Peyersche Plaques

Die Peyerschen Plaques sind Ansammlungen von 10 bis 50 Lymphfollikeln, die in der Lamina propria und der Tela submucosa der Dünndarmschleimhaut liegen. Die Lymphfollikel sind Sekundärfollikel mit aktivem Keimzentrum und einem Randwall aus kleinen Lymphozyten, überwiegend B-Zellen. Den Bereich zwischen den Follikeln nennt man Interfollikularregion. Hier finden sich dicht liegende T-Lymphozyten. Zum Darmlumen hin zeigt sich eine kappenartige Ansammlung von T- und B-Zellen, welche als Dom bezeichnet wird. Der Dom wird von einem speziellen Zotten- und Krypten-freien Epithel bedeckt, welches sog. M-Zellen enthält. Diese transportieren Viren und Bakterien intrazellulär in die Submukosa wo z. B. dendritische Zellen (DCs) die Erreger in die Lymphozytenareale weiter transportieren (vgl. Abb.14). Die Peyerschen Plaques gehören zum lymphatischen System und sind Teil des GALT (Darmassoziiertes lymphatisches Gewebe). Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Infektabwehr im Darm.

Die Auswertung der Gewebsschnitte zeigte, dass die yadA-positiven WA-314-Mutanten in den Peyerschen Plaques deutliche Abszesse mit erheblicher Schwellung hervorriefen. In der Analyse der Immunfluoreszenzfärbung mit DAPI, WAVital und Ly6G zeigte sich, dass es in den Peyerschen Plaques der infizierten Mäuse zu einem entzündlichen Prozess mit ein bis mehreren Einzelabszessen und deutlichem Keimnachweis in diesen Abszessen gekommen war. Im Gegensatz hierzu fand sich bei der Infektion mit der yadA-negativen Mutante WA-C (pYV-AS) kein entzündlicher Prozess oder Keimnachweis in den Peyerschen Plaques.

Ebenso fand sich ein deutlicher Nachweis von Granulozyten (Ly6G-positiv) in den Abszessen, verstärkt im Randbereich, die Abszesse umrahmend. Um die Abszesse herum fanden sich durch DAPI kräftig angefärbte zellreiche Areale in ca. zwei Drittel der Aufnahmen (vgl. Abb.15 – Abb.25). In der Immunfluoreszenzfärbung mit DAPI, B220 und CD11c zeigte sich im Vergleich mit der DAPI-WAVital-Ly6G-Färbung, dass diese rundlichen zellreichen Areale B-Zell-Ansammlungen (B220-positiv), also Follikeln entsprechen. Zudem ließ sich in diesen Aufnahmen im Bereich zwischen den Follikeln ein Netz von dendritischen Zellen (CD11c-positiv) nachweisen (vgl. Abb.20 & Abb.22). Ebenso fiel in dieser Färbung auf, dass sich in den Peyerschen Plaques, in denen keine Follikel dargestellt werden konnten, keine B-Zellen nachweisbar waren, weder in den Abszessen noch

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umliegend (vgl. Abb.17 & Abb.18). Zwischen den verschiedenen untersuchten WA-314-Mutanten fanden sich keine signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit des Auftretens oder der Ausprägung der Follikel. In den Peyerschen Plaques, in welchen keine Follikel dargestellt werden konnten, fanden sich je nur ein bis zwei Einzelabszesse (vgl. Abb.17 & Abb.18).

Bei den Peyerschen Plaques, in denen sich Follikel fanden, lassen sich zwei Gruppen unterscheiden. Zum einen fanden sich größere Einzelabszesse, die von mehreren kleineren B-Zell-Arealen umschlossen waren (vgl. Abb.20 – Abb.22). Zum anderen fanden sich Peyersche Plaques mit mehreren Abszessen, von denen einzelne bis wenige Follikel an den Rand gedrängt scheinen (vgl. Abb.19) oder die ein mit wenigen Follikeln durchsetztes Entzündungsbild zeigten (vgl. Abb.15 A1).

