Mutagenese-PCR

Diese Methode ist hilfreich, wenn man zum Beispiel eine Restriktionsenzym-Schnittstelle an ein PCR-Produkt anfügen will. Zu diesem Zweck werden Primer so konstruiert, dass die Sequenz der gewünschten Schnittstelle an günstiger Stelle in die Primersequenz eingefügt wird. Es sollten möglichst kleine Änderungen der zur Template-DNS komplementären Sequenz gewählt werden, um die Anlagerung des Primers an die Template-DNS möglichst wenig zu stören. Die Primer werden wie gewohnt in eine PCR eingesetzt und die Annealing-Temperatur entsprechend der Länge und Zusammensetzung des mit der Template-DNS komplementären Primerabschnitts gewählt. Das hierbei entstehende PCR-Produkt wird anschließend aufgereinigt und kann dann in einen Restriktionsenzym-Verdau eingesetzt werden, um später beispielsweise in ein Plasmid ligiert zu werden.

2.2.12 Mutagenese bakterieller Plasmid-DNS mittels linearer PCR-Fragmente (ET-Rekombination)

Bei der Klonierung der beiden yadA-Knockout-Mutanten der Y. pseudotuberculosis-Stämme IP32953 und YPIII kam die Methode der Rekombination zum Einsatz. Der Begriff ET-Rekombination oder „ET-Cloning“ bezieht sich auf die E. coli-Rekombinasen RecE und RecT, mittels welcher nach der Erstbeschreibung der Methode größere Sequenzen bis ganze Gene ausgetauscht werden können (Zhang, et al., 1998). Eine Weiterentwicklung der

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Methode nutzt hierfür die Lambda-Phagen-Rekombinasen Red-α, Red-β und Red-γ (Zhang, et al., 2000). Die hier angewendete Methode stellt eine Variante des vereinfachten Protokolls von Datsenko und Wanner dar (Datsenko, et al., 2000). Es wurde auf den abschließenden Schritt der Deletion der Antibiotika-Resistenz-Kassette verzichtet, da diese für die weitere Verwendung der Plasmide gebraucht wurde.

Die Methode beruht auf dem Austausch eines DNS-Bereichs mittels homologer Rekombination. Es werden in einer PCR DNS-Fragmente produziert, die eingerahmt werden von Sequenzen, welche mit den Sequenzen, die den auszutauschenden DNS-Bereich begrenzen, übereinstimmen. Um später eine Selektion vornehmen zu können, kodiert die Sequenz zwischen den Homologie-Bereichen für eine Antibiotika-Resistenz, in dieser Arbeit für eine Kanamycin-Resistenz (siehe Abb.5). Dieses PCR-Produkt wird aufgereinigt und mit dem Restriktionsenzym DpnI inkubiert, um die Template-DNS zu entfernen. Die DNS wird präzipitiert und gewaschen und schließlich in Aquabidest aufgenommen.

PCR- und Aufreinigungs-Protokoll:

10x PCR-Puffer (Perkin-Elmer) 5 l

2 mM dNTP-Mix (dTAP, dCTP, dGTP, dTTP) 5 l 100 M Primer: pACYC177-Kana_IP-315_DW-f 0,5 l 100 M Primer: pACYC177-Kana_IP-1159_DW-r 0,5 l

Taq-Polymerase (Perkin-Elmer) 0,25 l

Plasmid-DNS: pACYC 177 2,5 l

Aquabidest ad 50 l

Es werden 35 Zyklen unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Start-Denaturierung: 94 °C 5 min

18 Zyklen: Denaturierung: 94 °C 30 sec

Annealing: 56 °C bis 45 °C

(um 1 °C pro Zyklus senken)

2 min

Amplifikation: 68 °C 2 min

17 Zyklen: Denaturierung: 94 °C 30 sec

Annealing: 45 °C 2 min

Amplifikation: 68 °C 2 min

Abkühlung: 4 °C bis zum Abbruch

Die Aufreinigung der DNS erfolgte mittels des Ultra Clean Gel Spin Reinigungskits von MoBio (Carlsbad, USA). Die DNS wird in 50 l Aquabidest aufgenommen. Zu der eluierten DNS werden 6 l 10x DpnI-Reaktions-Puffer und 2 l DpnI (10 U/l) zugegeben und der

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Reaktionsansatz für 90 min bei 37 °C inkubiert. Zur Präzipitation der DNS werden 180 l 100 %-iges Ethanol und 6 l 3 M Natriumacetat zugegeben und dieses Gemisch bei –80 °C für 15-30 min inkubiert. Folgend wird es 15 min bei 13000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Das Pellet wird mit 70 %-igem Ethanol gewaschen und in 10 l Aquabidest aufgenommen. In den Stamm, auf dessen Plasmid ein solcher Austausch erfolgen soll, muss zuvor das Plasmid pKD46 eingebracht werden. Dies erfolgte mittels Elektrotransformation (siehe 2.2.2.4). Das Plasmid pKD46 kodiert für die Rekombinasen Red-α, Red-β und Red–γ. Diese Proteine haben eine Exonuklease- und Annealing-Protein-Funktion und sind notwendig für die homologe Rekombination. Der hieraus gewonnene Stamm muss ebenfalls elektrokompetent gemacht werden (siehe 2.2.2.3). Das Medium für die hierfür angeimpfte Hauptkultur muss neben den Selektionsantibiotika auch 0,1 % L-Arabinose enthalten. Diese induziert die Expression von Redα, Redβ und Redγ. Die elektrokompetenten Bakterien können bei -80 °C gelagert werden.

