Kolorimetrische Verfahren zur Bestimmung löslicher Polyphenole

Der Gesamtpolyphenolgehalt wird häufig als mg (-)-Epicatechinäquivalente wiedergegeben (Cooper et al., 2008; Elwers, 2008) oder mg Gallussäureäquivalente (Albertini et al., 2015) pro g entfetteter Kakaotrockenmasse. Daneben benutzen Autoren auch beispielsweise Ferulasäure (Othman et al. 2007) oder (+)-Catechin (Carrillo et al. 2013) als Referenzsubstanz zur Berechnung des Gesamtpolyphenolgehaltes.

Auf der Suche nach adäquaten Referenzsubstanzen für die Bestimmung des Gesamtpolyphenolgehaltes, lassen sich in wissenschaftlichen Arbeiten unterschiedliche Polyphenole finden. Um den Einfluss der Referenzsubstanzen auf die Berechnung des Gesamtpolypenolgehaltes zu verdeutlichen, wurde zur besseren Übersicht mittels unterschiedlichen phenolischen Substanzen Kalibrationsgeraden angefertigt (Tabelle 10).

Die phenolischen Substanzen wurden auf Grund ihrer Häufigkeit der Nennung in wissenschaftlicher Literatur ausgewählt. Durch die Berechnung erkennt man, welchen Einfluss Referenzsubstanzen auf das Ergebnis des Gesamtpolyphenolgehaltes besitzen.

Ausgehend von der linearen Gleichung y = m ǜ x + n ist für die angebliche Extraktionsstärke die Steigung m verantwortlich. Je kleiner die Steigung m ist, desto grösser ist der angebliche

135 Gesamtpolyphenolgehalt. Das resultierende Ergebnis spiegelt demnach eine näherungs-weise Bestimmung des tatsächlichen Gehalts an phenolischen Substanzen im Extrakt wider.

Tabelle 10: Kalibrationsgeraden verschiedener Referenzsubstanzen, die zur Berechnung des Gesamtpolyphenolgehaltes herangezogen werden können.

Substanzen Kalibrationsgerade Regressionskoeffizient Konzentration [g/L]

(–)-Epicatechin y = 18,821x + 0,0357 R² = 0,998 0,005 - 0,05 Gallussäure y = 17,062x + 0,0268 R² = 0,9975 0,005 - 0,05 (+)-Catechin y = 16,001x - 0,0025 R² = 0,9993 0,005 - 0,05 Chlorogensäure y = 10,954x - 0,0255 R² = 0,999 0,005 - 0,05

Wie zu erkennen ist, ändert sich der Gesamtpolyphenolgehalt je nachdem, welcher Standard als Referenz benutzt wird. Hat ein Kakaoextrakt ein Extinktionswert von E = 0,604 AU, so ergibt sich, mittels der Formel im Anhang, durch die Berechnung über (-)-Epicatechin-, Gallussäure-, (+)-Catechin- oder Chlorogensäureäquivalente ein Gesamtpolyphenolgehalt von je 60,4 mg/g bezogen auf (-)-Epicatechin, 67,6 mg/g bezogen auf Gallussäure, 75,8 mg/g bezogen auf (+)-Catechin und der höchste Wert mit 114,9 mg/g bezogen Chlorogensäure. Obwohl der gleiche Extinktionswert erhalten wurde, kann über unterschiedlichen Referenzsubstanzen unterschiedliche Werte generiert werden. Die Berechnungsformel kann aus dem Anhang entnommen werden.

Andere kolorimetrische Assays basieren auf dem gleichen Prinzip. Ein direkter Vergleich von Messwerten aus verschiedenen wissenschaftlichen Publikationen ist durch die Verwendung von unterschiedlichen Referenzsubstanzen nur schwer herzustellen. So erhielten Belitz, Grosch & Schieberle (2007) für Kakaopulver einen Gesamtpolyphenolgehalt von 84 mg/g Gallussäureäquivalente und berechnet als Epicatechinäquivalente einen Gehalt von 77 mg/g. Die Dominanz von (-)-Epicatechin im Kakao macht es unabdingbar diese als Referenzsubstanz zur Bestimmung des Gesamtpolyphenolgehaltes heranzuziehen, im

Gegensatz zur Gallussäure, die keine Rolle als Inhaltsstoff im Kakao hat. Ein mg/g (-)-Epicatechin entspricht ca. 1,1 mg/g Gallussäure.