In der Auswertung der von den Gewebsschnitten der Peyerschen Plaques aus mit Y. pseudotuberculosis-Mutanten und -Varianten infizierten Mäusen gefertigten Immunfluoreszenz-Färbungen zeigten sich ebenso deutliche Abszesse in den Peyerschen Plaques. Hierbei fiel auf, dass sich sowohl in den Peyerschen Plaques der Mäuse, welche mit yadA-positiven Varianten infiziert wurden, als auch in jenen, die mit yadA-negativen Mutanten infiziert wurden, Abszesse fanden, die sich in ihrer Ausprägung nicht erheblich unterscheiden. In allen in dieser Arbeit untersuchten Peyerschen Plaques aus mit Y. pseudotuberculosis-Mutanten und -Varianten infizierten Mäusen fanden sich die oben beschriebenen B-Zell reichen Follikel (vgl. Abb.23). Im Vergleich zeigte sich, dass die durch die Y. pseudotuberculosis-Mutanten und -Varianten ausgelösten Abszesse in den Peyerschen Plaques kleiner und die sie umliegenden Follikel im Verhältnis größer waren als bei den durch die WA-314-Mutanten ausgelösten entzündlichen Prozesse (vgl. Abb.16 – Abb.23).

Bei der Auswertung der HE-Färbungen der Gewebsschnitte der Peyerschen Plaques fand sich deutliche Zelllyse im Bereich der Abszesse. Die Gewebszerstörung war besonders ausgeprägt in den Bereichen, in denen sich in den Immunfluoreszenz-Aufnahmen eine hohe Keimlast nachweisen ließ (vgl. Abb.16 – Abb.20). Die Bereiche der B-Zell reichen Follikel zeigten sich in den HE-Aufnahmen stark basophil, somit zellkernreich (vgl. Abb.20 – Abb.22).

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Abb.14: Schematische Darstellung von Peyerschen Plaques

Dargestellt sind zwei Peyersche Plaques mit vorwiegend aus B-Zellen bestehenden Lymphfollikeln, die zur Seite des Darmlumens vom Domareal überkuppelt werden. Das Domareal ist mit dem Domepithel bedeckt, welches M-Zellen enthält. Zwischen den Lymphfollikeln finden sich vermehrt T-Zellen. Zwischen den Peyerschen Plaques zum Darmlumen gerichtet finden sich normale Darmzotten.

DAPI: blau; Yersinia: grün (FITC); Ly6G: rot (Cy3)

Abb.15: Immunfluoreszenz-Färbung von Peyerschen Plaques infiziert mit WA-314-YadA-Varianten-Stämmen zur Darstellung von Yersinien und Granulozyten

Vergleich repräsentativer Gewebsschnitte von Peyerschen Plaques aus oral infizierten BALB/c-Mäusen (♀) mit 1x10⁹ WA-C (pYV-AS) (yadA-negativ), WA-C (pYV-A1). 5 Tage nach Infektion erfolgte die Entnahme der Peyerschen Plaques. Hiervon gefertigte Gewebsschnitte wurden mit DAPI und den Primärantikörpern WAVital (Kaninchen; 1:5000) und Ly6G (Ratte; 1:50) und den

Sekundärantikörpern FITC-Anti-Kaninchen (1:2000) und Cy3-Anti-Ratte (1:2000) gefärbt. Die hier gezeigten Schnitte stammen von jeweils unterschiedlichen Versuchstieren. Sie erlauben den Vergleich zwischen einem infizierten und einem nicht-entzündlichen Peyerschen Plaques.

AS = pYV-AS; A1 = pYV-A1, jeweils in WA-C.