Das aufgereinigte PCR-Produkt wird mittels Elektroporation in die vorbereiteten Bakterien eingebracht. Zur Elektrotransformation werden 500 l der elektrokompetenten Yersinien und 10 l der eluierten DNS eingesetzt. Anschließend werden die transformierten Bakterien für 90 min bei 150 rpm im Thermoschüttler inkubiert, in dieser Zeit sollen die Bakterien ihre Kanamycin-Resistenz exprimieren. Dann werden 100 l, 200 l und 400 l der Suspension auf Kanamycin-haltigem LB-Agar ausplattiert, für 2-3 Tage bei 27 °C inkubiert und die gewachsenen Klone mittels PCR-Screening und Sequenzierung auf eine erfolgte Deletion untersucht.

2.2.13 Konstruktion von Plasmiden und Stämmen

Ein groβer Teil der Experimente wurde mit einer bereits vorhandenen Sammlung verschiedener Stamm- und Plasmid-Konstrukte von Y. enterocolitica durchgeführt

Zusätzlich wurden in dieser Arbeit yadA-defiziente Varianten der Y. pseudotuberculosis-Stämme IP32953 und YPIII erstellt, um ihr Verhalten im Mausinfektionsmodell mit dem der Y. enterocolitica-Mutanten zu vergleichen. Weiter wurden die yadA-Gene aus den pYV-Plasmiden in das Plasmid pAC-F kloniert und in den Stamm Y. enterocolitica WA-CΔinv eingebracht. Diese Stämme exprimieren außer YadA keine weiteren Virulenzfaktoren und wurden für die verschiedenen in-vitro-Studien genutzt, um so den Einfluss von YadA isoliert beurteilen zu können.

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Abb.5: Schematische Darstellung der Hauptschritte der ET-Rekombination (nach Datsenko & Wanner, 2000)

2.2.13.1 Verwendung von E. coli-Stämmen mit pGPS-Plasmiden

In Vorarbeiten stellte N. Ackermann yadA-Varianten-tragende Plasmide her, indem zunächst die yadA-Gene der Y. enterocolitica-Stämme 8081 und 108-p und der Y. pseudotuberculosis- Stämme IP32953 und YPIII ohne ihre jeweilige Siganlsequenz in das Suizidplasmid pGPS-SS einbrachte. Dieser Vektor enthält vom Y. enterocolitica O:8 WA-314-yadA-Gen lediglich die Signal- und Terminator-Sequenz enthält, wodurch die Voraussetzung für eine einheitliche stammspezifische YadA-Synthese und -Sekretion geschaffen ist. Hierbei entstanden die Plasmide pGPS-8081, pGPS-108-p, pGPS-IP32953 und pGPS-YPIII.

Weiterhin konstruierte N. Ackermann zwei yadA-Hybrid-tragende Plasmide, pGPS:IP32953H und pGPS:YPIIIH, mit Hilfe von pGPS-A-H. Bei pGPS-A-H handelt es sich um das Suizidplasmid mit WA-314-YadA ohne bp 88-565, was der yadA-Kopfregion entspricht (Ackermann, 2005; Roggenkamp, et al., 2003). Für die Konstruktion der yadA-Hybride wurden von den yadA-Genen der Stämme IP32953 und YPIII die yadA-Abschnitte amplifiziert, welche für die jeweilige Kopf-Region kodieren. Die PCR-Produkte wurden aufgrund der gewählten Primer durch SacI-Schnittstellen begrenzt (Primer siehe 2.1.6). Beide

2: Transformation des red-α , -β und -γ Recombinase exprimierenden Stamms 1: Amplifizierung der Kanamycin-Kassette mit flankierenden überlappenden Bereichen

3: Selektion der Antibiotika-resistenten Mutanten

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Abb.6: Darstellung des modularen Aufbaus des Oca-Proteins YadA (A) und des geplanten Austauschs (B) der Kopf-Region (K) von Y. enterocolitica WA-314 YadA durch die Kopf-Region von Y. pseudotuberculosis Typ III: A) komplettes Oca-Protein YadA aus Y. enterocolitica O:8 (Stamm WA-314) aus den Strukturmodulen Kopf (K), Stiel (S) und Membrananker (A); B) Austausch des Kopfes von A) durch die Kopf-Domäne von Y. pseudotuberculosis Typ III; C) Aufbau des YadA-Gens (SS=Signalsequenz) (aus Heesemann & Ackermann, 2007) (Heesemann, et al., 2007)

PCR-Produkte wurden mit SacI verdaut und jeweils in das ebenfalls mit SacI geöffnete Plasmid pGPS-A-H kloniert wodurch die Plasmide pGPS:IP32953H und pGPS:YPIIIH entstanden (Abb.6). Alle hier beschriebenen pGPS-Plasmide wurden schließlich in den E. coli Stamm SM10 λpir transformiert (2.1.5.1).

