2. THEORETISCHER HINTERGRUND
2.4. Kolorimetrische Messmethoden
33
2.3.6. Conchieren
Die Kakaobohnen werden durch Walzen in Kakaonibs gebrochen und weiter zur Kakaomasse verarbeitet. Durch das intensive Walzen wird das Zellgewebe zerstört und die Kakaobutter wird freigelegt. Beim Conchieren wird die Schokolade umgerührt und erwärmt, wobei Aromastoffe zusätzlich aus dem Fett herausgelöst und von Zuckerpartikeln aufgenommen werden, was den Geschmack harmonischer gestaltet. Der Hauptgrund des Conchierens ist jedoch das Austragen von unerwünschten, leicht-flüchtigen Aromaverbindungen wie Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure. In westeuropäischen Manufakturen beträgt eine adäquate Conchierdauer bis zu 72 Stunden, wobei die meisten amerikanischen Chocolatiere nur 18 bis 20 Stunden benötigen (Alberts & Cidell, 2006).
Studien von Di Mattia et al. (2014) haben für eine Kurzzeitconchierung ein Gesamtpolyphenolgehalt von 39,88 mg GAE/g und für eine Langzeitconchierung einen Gesamtpolyphenolgehalt von 39,11mg GAE/g gemessen. Ausgehend von dieser Studie scheint der Einfluss der Conchierung auf den Gesamtpolyphenolgehalt nicht groß zu sein.
2.3.7. Schokolade
Der Pro-Kopf-Konsum an Schokolade ist vor allem in der Schweiz mit ca. 11 kg pro Jahr sehr hoch (ICCO, 2016). Kleine Manufakturen sind in der Schweiz verbreitet und produzieren unterschiedliche Sorten an Schokolade. Gu et al. (2006) verglichen verschiedene Schokoladen unterschiedlicher Hersteller und fanden einen Gesamtpolyphenolgehalt zwischen 8,5 und 19,8 mg/g. Zusätzlich wurden von Cooper et al. (2007) 68 verschiedene Schokoladen auf ihren (-)-Epicatechingehalt untersucht und gefunden wurde eine Spanne von 0,07 - 1,94 mg/g. Letztendlich spielt die vorhergehende Verarbeitung bei den jeweiligen Prozessschritten eine wesentliche Rolle, die die Endqualität der Schokolade und damit auch ihren gesundheitliche Wirkung beeinflusst.
34 Untersuchungsmethoden zu verstehen, ist es unabdingbar sich die ablaufenden chemischen Reaktionen vor Auge zu führen. Die aufgeführten Methoden werden ubiquitär zur Bestimmung von extrahierbaren Polyphenolen in Lebensmitteln genutzt.
Laut Haslam (1989) ist ein großer Teil der Polyphenole nicht mit Wasser und den üblichen organischen Lösungsmitteln extrahierbar. Zurückzuführen ist das auf eine kovalente Bindung polymerer PA mit Kohlenhydraten, Proteinen oder anderen Polymeren in der Pflanzenzelle.
Somit verbleibt ein Grossteil der Polyphenole unlöslich im Rückstand zurück. Durch diesen Sachverhalt wurden die kolorimetrischen Methoden in dieser Arbeit aufgeteilt in die Bestimmung von extrahierbaren und nicht-extrahierbaren phenolischen Substanzen.
Extrahierbare Phenole können demzufolge mit einem Alkohol-Wasser-Gemisch aus der Probe herausextrahiert werden, wohingegen nicht-extrahierbare Phenole im Rückstand verbleiben.
2.4.1. Gesamtpolyphenolbestimmung mittels
FOLIN-CIOCALTEU-AssayDie am häufigsten angewandte Methode zur Gesamtpolyphenolbestimmung ist die Methode nach FOLIN-CIOCALTEU. Hierbei reagieren Phosphormolybdän- und Phosphorwolframsäure in Lösung zu einem Komplex aus 3H2O·P2O5·13WO3·5MoO3·10H2O mit phenolischen und polyphenolischen Verbindungen (Peterson, 1979). Das Testverfahren beruht auf einem Elektronentransfer im basischen Milieu durch reduzierende Stoffe. Hierbei wird aus dem gelben FOLIN-CIOCALTEU-Reagenz mit Molybdän(VI) und Wolfram(VI) das blaue Molybdänoxidhydroxid mit der allgemeinen Formel MoxOy(OH)2 gebildet wird, wobei Molybdän und Wolfram im niedrigen pH-Bereich niedrigere Oxidationsstufen einnehmen (Prior et al., 2005). Zur quantitativen Bestimmung des Gesamtpolyphenolgehalts wird das blaue Farbpigment herangezogen. Hierbei ist die Intensität der Blaufärbung proportional zum Gehalt an reduzierenden Verbindungen (Abbildung 16).
O O
H
OH
OH
OH
OH Mo(VI) O O
O
P OH O
H OH
O
O O
H
OH
O
OH
O Mo4O10(OH)2
(-)-Epicatechin
Phosphormolybdänsäure Mo (VI)
gelb
Reduziertes Chinon Mo (V)
blau
Abbildung 16: Oxidation des (-)-Epicatechins beim FOLIN-CIOCALTEU-Assay.