AS

Lymphfollikel B

T

Darmlumen Darm- zotten Dom

Peyersche Plaques Domepithel

mit M-Zellen

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Abb.16: HE-Färbungen im Vergleich mit Immunfluoreszenz-Färbung mit DAPI, WAVital, Ly6G von Peyerschem Plaque infiziert mit WA-C (pYV-A1)

Vergleich repräsentativer Gewebsschnitte eines Peyerschen Plaque aus peroral infizierten BALB/c-Mäusen (♀) mit 1x10⁹ WA-C (pYV-A1). 5 Tage nach Infektion erfolgte die Entnahme der

Peyerschen Plaques. Hiervon gefertigte Gewebsschnitte wurden mittels HE-Färbung bzw. mit DAPI und den Primärantikörpern WAVital (Kaninchen; 1:5000) und Ly6G (Ratte; 1:50) und den

Sekundärantikörpern FITC-Anti-Kaninchen (1:2000) und Cy3-Anti-Ratte (1:2000) gefärbt. Hier ist eine Übersichtsaufnahme in Immunfluoreszenz-Färbung mit vergrößerten Ausschnitten in HE-Färbung aus einem Peyerschen Plaque dargestellt.

A1 = pYV-A1 DAPI: blau

Yersinia: grün (FITC) Ly6G: rot (Cy3)

Hämalaun + Eosin

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Abb.17: HE-Färbungen im Vergleich mit Immunfluoreszenz-Färbung mit DAPI, WAVital und Ly6G bzw. B220 und CD11c von Peyerschem Plaque infiziert mit WA-C (pYV-AS-8)

Vergleich repräsentativer Gewebsschnitte eines Peyerschen Plaque aus peroral infizierten BALB/c-Mäusen (♀) mit 1x10⁹ WA-C (pYV-AS-8). 5 Tage nach Infektion erfolgte die Entnahme der Peyerschen Plaques. Hiervon gefertigte Gewebsschnitte wurden mittels HE-Färbung bzw. mit DAPI und den Primärantikörpern WAVital (Kaninchen; 1:5000) und Ly6G (Ratte; 1:50) bzw. B220 (Ratte;

1:50) und CD11c (arm. Hamster; 1:50) und den entsprechenden Sekundärantikörpern Cy3-Anti-Ratte (1:2000) und FITC-Anti-Kaninchen (1:2000) bzw. FITC-Anti. arm. Hamster (1:2000) gefärbt.

Hier sind Übersichtsaufnahmen in Immunfluoreszenz-Färbung mit vergrößerten Ausschnitten in HE-Färbung aus einem Peyerschen Plaque dargestellt.

AS-8 = pYV-AS-8

AS-8

Hämalaun + Eosin

DAPI: blau B220: rot (Cy3) CD11c: grün (FITC)

DAPI: blau

Yersinia: grün (FITC) Ly6g: rot (Cy3)

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Abb.18: HE-Färbungen im Vergleich mit Immunfluoreszenz-Färbung mit DAPI, WAVital und Ly6G bzw. B220 und CD11c von Peyerschem Plaque infiziert mit WA-C (pYV-AS-3)

Vergleich repräsentativer Gewebsschnitte eines Peyerschen Plaque aus peroral infizierten BALB/c-Mäusen (♀) mit 1x10⁹ WA-C (pYV-AS-3). 5 Tage nach Infektion erfolgte die Entnahme der Peyerschen Plaques. Hiervon gefertigte Gewebsschnitte wurden mittels HE-Färbung bzw. mit DAPI und den Primärantikörpern WAVital (Kaninchen; 1:5000) und Ly6G (Ratte; 1:50) bzw. B220 (Ratte;

1:50) und CD11c (arm. Hamster; 1:50) und den entsprechenden Sekundärantikörpern Cy3-Anti-Ratte (1:2000) und FITC-Anti-Kaninchen (1:2000) bzw. FITC-Anti. arm. Hamster (1:2000) gefärbt.