2.2.13.2 Verwendung von Y. enterocolitica-Stämmen mit modifizierten pYV-Plasmiden Für die Mausinfektionsversuche wurden die von N. Ackermann erstellten Y. enterocolitica- Stämme WA 314 AS, A1, AS-8, AS-3, AS-I, ASS-I, pYV-AS-III und pYV-ASS-III verwendet (Nägele, 2010; Roggenkamp, et al., 1995a; Roggenkamp, et al., 2003). Diese entstanden durch Konjugation des jeweiligen pGPS-Suizidplasmid tragenden E. coli-Stammes mit der yadA-negativen Yersinie WA-314 pYV-A0, wie beschrieben bei Roggenkamp et al., 1995.

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2.2.13.3 Erzeugung einer plasmidlosen Variante von Y. pseudotuberculosis YPIII

Mittels der Methode der „Plasmid-Heilung“ entstand eine plasmidlose Variante von Y. pseudotuberculosis YPIII und IP32953 (2.2.3). Diese Stämme sind folglich defizient für alle pYV-plasmidkodierten Gene.

2.2.13.4 Konstruktion von Y. enterocolitica- und Y. pseudotuberculosis-Stämmen mit pACYC-Plasmiden

Für In-vitro-Studien wurden Stämme benötigt, die es erlaubten die Rolle der YadA-Varianten ohne den Einfluss zusätzlicher Virulenzfaktoren, wie dem chromosomal kodierten Invasin und der anderen auf dem Virulenzplasmid kodierten Faktoren zu untersuchen. Hierfür wurden die yadA-Varianten und die yadA-Hybride in das Plasmid pAC-F kloniert. Dieses Plasmid basiert auf pACYC184 und besitzt das virF-Gen, das für den yadA-Transkriptionsaktivator VirF kodiert (virF-Promotorregion; 151 bp vor dem virF und das komplette virF-Gen mit 86bp der Terminatorregion) (Chang, et al., 1978; Nägele, 2010). Die yadA-Varianten und -Hybride wurden aus den entsprechenden Plasmiden mit den Oligonukleotiden A-144f-XbaI und A-119r-BamHI amplifiziert und mit XbaI und BamHI verdaut. Diese Fragmente wurden in den mit BamHI und XbaI eröffneten Vektor pAC-F ligiert und als AS-8, pAC-F-AS-3, pAC-F-AS-I, pAC-F-ASS-I, pAC-F-AS-III und pAC-F-ASS-III bezeichnet. Die Plasmide pAC-F und pAC-F-A1 stammen aus der Dissertation von V. Nägele (Nägele, 2010).

Sie entsprechen den dort als pACYC184:virF (pAC-F) und pACYC184:virF:yadA (pAC-F-A1) bezeichneten Plasmiden. pAC-F wurde kloniert, indem in das Plasmid pACYC184 mittels SalI- und SphI-Schnittstelle das virF-Gen von WA-314 eingebracht wurde. Für die Konstruktion von pAC-F-A1 wurde yadA mit den Oligonukleotiden 144f-XbaI und A-119r-BamHI aus dem Plasmid pGPS-A1 amplifiziert und über XbaI und BamHI in pAC-F ligiert (Nägele, 2010). Alle Plasmide wurden erst in den Ca²⁺-kompetenten E coli-Stamm DH5α transformiert, bevor sie dann weiter in elektrokompetente Y. enterocolitica WA-CΔinv transformiert wurden. Y. enterocolitica WA-CΔinv stellt eine Invasin-defiziente Mutante der plasmidlosen Y. enterocolitica WA-C dar (Ruckdeschel, et al., 1996).

2.2.13.5 Konstruktion der yadA-defizienten Y. pseudotuberculosis-Stämme

Mittels der Methode der ET-Rekombination wurde das yadA-Gen in den Y. pseudotuberculosis-Stämmen IP32953 und YPIII durch Austausch gegen eine Kanamycin- ligiert

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Abb.7: Schematische Darstellung der klonierten YadA-Varianten und –Hybride (aus Heesemann & Ackermann, 2007). Y. enterocolitica YadA-Varianten unterscheiden sich durch die Länge des „Stiels“.

Y. pseudotuberculosis YadA-Varianten haben nach bioinformatischen Vorhersagen eine voluminösere Kopfstruktur als die von Y. enterocolitica.

Kassette deletiert (2.2.12). Hierfür wurde das Gen für die Kanamycin-Resistenz von pACYC177 mittels spezieller Primer amplifiziert, welche der N-terminalen (forward-Primer) bzw. C-terminalen (reverse-Primer) Grenzregionen des yadA-Gens entsprechen. Durch Selektionsdruck und Hilfestellung der auf dem Plasmid pKD46 kodierten Enzyme erfolgte der Austausch des yadA-Gens gegen die Kanamycin-Kassette. Die so entstandenen Plasmide pYV32953::kanΔyadA und pIB1::kanΔyadA sind folglich yadA-defizient.