5.3.2. Gesamtflavonoidbestimmung mittels Aluminiumchlorid-

Auch beim Aluminiumchlorid-Assay ergab sich mittels verschiedenen Extraktionslösemitteln das gleiche Profil zur Extraktionsausbeute wie beim oben beschriebenen FOLIN-CIOCALTEU -Assay. Auch hier erreichte man mit 50%igem wässrigen Aceton die größte Ausbeute an Flavonoiden. Als kakaospezifische Polyphenole wurden die monomeren Polyphenole aus

136 der Substanzklasse der Flavan-3-ole, Flavanone, Flavone, Flavanole und Anthocyanidine verstanden, welche mittels diesem Assay quantifiziert werden konnten.

Als Referenzsubstanz zur Berechnung des Flavonoidgehaltes dient auch hier (-)-Epicatechin. Die gleiche phenolische Substanz wie schon bei FOLIN-CIOCALTEU wurde als

gut befunden, erleichtert einen direkten Vergleich der Ergebnisse zwischen den beiden Assays.

Eine andere häufig angewandte Methode zur kolorimetrischen Flavonoidbestimmung ist der sogenannte Vanillin-HCl-Assay (Wollgast, 2005), wobei hier Faktoren, wie Zeit und Temperatur eine Abhängigkeit der Farbreaktion auf die Konzentrationsbestimmung besitzen.

Daneben spielt der Einfluss von Wasser eine wichtige Rolle, indem mit steigendem Wassergehalt die Intensität des Farbkomplexes abnimmt. Aus diesen Gründen wurde auf den Einsatz dieses Assays verzichtet.

5.3.3. Proanthocyanidinbestimmung mittels Butanol-HCl-

Generell wird der Butanol-HCl-Assay zur quantitativen Bestimmen von kondensierte PA im Pflanzenmaterial herangezogen. Trotzdem kann es je nach Matrix zu Interferenzen mit dem Probenmaterial kommen und damit zu strukturellen Änderungen des resultierenden Farbkomplexes (Schofield et al., 2001). So fällt die Farbintensität der Quebrachotannine weicher aus, als die der Hirsetannine (Hemingway & Karchesy, 1989). Durch die zusätzliche OH-Gruppe am C5-Atom des A-Rings im Quebracho, erhöht sich die Säurestabilität auf die Interflavanbindungen, wodurch es zu einer Reduktion der Farbintensität kommt (Giner-Chavez et al., 1997). Eine weitere Schwachstelle in der Methodik ist, dass auf Grund der unterschiedlichen Bindungsstellen und den unterschiedlichen Substituenten am A- oder B-Ring, es zu einem unterschiedlichen Farbverlauf kommen kann (Watermann & Mole, 1994).

Desweiteren werden höher kondensierte Polyphenole nicht proportional in ihre Monomere gespalten, wodurch hier wiederrum das Absorptionsspektrum nicht linear verläuft (Rohr, 1999).

In dieser Arbeit wurde zwischen der Bestimmung der EPA im extrahierbaren Überstand und der Bestimmung von NEPA im verbleibenden Rückstand des Probenmaterials unterschieden. Die Quantifizierung der EPA spiegelt somit den Proanthocyanidingehalt in der Probe wider, wobei die Quantifizierung der NEPA auf die Bestimmung von höhermolekularen kondensierten Polyphenolen zielt. Beide Bestimmungsmethoden wurden mittels Butanol-HCl-Assay durchgeführt. Auf Grund des unpolaren Lösungsmittels n-Butanol als

137 Extraktionslösungsmittel können sich höhermolekulare hydrophobere PA besser in dem Lösemittel lösen. Die Quantifizierung der PA wird in einigen wissenschaftlichen Arbeiten mit Hilfe des Lambert-Beer’schen Gesetzes über den molaren Extinktionskoeffizienten berechnet. Rösch et al. (2003) haben zum Thema Sanddorn den PA-Gehalt mittels molaren Extinktionskoeffizienten über Cyanidin berechnet, wobei das Ergebnis als Cyanidinäquivalente angegeben wird. Wegen Mangel an käuflichen erwerbbaren oligomeren PA mit PG > 5, gestaltet es sich schwierig, eine adäquate Aussage über den PA-Gehalt mittels kongruenten Referenzsubtanzen zu machen.

Bereits 1978 wurde in der Arbeit von McMurrough & McDowell ein höherer Responsefaktor von (-)-Epicatechin mit 4-Dimethylaminocinnamaldehyde (DMAC) ermittelt, als bei (+)-Catechin mit DMAC, was auf einen unterschiedlichen Extinktionskoeffizienten hindeutet.