Hier sind Übersichtsaufnahmen in Immunfluoreszenz-Färbung mit vergrößerten Ausschnitten in HE-Färbung aus einem Peyerschen Plaque dargestellt.

AS-3 = pYV-AS-3 AS-3 DAPI: blau

B220: rot (Cy3) CD11c: grün (FITC)

DAPI: blau

Yersinia:grün (FITC) Ly6G: rot (Cy3)

Hämalaun + Eosin

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Abb.19: HE-Färbungen im Vergleich mit Immunfluoreszenz-Färbung mit DAPI, WAVital, Ly6G von Peyerschem Plaque infiziert mit WA-C (pYV-AS-I)

Vergleich repräsentativer Gewebsschnitte eines Peyerschen Plaque aus peroral infizierten BALB/c-Mäusen (♀) mit 1x10⁹ WA-C (pYV-AS-I). 5 Tage nach Infektion erfolgte die Entnahme der Peyerschen Plaques. Hiervon gefertigte Gewebsschnitte wurden mittels HE-Färbung bzw. mit DAPI und den Primärantikörpern WAVital (Kaninchen; 1:5000) und Ly6G (Ratte; 1:50) und den

Sekundärantikörpern FITC-Anti-Kaninchen (1:2000) und Cy3-Anti-Ratte (1:2000) gefärbt. Hier ist eine Übersichtsaufnahme in Immunfluoreszenz-Färbung mit vergrößerten Ausschnitten in HE-Färbung aus einem Peyerschen Plaque dargestellt.

AS-I = pYV-AS-I AS-I

Hämalaun + Eosin DAPI: blau

Yersinia: grün (FITC) Ly6G: rot (Cy3)

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Abb.20: HE-Färbungen im Vergleich mit Immunfluoreszenz-Färbung mit DAPI, WAVital und Ly6G bzw. B220 und CD11c von Peyerschem Plaque infiziert mit WA-C (pYV-ASS-I)

Vergleich repräsentativer Gewebsschnitte eines Peyerschen Plaque aus peroral infizierten BALB/c-Mäusen (♀) mit 1x10⁹ WA-C (pYV-ASS-I). 5 Tage nach Infektion erfolgte die Entnahme der Peyerschen Plaques. Hiervon gefertigte Gewebsschnitte wurden mittels HE-Färbung bzw. mit DAPI und den Primärantikörpern WAVital (Kaninchen; 1:5000) und Ly6G (Ratte; 1:50) bzw. B220 (Ratte;

1:50) und CD11c (arm. Hamster; 1:50) und den entsprechenden Sekundärantikörpern Cy3-Anti-Ratte (1:2000) und FITC-Anti-Kaninchen (1:2000) bzw. FITC-Anti. arm. Hamster (1:2000) gefärbt.

Hier sind Übersichtsaufnahmen in Immunfluoreszenz-Färbung mit vergrößerten Ausschnitten in HE-Färbung aus einem Peyerschen Plaque dargestellt.

ASS-I = pYV-ASS-I ASS-I DAPI: blau

B220: rot (Cy3) CD11c: grün (FITC)

DAPI: blau

Yersinia: grün (FITC) Ly6G: rot (Cy3)

Hämalaun + Eosin

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Abb.21: HE-Färbungen im Vergleich mit Immunfluoreszenz-Färbung mit DAPI, WAVital, Ly6G von Peyerschem Plaque infiziert mit WA-C (pYV-AS-III)

Vergleich repräsentativer Gewebsschnitte eines Peyerschen Plaque aus peroral infizierten BALB/c-Mäusen (♀) mit 1x10⁹ WA-C (pYV-AS-III). 5 Tage nach Infektion erfolgte die Entnahme der Peyerschen Plaques. Hiervon gefertigte Gewebsschnitte wurden mittels HE-Färbung bzw. mit DAPI und den Primärantikörpern WAVital (Kaninchen; 1:5000) und Ly6G (Ratte; 1:50) und den

Sekundärantikörpern FITC-Anti-Kaninchen (1:2000) und Cy3-Anti-Ratte (1:2000) gefärbt. Hier ist eine Übersichtsaufnahme in Immunfluoreszenz-Färbung mit vergrößerten Ausschnitten in HE-Färbung aus einem Peyerschen Plaque dargestellt.

