2 Material und Methoden
2.1 Material:
2.1.5 Verwendete Bakterienstämme und Plasmide
2.1.5.1 Bakterienstämme Yersinia enterocolitica-Stämme:
Stamm Beschreibung Referenz
WA (pYV) Y. enterocolitica Serotyp O:8; Stamm WA-314, Träger des Virulenzplasmids pYVO8
Heesemann et al., 1983
WA-C pYV-freies Derivat von WA-314 Heesemann et al., 1983 WA-CΔinv Invasingen-ko Mutante von WA-C Ruckdeschel et al., 1996 8081 Y. enterocolitica Serotyp O:8, Stamm
8081, Träger des Virulenzplasmids pYV8081
Portnoy et al., 1981
108-p Y. enterocolitica Serotyp O:3, Stamm 108-p, Träger des Virulenzplasmids pYVO3
Heesemann et al., 1984
Tabelle 5:Verwendete Yersinia enterocolitica-Stämme
Yersinia pseudotuberculosis-Stämme:
Stamm Beschreibung Referenz
IP32953 Y. pseudotuberculosis Serotyp O:1b, Stamm IP32953, Träger des
Virulenzplasmids pYVypI
Chain et al., 2004
YPIII Y. pseudotuberculosis Serotyp III, Stamm YPIII, Träger des
Virulenzplasmids pYVypIII
Bölin et al., 1982
IP-C pYVypI-freies Derivat von IP32953 diese Arbeit YPIII-C pYVypIII-freies Derivat von YPIII diese Arbeit Tabelle 6:Verwendete Yersinia pseudotuberculosis-Stämme
Escherichia coli-Stämme:
Stamm Beschreibung Referenz
DH5α E. coli endA1 supE44 hsdR17(rk
-mk+
) thi-1 recA1gyrA96 relA1Δ(lacZYA-argF) U169 (φ80lacZΔM15)
Hanahan, 1983
SM10λpir thi-1 thr leu tonA lacY supE recA::RP4-2-TC::Mu-Kan (λpir), Kmr
Miller und Mekalanos, 1988 Tabelle 7:Verwendete Escherichia coli-Stämme
30
AS
A1
AS-8
SS Kopf Hals Stiel Linker Membrananker
YadAent Serotyp O8
AS-3
SS Kopf Hals Stiel Linker Membrananker
YadAent O8 YadAent Serotyp O3
AS-I
AS-III
SS Kopf Hals Stiel Linker Membrananker
YadAent O8 YadApstb
ASS-I
ASS-III
SS Kopf Hals Stiel Linker Membrananker
YadAent O8 YadApstb YadAent Serotyp O8
Abb.4: Schematische Darstellung der YadA-Hybride in Y. enterocolitica
Die Pfeile geben die Aminosäureposition der YadA-Domänen an. Y. enterocolitica YadA-Varianten unterscheiden sich durch die Länge des „Stiels“. Y. pseudotuberculosis YadA-Varianten haben eine voluminösere Kopfstruktur als die von Y. enterocolitica. Für alle Hybride sind Signalsequenz (SS), Kopf-, Hals-, Stiel-, Linker- und Membranankerdomäne dargestellte. Alle Hybride tragen die SS von Y. enterocolitica Serotyp O8. SS, Halsdomäne (Konnektor), Linker und Membrananker stellen hochkonservierte Bereiche dar, die sich nur marginal unterscheiden. Die YadAent-YadApstb-Hybride tragen eine Kopfdomäne von Y. pseudotuberculosis und die Stieldomäne von Y. enterocolitica WA-314, diese sind über die Halsdomäne verbunden.
1 25
26 191 215 342 369 422
26 194 218 367 402 455
26 227 251 345 379 432
251 378 413 466
31 2.1.5.2 Plasmide
Plasmid Beschreibung Referenz
pYVO8 WA-314/WA(pYVO8) Heesemann et al., 1983
pYV8081 8081/8081(pYV8081) Portnoy et al., 1981
pYVO3 Y-108P/108(pYVO3) Heesemann et al., 1984
pYV-I IP32953/YP(pYV-I) Chain et al., 2004
pYV-III YPIII (pIB1)/YP(pYV-III) Bölin et al., 1982
pUC-A-1 pUC13 mit 5kb EcoRI/HindIII
Fragment von pYVO8, yadA-positiv
Roggenkamp et al., 1995
pUC:SS pUC-A-1 mit yadA bp1-87 Nägele, 2010
pGP:SS pGP704 mit EcoRI/SphI Fragment
von pUC:SS
Nägele, 2010 pHP45Ω Ursprung der Spectinomycin (Spc)
Kassette
Prentki und Kirsch, 1984 pGPS-A-H pGP704, 1,8 kb Spc-Kassette in der
EcoRI site, besitzt yadA als ein EcoRI/SphI Fragment von pUC-A-H (Deletion der bp 88-565)
Ackermann, 2005
pGPS-A-1 pGP704, 1,8 kb Spc-Kassette in der EcoRI site, besitzt yadA als ein EcoRI/SphI Fragment von pUC-A-1
Roggenkamp et al, 1995
pGPS:S 1,8 kb Spc-Kassette in der EcoRI site von pGPS:
Nägele, 2010 pGPS-8081 pGP704, 1,8 kb Spc-Kassette in der
EcoRI site, besitzt yadA als ein EcoRI/SphI Fragment von pYV8081
Max-von-Pettenkofer-Institut
pGPS-108-p pGP704, 1,8 kb Spc-Kassette inseriert in die EcoRI site, besitzt yadA als ein EcoRI/SphI Fragment von pYVO3
Max-von-Pettenkofer-Institut