2.2.14 DNS-Sequenzierung

Zur Sequenzierung aller neuklonierten Stämme wurden ihre Plasmide isoliert. Hierfür wurden 10 l einer Lösung von 50-80 ng/l der isolierten DNS mit 4 l eines forward-Primers bzw.

eines reverse-Primers, die die entsprechende Region begrenzen, zusammengegeben. Diese Proben wurden an die Firma Agowa (Berlin) geschickt und dort als Auftragsleistung sequenziert.

Y. enterocolitica-YadA-Varianten Y. pseudotuberculosis-YadA-Varianten

Y. enterocolitica/pseudotuberculosis-YadA-Hybrid-Varianten A1 AS-8 AS-3 AS-I AS-III Stamm

Serotyp

ASS-I ASS-III

Köpfe von Y. pseudotuberculosis YadA Stiel + Pore von

Y. enterocolitica YadA Serotyp O:8, WA-314

O:8 O:8 O:3 I III

55 2.2.15 Stammkonservierung

Zur Konservierung aller neukonstruierten Stämme wurden 3 ml-Übernachtkulturen in LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum mit einer Kolonie beimpft und bei 27 °C (Yersinien) bzw. 37 °C (E. coli) inkubiert. Diese wurde abzentrifugiert (4000 rpm, 2 min).

Das Pellet wurde in 1 ml Einfriermedium aufgenommen. Die Probe wurde in einem Eppendorf-Gefäß bei –80 °C in der Stammsammlung eingefroren.

2.2.16 Isolierung von bakteriellen Außenmembranproteinen (Outer Membrane Proteins, OMP)

Um YadA in der Außenmembran nachzuweisen, wurden die Proteine der äußeren Zellmembran der Yersinien isoliert.

Die Bakterien werden mittels physikalischer (Zentrifugation) und chemischer Trennschritte (Detergens) fragmentiert und so die Außenmembran isoliert. Hierfür werden die Bakterien mit Lysozym vorbehandelt, welches durch Hydrolyse des Mureins, das die Formstabilität der Bakterien vermittelt, zu Zellwanddestruktion führt. Zusätzlich werden die Bakterien mit EDTA und Sucrose inkubiert. EDTA entzieht der Zellmembran durch Komplexierung Ca²⁺

und Mg²⁺, was dazu führt, dass diese permeabler wird. Die Sucrose bedingt eine hyperosmolare Umgebung und damit Druckausgleich zum Zytoplasma. Ein vorzeitiges Platzen der Bakterienzelle wird verhindert. Durch das Zusammenwirken dieser Einflüsse verformen sich die Stäbchenbakterien zu kugelförmigen Sphäroblasten. Durch die Zugabe von Wasser und mittels Ultraschall werden die Bakterien destabilisiert und platzen. Von diesem Bakterienlysat wird durch Zentrifugieren (2000 x g) der verbleibenden Zelldebris als Pellet abgetrennt. Der Überstand wird nochmals hochtourig zentrifugiert, wobei sich die Gesamtmembran als Pellet absetzt. Diesem Pellet wird das Detergens Triton X-100 zugesetzt, welches die lipidreiche Innenmembran solubilisiert. Durch Zugabe von MgCl₂ wird die Außenmembran stabilisiert und nach Zentrifugation isoliert. Das Pellet wird in Aqua_bidest resuspendiert. Der Proteingehalt der OMP-Suspension wird bestimmt und die Proteine mit einer SDS-PAGE aufgetrennt.

Für die Isolierung der Außenmembranproteine wird eine 6 ml Vorkultur in LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum mit einer Kolonie des zu untersuchenden Stammes beimpft und über Nacht bei 27 °C inkubiert. Folgend wird eine 600 ml Hauptkultur, ebenfalls in LB-Medium mit Antibiotikum, 1:100 mit der Vorkultur beimpft und für sechs Stunden bei 37 °C im Schüttelinkubator angezüchtet. Anschließend wird sie für 15 min bei 4 °C und

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2000 x g abzentrifugiert. Das Pellett wird mit Waschpuffer zweimal gewaschen und anschließend in 3 ml Puffer I auf Eis resuspendiert. Der Suspension werden 6 ml Puffer II, 60 l Puffer III und 19,2 ml Aquabidest zugesetzt. Dies Gemisch wird bei Raumtemperatur (RT) 15 min unter leichtem Schwenken inkubiert, so dass sich Sphäroblasten ausbilden.

Anschließend wird die Probe für 45 sec (3 x 15 sec mit 10 sec Pausen) im Ultraschallbad beschallt. Dann wird die Probe für 40 min bei 1600 x g zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen, das Bakterienpellet verworfen. Der Überstand wird bei 6000 x g für 40 min zentrifugiert. Das Pellet (OMP und andere Membranbestandteile) wird mit Aquabidest

gewaschen und erneut zentrifugiert (1 h, 6000 x g). Das Pellet wird in 30 ml Extraktionspuffer aufgenommen und 20 min bei RT unter leichtem Schwenken inkubiert. Anschließend wird die Probe bei 6000 x für 40 min zentrifugiert. Das Pellet (OMP) wird zweimal mit 5 ml Aquabidest

gewaschen (30 min, 6000 x g). Anschließend wird das Pellet in 300 l Aqua_bidest aufgenommen. Die Probe kann zur Lagerung bei –20 °C eingefroren werden.