AS-III = pYV-AS-III AS-III

DAPI: blau

Yersinia: grün (FITC) Ly6G: rot (Cy3)

Hämalaun + Eosin

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Abb.22: HE-Färbungen im Vergleich mit Immunfluoreszenz-Färbung mit DAPI, WAVital und Ly6G bzw. B220 und CD11c von Peyerschem Plaque infiziert mit WA-C (pYV-ASS-III)

Vergleich repräsentativer Gewebsschnitte eines Peyerschen Plaque aus peroral infizierten BALB/c-Mäusen (♀) mit 1x10⁹ WA-C (pYV-ASS-III). 5 Tage nach Infektion erfolgte die Entnahme der Peyerschen Plaques. Hiervon gefertigte Gewebsschnitte wurden mittels HE-Färbung bzw. mit DAPI und den Primärantikörpern WAVital (Kaninchen; 1:5000) und Ly6G (Ratte; 1:50) bzw. B220 (Ratte;

1:50) und CD11c (arm. Hamster; 1:50) und den entsprechenden Sekundärantikörpern Cy3-Anti-Ratte (1:2000) und FITC-Anti-Kaninchen (1:2000) bzw. FITC-Anti. arm. Hamster (1:2000) gefärbt.

Hier sind Übersichtsaufnahmen in Immunfluoreszenz-Färbung mit vergrößerten Ausschnitten in HE-Färbung aus einem Peyerschen Plaque dargestellt.

ASS-III = pYV-ASS-III ASS-III DAPI: blau

B220: rot (Cy3) CD11c: grün (FITC)

DAPI: blau

Yersinia: grün (FITC) Ly6G: rot (Cy3)

Hämalaun + Eosin

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DAPI: blau; Yersinia: grün; Ly6G: rot DAPI: blau; B220: rot; CD11c: grün .

YPIIIpYV YPIIIΔyadA IP32953pYV IP32953ΔyadA

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Abb.23: Immunfluoreszenz-Färbungsvergleich von Peyerschen Plaques infiziert mit Y. pseudotuberculosis-Mutanten

Vergleich repräsentativer Gewebsschnitte von Peyerschen Plaques aus peroral infizierten BALB/c-Mäusen (♀) mit 1x10⁹ IP32953ΔyadA, IP32953pYV, YPIIIΔyadA und YPIIIpYV. 5 Tage nach Infektion erfolgte die Entnahme der Peyerschen Plaques. Hiervon gefertigte Gewebsschnitte wurden mit DAPI und den Primärantikörpern WAVital (Kaninchen; 1:5000) und Ly6G (Ratte; 1:50) bzw.

B220 (Ratte; 1:50) und CD11c (arm. Hamster; 1:50) und den entsprechenden Sekundärantikörpern Cy3-Anti-Ratte (1:2000) und FITC-Anti-Kaninchen (1:2000) bzw. FITC-Anti. arm. Hamster (1:2000) gefärbt. Die hier gezeigten Schnitte stammen von jeweils unterschiedlichen Versuchstieren.

IP32953ΔyadA = pYV32953::kanΔyadA in IP-C; IP32953pYV = IP32953 mit pYV32953; YPIII ΔyadA = pIB1::kanΔyadA in YPIII-C; YPIIIpYV = YPIII mit pIB1.

Im Dokument Vergleichende Untersuchungen zur Adhärenz und Mauspathogenität von Yersinia-Adhäsin (YadA)-Varianten verschiedener Yersinia-Arten und -Serotypen (Seite 98-109)