35 Je größer die Anzahl der freien phenolischen Hydroxylgruppe einer Verbindung ist, desto größer ist die Reaktivität zum Assay. Die Extinktion für Lebensmittel wird bei einer Wellenlänge von 750 nm gemessen. Der Nachteil des Assays besteht darin, dass neben Polyphenolen auch andere Verbindungen mit Hydroxylgruppen erfasst werden, wie reduzierende Zucker oder Proteine. Die kolloidale Lösung von Molybdänblau baut sich langsam auf, ist erst in einem Zeitraum von 120 bis 240 Minuten stabil und baut sich anschliessend wieder ab (Pomory, 2008).
2.4.2. Gesamtflavonoidbestimmung mittels Aluminiumchlorid-
AssayDer Gesamtflavonoidgehalt wurde mittels Aluminium(III)chlorid-Assay gemessen, der speziell dem qualitativen Nachweis von monomeren Flavanoiden dient. Laut Deng & van Berkel (1998) basiert die chemische Reaktion auf einer Komplexierung des Al3+-Ions am A-Ring des Favonoids, wobei eine freie Bindung über die 3-Hydroxy-4-keto-Funktion ausschlaggebend ist (Abbildung 17).
pinkes Kondensationsprodukt Absorptionsmaximum bei 510 nm
O H
OH O
OH
OH OH
O H
O O
OH
OH
Al3+
OH- ; AlCl3 OH
O H
O
OH
OH O
Al3+
OH
Flavonoid
Abbildung 17: Bildung eines Polyphenol-Metall-Komplexes durch den Angriff des Al3+-Ions an den A-Ring des Flavonoids.
Als Flavanoide im Kakao wurde die Gruppe der Flavan-3-ole, Flavonole, Flavone und Flavanone zusammengefasst, wobei das Ergebnis die Summe dieser Polyphenolklassen widergibt.
2.4.3. Proanthocyanidinbestimmung mittels Butanol-HCl-
AssayDie Analyse von kondensierten PA ist auf Grund der Komplexität der Substanzen eher schwierig. Es werden viele Methoden zur Quantifizierung von Tanninen angewandt, wobei einige Assays Depolymerisierung von PA beinhalten, indem der A-ring des Flavonols mit einer aromatischen Aldehydgruppe reagiert und es zu einer Redox-Reaktion kommt (Waterman & Mole, 1994). Der Butanol-HCl-Assay wird ubiquitär zur Bestimmung von
36 kondensierten extrahierbaren Proanthocyanidinen in Lebens- und Futtermitteln verwendet (Makkar et al., 1999).
Hierbei werden polymere PA im sauren Milieu depolymerisiert und das Spaltprodukt photometrisch vermessen (Bate-Smith, 1973). Da interflavanoid Verbindungen säurelabil sind, spalten sich während alkoholischer Säurebehandlung PA in ihre Untereinheiten (+)-Catechin oder (-)-Epicatechin auf. Die kationischen Produkte Anthocyanidin und Xanthylium-Ion weisen eine Rotfärbung auf, wodurch sie photometrisch detektierbar werden.
Im Detail werden hierbei kondensierte PA durch saure Butanolyse an der säurelabilen C4-C8-Bindung in ein Flavan-3-ol und Carbokation gespalten (Abbildung 18). Für die rote Färbung des Eisen-Phenol-Komplexes ist das farbige Anthocyanidin Molekül verantwortlich, welches sich unter Luftsauerstoff in ein Hydrid-Ion abspaltet (Steinegger et al., 1999), das widerrum bei 550 nm photometrisch vermessen werden kann. Je längerkettiger das gespaltene PA ist, desto intensiver ist auch die rote Färbung und desto höher ist die gemessene Extinktionsenergie.
O O H
OH
OH
O O
OH OH OH
OH
O O
OH
OH
OH H
H
OH
OH
OH
Trimeres Proanthocyanidin
O O H
OH
OH
OH OH O
O H
OH
OH
OH OH
Carbokation Flavan-3-ol terminale Einheit
H+
oC
O+ O
H
OH
OH
OH
Cyanidin OH H+
H+
O O H
OH
OH
O O
OH OH OH
OH
O O
OH
OH
OH H
H OH
OH
OH
H+ H+
+ [-2H]
Abbildung 18: Säurekatalysierte Spaltung eines trimeren PA.
Eine Schwachstelle in dem aufgeführten Assay ist der unterschiedliche Verlauf der Spaltung, wobei PA nicht vorzugsweise in die monomeren Bausteine gespalten werden, sondern bevorzugt in dimere oder trimere PA, was in unterschiedlichen Farbverläufen resultiert (Rohr, 1999). Studien von Schofield et al. (2001) weisen darauf hin, dass C4-C6 Verbindungen der PA schwerer gespalten werden, als C4-C8 Verbindungen. Weiterhin wird angegeben, dass
37 aus höhermolekularen PA mehr Cyanidin Spaltprodukte entstehen, als aus niedermolekularen PA. Daneben ist auf Grund der Heterogenität der kondensierten PA in Lebensmitteln eine Festlegung auf eine geeignete Referenzsubstanz nur schwer durchzusetzen.
Zur Bestimmung oligomerer und polymerer PA werden neben der Säurespaltung mittels BuOH-HCl-Assay Präzipitationsversuche angesetzt, sowie enzymatische Spaltreaktionen oder gravimetrische Untersuchungsmethoden verwendet.