pGPS-IP32953 pGP704, 1,8 kb Spc-Kassette inseriert in die EcoRI site, besitzt yadA als ein EcoRI/SphI Fragment von pYV-I
Max-von-Pettenkofer-Institut
pGPS-IP32953H pGPS-A-H, besitzt die yadA-Kopfdomäne von pYV-I als SacI/SacI-Fragment
Max-von-Pettenkofer-Institut
pGPS-YPIII pGP704, 1,8 kb Spc-Kassette inseriert in die EcoRI site, besitzt yadA als ein EcoRI/SphI Fragment von pYV-III
Max-von-Pettenkofer-Institut
pGPS-YPIIIH pGPS-A-H, besitzt die yadA-Kopfdomäne von pYV-III als SacI/SacI-Fragment
Max-von-Pettenkofer-Institut
pYV-A0 pYVO8 mit Deletion des yadA-Gens Roggenkamp et al., 1995
pYV-AS pYVO8 mit deletierter
yadA-Gensequenz für das prozessierte YadA, d.h. yadA-Promotorregion und Sequenz für YadA Signalsequenz (AS) sind noch vorhanden
Nägele, 2010
32
pYV-ASS pYVO8 mit deletierter Sequenz für die YadA-Kopfregion, d.h. es wird
„kopfloses“ YadA in die äußere Membran inseriert (YadA-Stiel)
pYV-A1 pYV-A0 mit yadA-Insertion durch
allelen Austausch
Roggenkamp et al., 1995 pYV-AS-8 pYV-AS mit fusionierter Gensequenz
für das reife YadA, kodiert auf pYV8081
Max-von-Pettenkofer-Institut
pYV-AS-3 pYV-AS mit fusionierter Gensequenz für das reife YadA, kodiert auf
pYVO3
Max-von-Pettenkofer-Institut
pYV-AS-I pYV-AS mit fusionierter Gensequenz für das reife YadA, kodiert auf pYV-I
Max-von-Pettenkofer-Institut
pYV-ASS-I pYV-ASS mit fusionierter
Gensequenz für die „Kopfregion“ von YadA, kodiert auf pYV-I
Max-von-Pettenkofer-Institut
pYV-AS-III pYV-AS mit fusionierter Gensequenz für das reife YadA, kodiert auf
pYV-III
Max-von-Pettenkofer-Institut
pYV-ASS-III pYV-ASS mit fusionierter
Gensequenz für die „Kopfregion“ von YadA, kodiert auf pYV-III
Max-von-Pettenkofer-Institut
pACYC177 Klonierungsvektor, ApR, TcR, Ursprung der Kanamycin-(Km)-Kassette
Chang und Cohen, 1978
pKD46 Trägt das Gen für red-α, -β, - γ Datsenko und Wanner, 2000
pYV32953::kanΔyadA IP32953, yadA-, Km-Gen-Block inseriert mittels homologer Bereiche im Rahmenbereich des yadA-Gens durch Austausch von Allelen
diese Arbeit
pIB1::kanΔyadA YPIII, yadA-, Km-Gen-Block inseriert mittels homologer Bereiche im
Rahmenbereich des yadA-Gens durch Austausch von Allelen
diese Arbeit
pACYC184 Klonierungsvektor, TcR, CmR Chang und Cohen, 1978
pAC-F pACYC184 mit inseriertem virF-Gen
(Transkriptionsaktivator für YadA und yop Gene) als SalI/SphI-Fragment
Nägele, 2010
pAC-F-A1 pAC-F mit yadA-Gen aus pYVO8 als XbaI/BamHI-Fragment
Nägele, 2010 pAC-F-AS-8 Austausch der yadA-Gensequenz in
pAC-F-A1 für das „reife“ YadA durch die entsprechende yadA-Gensequenz aus pYV8081: Fusion der YadA Promotorregion und der Sequenz für die Signalsequenz aus pAC-F-A1 : YadA08
diese Arbeit
33
pAC-F-AS-3 Austausch der yadA-Gensequenz in pAC-F-A1 für das „reife“ YadA durch die entsprechende yadA-Gensequenz aus pYVO3: Fusion der YadA Promotorregion und der Sequenz für die Signalsequenz aus pAC-F-A1 : YadA03
diese Arbeit
pAC-F-AS-I Austausch der yadA-Gensequenz in pAC-F-A1 für das „reife“ YadA durch die entsprechende yadA-Gensequenz aus pYV-I: Fusion der YadA
Promotorregion und der Sequenz für die Signalsequenz aus pAC-F-A1 : YadA-I
diese Arbeit
pAC-F-ASS-I Austausch der yadA-Gensequenz in pAC-F-A1 für die Kopfregion des YadA durch die entsprechende yadA-Gensequenz der Kopfregion aus pYV-I: YadA-Hybrid-I
diese Arbeit
pAC-F-AS-III Austausch der yadA-Gensequenz in pAC-F-A1 für das „reife“ YadA durch die entsprechende yadA-Gensequenz aus pYV-III: Fusion der YadA Promotorregion und der Sequenz für die Signalsequenz aus pAC-F-A1 : YadA-III
diese Arbeit
pAC-F-ASS-III Austausch der yadA-Gensequenz in pAC-F-A1 für die Kopfregion des YadA durch die entsprechende yadA-Gensequenz der Kopfregion aus pYV-III: YadA-Hybrid-III
diese Arbeit
Tabelle 8: Verwendete Plasmide
H: Kopf (Head)-Region von YadA; S: YadA-Promotorregion und –Signalsequenzcodons; ApR: Amplicillinresistenz; TcR: Tetratcyclinresistenz; CmR: Chloramphenicholresistenz