes in der stationären Phase C mobile Phase = Konzentration des gelösten Stoffes in der mobilen Phase
Daneben ist der Verteilungskoeffizient abhängig vom verwendeten Lösungsmittelsystem, wobei hier zwischen zwei Elutionsmodi unterschieden wird. Beim descending Modus fungiert die Phase mit der geringeren Dichte als stationäre Phase und die mit der grösseren Dichte als mobile Phase. Beim ascending Modus verhält es sich umgekehrt. Vergleichbar sind diese Einstellungen mit der Einteilung eines LC-Systems in Normalphasen- und Umkehrphasenchromatographie, wobei im häufig verwendeten descending Modus ein unpolares Lösemittel als stationäre Phase und ein schweres wässriges Lösemittel als mobile Phase dient.
Die gesammelten Fraktionen wurden den jeweiligen UV-Signalen im Chromatogramm zugeordnet, miteinander vermengt und anschließend gefriergetrocknet. Die Reinheit der resultierenden Feststoffe wurde mittels Referenzsubstanzen abgeglichen und mittels LC-DAD-ESI-MS überprüft. Die verwendeten Geräteparameter des SCPC-Systems sind im Anhang aufgeführt.
2.6.4. Isolierung individueller oligomerer PA mittels Gelpermeationschromatographie
Trotz der vielen Vorteile der SCPC, gestaltet es sich schwierig einzelne Probenkomponenten aus einer komplexen Matrix zu isolieren. Im Allgemeinen dient die SCPC vor allem der verlustfreien und schonenden Aufreinigung des gefriergetrockneten Kakaoextraktes und ermöglicht somit eine Vorfraktionierung von Probenkomponenten. Deswegen wurde in einem nachgeschalteten Schritt, die aus der SCPC gewonnen Vorfraktionen weiter mittels Gelpermeationschromatographie und Sephadex LH-20, aufgereinigt. Der zweite Schritt dient somit der weiteren Auftrennung einzelner Probenkomponenten, um sowohl die Ausbeute als auch die Reinheit zu erhöhen (Green und Cousineau, 1980; Kantz und Singleton, 1991). Die44 für die Auftrennung der einzelnen oligomeren PA verwendeten Geräteparameter der Gelpermeationschromatographie sind im Anhang aufgeführt.
2.6.5. Identifizierung monomerer Polyphenole mittels LC-DAD-ESI-MS
Die Flüssigkeitschromatographie wird in 65% aller Methoden zur Polyphenolanalytik angewandt (Kartsova & Alekseeva, 2008), da sie eine höhere Detektionsempfindlichkeit von komplexen Matrizes garantiert. Die Analytik der Polyphenole wurde im Rahmen dieser Arbeit mittels LC-DAD-ESI-MS betrieben. Auf Basis ihrer Struktur, können aromatische Verbindungen, wie Polyphenole durch UV/Vis-Anregung, qualitativ in ihre jeweiligen Substanzklassen eingeteilt werden. Bei der UV/Vis-Spektroskopie wird über delokalisierte Elektronenpaare, die bei konjugierten Doppelbindungen am A- und C-Ring vorkommen, Energie aufgenommen, wobei die angeregten Valenzelektronen vom bindenden in ein antibindendes Orbital wechseln, was ein ʌ ĺ ʌ* Übergang zur Folge hat. Beim Verlassen des antibindenden Orbitals zurück in das bindende, kann Extinktionsenergie gemessen werden. Diese Extinktionsenergie ist jeweils individuell für die jeweilige polyphenolische Substanzklasse, wobei ein Emissionsspektrum charakteristisch für eine Polyphenolklasse steht. Ein typisches UV/Vis-Spektrum von Flavonoiden beinhaltet zwei Absorbionsbanden.
Im Detail zeigen Flavone in methanolischer Lösung eine Absorption zwischen 310 - 350 nm (Bande I) und bei 250-280 nm (Bande II). Die Bande I wird dem B-Ring und Bande II dem A-Ring zugeordnet. Flavan-3-ole absorbieren hingegen zwischen 270-290 nm (Bande I) und bei 220 - 240 nm (Tsimogiannis et al., 2007). Zusätzliche Informationen über den C-Ring können hieraus nicht abgeleitet werden. Die Detektion der Flavan-3-ole erfolgte somit mittels DAD bei einer Wellenlänge von Ȝ = 280 nm, die Gruppe der Flavonole wurde bei Ȝ = 320 nm und die Gruppe der Anthocyane bei Ȝ = 520 nm gemessen.
Innerhalb der LC-MS-Analytik werden monomere phenolischen Substanzen sowohl im positiven als auch im negativen Modus gemessen. Generell gelten für Messungen im negativen Modus ein niedrigeres Hintergrundrauschen und dadurch verbunden eine empfindlichere und sensitivere Messung (Watson, 2014). Dahingegen kann bei Anwesenheit von Methoxyl-, Hydroxyl- oder Polymethoxylflavonen nur im positiven Ionenmodus gemessen werden. Gleiches gilt für positiv geladene Anthocyane im niedrigen pH-Bereich (Watson, 2014). Zur Identifizierung unbekannter monomerer phenolischer Subtanzen wurde in dieser Arbeit im positiven Fullscanmodus zwischen m/z = 100 - 2000 Dalton (Da).
gemessen.
Zur massenspektroskopischen Identifizierung von kondensierten phenolischen Substanzen wurde ebenso im positiven Ionenmodus gemessen, wobei hier im selected ion modus
45 gemessen wurde. Durch den limitierten Scanbereich können nur PA mit einem PG 5 bestimmt werden. Die verwendeten Geräteparameter des LC-DAD-ESI-MS-Systems sind im Anhang angegeben.
2.6.6. Quantifizierung monomerer Polyphenole mittels LC-DAD-ESI-MS
Für die Quantifizierung monomerer Polyphenole im Kakaoextrakt wurden kommerzielle Referenzsubstanzen mit einer Konzentration von 1 mg/mL hergestellt. Dafür wurden die meisten Referenzsubstanzen in Methanol gelöst, wohingegen die schwer wasserlöslichen Flavonole, Flavone, Flavanone und das wasserunlösliche Theobromin in DMSO gelöst wurden. Die quantitative Bestimmung erfolgte mittels externer Kalibrationsgeraden mittels der jeweilige Referenzsubstanz (s. Anhang). Die Kakaoproben wurden dreifach aufgearbeitet und analysiert. Die Ergebnisse sind entsprechend als Mittelwert und zugehörige Standardabweichung der Dreifachbestimmung dargestellt.
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