Folgend wird die in der Suspension enthaltene Proteinkonzentration mithilfe der Methode nach Lowry (siehe 2.2.19) bestimmt und in Analyse-SDS-PAGEs je 10 g Protein pro Spur eingesetzt.

Waschpuffer Tris

MgCl2

50 mM 1 mM

Puffer I Tris/HCL pH 8,0

H2Odest.

200 mM ad 1000 ml

Puffer II Tris/HCL pH 8,0

Sucrose EDTA H2Odest.

200 mM 1 M 1 mM ad 1000 ml

Puffer III Lysozym, pH 8,0

Puffer I

2 mg/ml ad 1 ml Extraktionspuffer Tris HCl, pH 8,0

MgCl Triton X-100 H2Odest.

6,1 g 2,0 g 20 ml ad 1000 ml

57 2.2.17 Proteinmengenbestimmung nach Lowry

Die Proteinkonzentration in der OMP-Präparation wurde mittels einer Variante der 1951 von Lowry et al. etablierten Methode (Markwell, et al., 1978) bestimmt. Lowrys Protokoll ermöglicht eine einfache und zuverlässige Bestimmung der Konzentration löslicher sowie unlöslicher Proteine (Lowry, et al., 1951).

Zunächst wird die Probe mit einem alkalischen Cu²⁺-Reagenz versetzt, mit welchem die Proteine eine Verbindung eingehen, die dem Biuret-Komplex ähnelt. Folgend wird der Probe das Folin-Ciocalteu-Reagenz zugegeben, welches durch die mit Cu²⁺ komplexierten Proteine reduziert wird. Als Reduktor wirkt einerseits das im Kupfer-Protein-Komplex vermutlich zu Cu⁺ reduzierte Kupferion und andererseits die aromatischen Aminosäurereste Tyrosin und Tryptophan, ohne vorherige Komplexierung mit dem Cu²⁺-Reagenz. Durch die Reduktion kommt es zu einem Farbumschlag von Gelb zu Blau, der zur photometrischen Bestimmung der Proteinkonzentration genutzt wird. Zum Erstellen einer Eichgeraden werden mehrere Proben (z. B. Albumin) mit bekannter Proteinkonzentration eingesetzt und die Extinktion der Blau-Färbung bestimmt. Die gemessene Extinktion wird als Funktion der Proteinkonzentration der Eichproteinlösungen graphisch dargestellt und der Extinktionskoeffizient aus dem Anstieg der resultierenden Geraden ermittelt. Mit diesem kann nun für eine beliebige Probe mittels des Lambert-Beerschen Gesetzes die Proteinkonzentration berechnet werden.

Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz gilt:

E

λ =

ε

_{λ *}

c

*

d

E_λ - Extinktion bei der Wellenlänge λ; ε_λ - molarer Extinktionskoeffizient bei der Wellenlänge λ; c - Konzentration;

d - Schichtdicke

Es wird eine Albuminstammlösung angesetzt, indem man 10 mg Rinderserumalbumin (BSA) in 100 ml Aqua_bidest löst. Diese hat eine Proteinkonzentration von 100 g/ml. Folgend wird eine Verdünngsreihe von 10 g/ml – 20 g/ml – 30 g/ml – 50 g/ml – 90 g/ml (jeweils 1 ml) vorbereitet, sowie 1 ml Aqua_bidest zur Bestimmung des Leerwerts. Von den Membranpräparationen, deren Proteinkonzentration bestimmt werden soll, werden 2:100-Verdünnungen in Aqua_bidest angesetzt (je 1 ml). Es werden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt.

Man gibt zu allen Proben jeweils 3 ml Reagenz C, vermischt sie gründlich und lässt sie 10 min bei RT inkubieren. Danach gibt man zu jeder Probe 300 ml einer 50 %-igen Folin-Lösung, vermischt sie abermals kräftig und lässt sie 45 min bei RT inkubieren. Folgend wird

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die Extinktion des entstandenen blauen Farbstoffs bei 750 nm am Absorptionsspektralphotometer bestimmt.

Reagenz A Na2CO3

NaOH KNa-Tartrat SDS

2 % 0,4 % 0,16 % 1 %

Reagenz B CuSO₄ x 5H₂O 4 %

Reagenz C Reagenz A

Reagenz B

(erst kurz vor Gebrauch mischen)