Studien von Payne et al. (2010) haben den Gesamtproanthocyanidingehalt in verschiedenen Schokoladen mittels DMAC bestimmt und wiesen ebenfalls auf die Schwierigkeit bei der Berechnung über monomere oder oligomere Flavan-3-ole hin. Ihrer Studie nach würde die Berechnung über (+)-Catechin oder (-)-Epicatechin als Referenzsubstanz den Gesamtflavonoidgehalt in der Probe unterschätzen, wobei sie eher oligomere PA für die Quantifizierung empfehlen würden.

5.3.4. Vergleich der kolorimetrischen

untereinander

Die beschriebenen Assays können auf Grund ihrer Spezifikationen unterschiedliche Substanzklassen bestimmen. Eine Quantifizierung basiert auf einer schnellen Einschätzung der Konzentration, bezogen auf den Gesamtpolyphenol-, Flavonoid- und Proanthocyanidingehalt. Allen gleich ist die Berechnung eingehender Einzelphenole als Summenparameter, wobei sich das in Form einer Referenzsubstanz als Bezugspunkt ausdrückt und somit das Endergebnis als Äquivalente angegeben wird. Die drei beschriebenen Assays wurden nach ihrer Lösemittelunempfindlichkeit ausgewählt, genauso wie nach ihrer linearen Regression im breiten Konzentrationsbereich. Unterschieden werden sie darüber hinaus auch bezüglich ihrer Nachweisgrenze (Tabelle 11).

Die mit Abstand populärste Methode zur kolorimetrischen Bestimmung vom Gesamtpolyphenolgehalt ist der FOLIN-CIOCALTEU-Assay, wobei dieser nicht nur phenolische Komponenten misst, sondern auch die gesamte antioxidative Kapazität der Probe bestimmt.

Darüber hinaus sind der größere Zeitbedarf und die Störanfälligkeit gegenüber reduzierenden Substanzen ein weiterer Nachteil. Die Empfindlichkeit der Methode ist um ein 4-faches geringer als die der anderen Assays. Aluminiumchlorid-Assay besitzt gegenüber

138 dem FOLIN-CIOCALTEU-Assay eine höhere Nachweisgrenze. Denoch ist der Aluminiumchlorid-Assay unempfindlicher gegenüber Störkomponenten.

Tabelle 11: Verwendete kolorimetrischen Assays kategorisiert nach ihrer Spezifikation.

Methode Empfindlichkeits bereich [—g/mL]

LOD

[—g/mL] Vorteil Nachteil

FOLIN -CIOCALTEU-

Assay

5-50 2,35

ECÄ

Häufig angewandt, Einfach und relativ

genau

Störung durch andere reduzierende Substanzen wie

Zucker Aluminiumchlorid

- Assay 20-200 6,30

ECÄ

Nicht störanfällig, Spezifisch auf

Flavonoide

zeitabhängig

Butanol-HCl-Assay 20-200 3,35

CyE

Nicht störanfällig Spezifisch auf kondensierte PA

zeitabhängig

Ein Nachteil der sauren Butanolyse besteht in der Zerstörung der Primärstruktur von oligomeren PA. Studien von Makkar et al. (1999) geben außerdem an, dass trotz des sauren Aufschlusses, immer noch ein hoher Anteil an kondensierten Tanninen im Rückstand verbleibt.

Der mittels Aceton-Wasser-Gemisch gewonnene flüssige Kakaoextrakt wurde mittels unterschiedlichen Assays vermessen und die Farbverläufe einander gegenübergestellt. Mit dem bloßen Auge erkennt man bereits die unterschiedlichen Farbverläufe und insbesondere die Dunkelfärbung um 50 - 70% herum (Abbildung 23). Rein optisch kann somit ebenfalls gezeigt werden, dass die drei unterschiedlichen phenolischen Substanzklassen eher durch ein 50 - 70%iges Aceton-Wasser-Gemisch extrahiert werden können.

139 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

FOLIN-CIOCALTEU -Assay

Aluminiumchlorid-Assay

Butanol-HCl-Assay

Abbildung 23: Vermessung des flüssigen Kakaoextraktes mittels unterschiedlichen kolorimetrischen Assays. Der angegebene Prozentsatz gibt das verwendete Aceton-Wasser-Extraktionsmittelgemisch wieder.