100 ml 1 ml

Folin-Lösung 50 %-Folin-Ciocalteu-Reagenz in H2O

2.2.18 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-PAGE stellt eine Methode dar, um denaturierte Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufzutrennen. Dies geschieht in einem diskontinuierlichen Puffersystem (Laemmli), wofür eine gründliche Denaturierung und Ladungsangleichung der Proteine wichtig ist. Hierfür werden die Proteine zur Denaturierung 10 min aufgekocht (100°C) und durch Zugabe von β-Mercaptoethanol eine Spaltung von Disulfidbrücken bewirkt. Die Ladungsangleichung erfolgt durch Inkubation mit Natriumdodecylsulfat (SDS), welches durch seine negative Ladung die Eigenladungen der Proteine ausgleicht. Die Proben werden in SDS-Probenpuffer mit Bromphenolblau und β-Mercaptoethanol aufgenommen und auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen, in dem sie bei einer Stromstärke von 15 mA und einer Spannung von 180 V entsprechend ihres Molekulargewichts aufgetrennt wurden. Das Bromphenolblau dient hierbei dazu, den Lauf der Banden zur Anode sichtbar zu machen. Um deutlichere Proteinbanden zu erzielen, hat es sich bewährt ein Gel zu nutzen, das aus zwei verschiedenen Anteilen besteht. So gießt man in einem vertikalen System zuerst ein Trenngel von etwa 6 cm Höhe, dieses ist der Anteil, in welchem die Proteine aufgetrennt werden. Der zweite Anteil, das Sammelgel von etwa 1 cm Höhe, welches über dem Trenngel gegossen wird, dient dem gleichmäßigen Einlaufen und Sammeln der Proteine an der Grenze zwischen Sammel- und Laufgel. Als Marker wird ein Proteinmix mit definierten Molekulargewichten

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im Bereich von 10 bis 220 kDa („BenchMark“, Invitrogen) verwendet. Der Gellauf wird beendet, sobald die Farbfront das untere Ende des Gels erreicht hat. Bei 80 V dauert dies etwa 90 bis 120 min.

Grundsätzlich besteht die Möglichkeit sämtliche im Gel vorhandenen Proteine in einer Coomassie-Färbung darzustellen oder anhand eines Immunoblots gezielt bestimmte Proteine mit einem gegen sie gerichteten Antikörper enzymatisch sichtbar zu machen. In dieser Arbeit waren die SDS-Gele Ausgangsprodukt für einen Immunoblot und wurden im Anschluss mit Coomassie gefärbt (Darstellung der Restproteine). Da während des elektrophoretischen Transfers nicht alle Proteine vollständig auf die Membran übertragen werden, ist die anschließende Gelfärbung sinnvoll.

30 % Acrylamid-Lösung: Acrylamid Bisacrylamid H2Odest.

44 g 0,8 g ad 100 ml

4 % Sammelgel: 250 mM Tris, pH 6,8

30 % Acrylamid 10 % SDS H2Odest.

zum Polymerisationsstart:

10 % APS TEMED

2,5 ml 0,5 ml 0,1 ml 1,9 ml 30 l 30 l

11 % Trenngel: 750 mM Tris, pH 8,8

30% Acrylamid 10 % SDS H₂O_dest.

zum Polymerisationsstart:

10 % APS TEMED

5,0 ml 2,5 ml 0,2 ml 2,3 ml 40 l 20 l 10 x Laufpuffer nach Laemmli: Tris-HCl

Glycin H2Odest.

30,2 g 142,6 g ad 1000 ml (1 x Laufpuffer nach Laemmli zusätzlich angesetzt mit 0,1 % SDS)

60 SDS-Probenpuffer:

(Stopmix)

Tris-HCl, pH 6,8 SDS

Glycerin

β-Mercaptoethanol Bromphenolblau

125 mM 4 % 20 % 2 % 0,01 %

2.2.19 Immunoblot/ Western Blot

Der Western Blot ist eine Methode zur selektiven antikörpervermittelten Darstellung einzelner Proteine aus einem Proteingemisch. Die Methode des Western Blots gestaltet sich zweischrittig. Im ersten Schritt erfolgt die elektrophoretische Übertragung der in der SDS-PAGE nach Molekulargewicht aufgetrennten Proteine auf eine proteinbindende Membran. Im zweiten Schritt wird diese mit Antikörpern inkubiert, um schließlich die nachzuweisenden Proteine sichtbar zu machen. Für die Übertragung der Proteine wird das Gel auf eine zuvor mit Methanol aktivierte Nitrozellulose-Membran gelegt.

Das Gel auf der Membran wird zusammen mit Schaumstoff und Filterpapier entsprechend folgender Schichtung in ein Kunststoffmodul für die Laufkammer eingesetzt:

Anodenseite des Kunststoffs Schaumstoff

Whatman-Pappe Nitrozellulose-Membran

Proteingel Whatman-Pappe

Schaumstoff

Kathodenseite des Kunststoffs

Hierbei ist wichtig zu beachten, dass alle Elemente gut durchfeuchtet sind, um Luftblasen zu vermeiden, welche eine Übertragung der Proteine stören würden. Das Gel wird zusammen mit einem Kühlaggregat vertikal in eine Blot-Kammer eingesetzt, in welcher für eine Stunde bei 0,3 A und 80 V die Elektrophorese erfolgt. Anschließend wird das Gel von der Membran entfernt und in eine Coomassie-Färbung eingesetzt. Man trennt von der Membran den Bereich ab, auf den der Marker geblotet wurde, und gibt ihn in ein Amidoschwarzfärbebad (0,8 % w/v in 10 % Essigsäure, 5 % Methanol). Die Anfärbung des Markers ermöglicht eine sofortige Erfolgskontrolle der Proteinübertragung.

Die Membran wird über Nacht bei 4 °C in PBST (0,5 %) mit 20 % FKS inkubiert, um sie gegen eine unspezifische Bindung der später eingesetzten Antikörper abzusättigen. Danach wird die Membran 3 x 10 min mit PBST (0,05 %) unter leichtem Schwenken gewaschen. Die

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Membran wird 90 min unter leichtem Schwenken mit der Erstantikörper Verdünnung (1:1000 in PBST) inkubiert und anschließend wie zuvor gewaschen. Als Erstantikörper wurden YadA-spezifische monoklonale (8D1) und polyvalente Antikörper (P1-I und P1:O8) verwendet (1:1000). Bei 8D1 handelt es sich um einen monoklonalen Mausantikörper gegen die AS 290-330 im YadA-Stiel-Bereich, während P1:O8 und P1-I polyvalente Kaninchenantiseren gegen das gesamte YadAent respektive YadApstb sind. Danach wird die Membran für 60 min in der Zweitantikörper-Verdünnung (1:2000) unter leichtem Schwenken inkubiert und anschließend wiederum wie zuvor gewaschen. Bei dem Zweitantikörper handelt es sich um einen kommerziel erhältlichen Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (für polyklonale Erstantikörper) oder Anti-Maus-IgG-Antikörper (für monoklonale Erstantikörper), der mit Peroxidase konjugiert ist (Sigma-Aldrich, Taufkirchen). Der Zweitantikörper bindet an den Fc-Teil des Erstantikörpers, so dass dessen Bindungsort gezielt nachgewiesen werden kann. (Liste der verwendeten Antikörper unter 2.1.7). Um den Blot zu entwickeln, wird das „ECL Western Blotting System“ (GE Healthcare, München), das mit der Peroxidase reagiert, entsprechend Herstellerangaben angewandt. Dann wird ein Röntgenfilm zur Belichtung auf die vorbereiteten Membranen gelegt und folgend entwickelt.

10 x Blotting-Puffer nach Laemmli

Tris Glycin H₂O_dest.

30,3 g 144,1 g ad 1000 ml 1 x Blotting-Puffer 10 x Laufpuffer nach Laemmli

Methanol H2Odest.

100 ml 200 ml ad 1000 ml

10 x PBS, pH 7,4 NaCl, pH 7,4

KCl Na2HPO4

KH2PO4

H2Odest.

80 g 2 g 14,4 g 2,4 g ad 1000 ml

PBS-T 1 x PBS

Tween 20 0,5 %

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Blockierungs-Lösung fötales Kälberserum (FKS) 2 % in PBS-T

Substratlösung Diethanolamin, pH 9,6 H2Odest.

100 ml ad 1000 ml Substratgebrauchslösung Substratlösung

0,9 %-NaCl-Lösung 1 M MgCl₂-Lösung

200 ml 800 ml 100 l NBT-Lösung Nitroblautetrazoliumchlorid in H2Odest. 1 mg/ml BCIP-Lösung 5-Brom-4-chloro-3-indolylphosphat

in Dimethylformamid

5 mg/ml

Färbelösung Substratgebrauchslösung

NBT-Lösung BCIP-Lösung

9 ml 1 ml 100 l

2.2.20 Coomassie-Färbung eines Proteingels

Durch eine Färbung mit Coomassie ist es möglich, alle im Gel enthaltenen Proteine anzufärben und somit darzustellen. Coomassie lagert sich an die basischen Seitenketten der Aminosäuren und färbt dadurch Proteine unspezifisch an. (Weber, et al., 1969)

Hierfür wird das Gel für 30 min in Coomassie-Färbelösung unter leichtem Schwenken inkubiert. Anschließend wird es etwa eine Stunde, nach Bedarf länger, in Destain-Puffer entfärbt, welcher mehrfach gewechselt wird. Folgend wurden alle Gele fotografiert und später getrocknet, wodurch sie längerfristig aufbewahrt werden können.

Coomassie-Blau-Färbelösung: Coomassie Brilliant Blue Methanol

Essigsäure Aqua dest.

0,005 % 50 % 10 % 40 % Entfärberlösung (Destain-Puffer) Methanol

Essigsäure H₂O_dest.

500 ml 75 ml ad 1000 ml

63 2.2.21 IFM (Immunfluoreszenz-Mikroskopie)

Die IFM ermöglicht den mikroskopischen Nachweis von YadA auf der Oberfläche der YadA-klonierten Stämme. Dies gelingt analog zur später beschriebenen immunhistologischen Färbung durch eine Primärinkubation mit einem YadA-spezifischen Antikörper und eine Zweitfärbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Zweitantikörper, der an den Fc-Teil des Erstantikörpers bindet und unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden kann.

Für diese Methode werden Vorkulturen in 3 ml RPMI-Medium mit Selektionsantibiotikum über Nacht bei 27 °C im Schüttelinkubator angesetzt. Diese werden 1:40 auf Hauptkulturen in 5 ml RPMI-Medium mit Selektionsantibiotikum überimpft, die bei 37 °C über Nacht ebenfalls im Schüttelinkubator angezüchtet werden. Von der Hauptkultur wird 1 ml abzentrifugiert und das Pellet zweimal mit PBS gewaschen. Es wird anschließend in PBS aufgenommen und eine OD₆₀₀ von 0,05 eingestellt. Von dieser Verdünnung werden 20 l auf einen Objektträger gegeben und abgedeckt über 30 min bei RT trocknen gelassen. Auf jede Probe werden 15 l einer 8D1-Erstantikörperverdünnung (Maus, 1:500) gegeben. Man lässt die Objektträger für 30 min in einer feuchten Kammer bei 37 °C im Brutschrank inkubieren.

Anschließend werden sie 2 x 5 min mit PBST gewaschen und trocknen gelassen. Dann gibt man auf jede Probe 20 l einer 1:300-Sekundärantikörperlösung (FITC anti-Maus) und lässt die Objektträger 30 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren. Danach werden die Proben nochmals 2 x 5 min mit PBST gewaschen und abgedunkelt trocknen gelassen.

Anschließend deckt man sie mit Mowiol (Roth, Karlsruhe) und einem Deckglas ein und dichtet die Ränder mit Nagellack ab, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Objektträger können abgedunkelt bei 4 °C bis zur mikroskopischen Auswertung gelagert werden. Die Auswertung dieses Versuchs erfolgte mit dem Olympus Bx61 bei 100-facher Vergrößerung.

Hierbei kann unter entsprechender Anregung (495 nm) des fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpers das Signal (521 nm) sichtbar gemacht und fotodokumentiert werden.

2.2.22 Agglutinationstests

Die hier vorgestellten Versuche testen das Agglutinationsverhalten der neu klonierten Stämme und somit auch die Produktion und Funktionalität von YadA.

Die Antikörperagglutination mit weitgehend spezifischen Antikörpern für verschiedene Varianten des YadA testen dessen Oberflächenlokalisation: Ist es auf der Oberfläche

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ausreichend vorhanden, agglutinieren die Bakterien bei Zugabe von Anti-YadA-Serum (Sory, et al., 1990). Die Autoagglutination stellt einen durch YadA vermittelten Virulenzmechanismus der Yersinien dar. Die Bakterien können Mikrokolonien im infizierten Gewebe bilden und somit der Wirtsabwehr besser widerstehen. Eine dem Wildtyp vergleichbare Autoagglutination weist auf das funktionsfähige Vorhandensein von YadA hin (Skurnik, et al., 1984).

2.2.22.1 Antikörperagglutination

Für die Testung der Agglutination mit verschiedenen Antiseren wird von diesen eine 1:300-Verdünnung in PBS angesetzt. Von den zu testenden Bakterien wird zuvor erst eine Vorkultur auf Selektionsagar über Nacht bei 27 °C angezüchtet und am folgenden Tag eine Hauptkultur wiederum auf Selektionsagar bei 37 °C über Nacht angesetzt. Von der verdünnten Antikörper-Lösung wird ein Tropfen von etwa 15 l auf einen Glasobjektträger gegeben. Mit einer Impföse wird eine kleine Menge der Hauptkultur abgenommen und in diesen Tropfen eingerieben. Danach wird der Objektträger etwas geschwenkt und im Verlauf über 5 min auf Ausflockung oder Schollenbildung beobachtet. Das Ergebnis dieses Versuchs wird als Positiv- bzw. Negativ-Ergebnis der als Ausflockung sichtbaren Agglutination protokolliert.

Dieser Versuch wurde in dieser Arbeit mit weitgehend speziesspezifischen Anti-YadA-Antikörpern/-seren durchgeführt. Hierbei wurde zum einen der polyklonale Antikörper P1-O8 verwendet, der gegen Y. enterocolitica Serotyp O8 gerichtet ist, und der polyklonale Antikörper PI-1, der gegen Y. pseudotuberculosis Serotyp I gerichtet ist.

2.2.22.2 Autoagglutination

Für diese Methode werden von den zu untersuchenden Bakterien Vorkulturen in 5 ml RPMI-Medium mit Selektionsantibiotikum über Nacht bei 27 °C im Schüttelinkubator angesetzt. Diese werden auf Hauptkulturen in 5 ml RPMI-Medium mit Selektionsantibiotikum überimpft, wobei eine OD600 von 0,1 eingestellt wird, und diese bei 37 °C über 7 Stunden im Brutschrank (ohne Schütteln) inkubiert (Skurnik, et al., 1984).

Hierbei ist wichtig zu beachten, dass die Hauptkulturen in Glasröhrchen angesetzt werden, um eine Verfälschung des Ergebnisses durch eine Agglutination an Plastik auszuschließen.

Anschließend werden die Proben bewertet und beschrieben. Hierbei wird darauf geachtet, wie sich die Bakterien in dem Medium verhalten, ob das Medium klar ist und sich ein

Im Dokument Vergleichende Untersuchungen zur Adhärenz und Mauspathogenität von Yersinia-Adhäsin (YadA)-Varianten verschiedener Yersinia-Arten und -Serotypen (Seite 57-86)