4.1 Festphasenextraktion und Wiederfindung
4.1.1 Vergleich verschiedener Hersteller und selbstgepackte Kartuschen
Der Vergleich verschiedener Festphasen wurde mit der apparativen Ausrüstung lt. Kap. 3.3 durchgeführt. In Abweichung zu der in Kap. 4.2 beschriebenen Arbeitsweise wurde die nicht derivatisierte Stoffgruppe separat von der derivatisierten Stoffgruppe mit On-Column-Injektion gemessen. Die derivatisierten Substanzen wurden gemäß Kap. 4.1.6 methyliert oder butyliert, da zu diesem Zeitpunkt noch kein praktikables Silylierungsreagenz vorlag. Auch nicht alle Steroidhormone waren vorhanden, sodass zur Abschätzung der Wiederfindungen in dieser Substanzgruppe die Wiederfindung von Ethinylestradiol betrachtet wurde. Die Wiederfindung der PCB wurde wie die der anderen Steroidhormone zu einem späteren Zeitpunkt auf einem niedrigeren Level (10 ng/l) durchgeführt. Die Produktion von techn. Octylphenol (bestehend aus 2 Isomeren) wurde Mitte der 90er Jahre eingestellt [FREY 2000]. Somit war kein Standardmaterial im Handel, lediglich iso-Octylphenol, bestehend aus dem einen Isomer 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)-phenol. Zu einem späteren Zeitpunkt wurde vom Hygiene-Institut der Universität Bochum ein Standard von technischem Octylphenol zur Verfügung gestellt, bis dahin wurde ersatzweise iso-Octylphenol verwendet.
Da ein sehr großes Angebot an Festphaseextraktionskartuschen auf dem Markt angeboten wird und sich diese in punkto Eignung, Reinheit und Preis deutlich unterscheiden, musste eine Auswahl getroffen werden. Als angebracht erschienen C18-Reversed Phase- und die neuartigen Styrol/Divinylbenzol-Copolymer-Phasen (Handelsbezeichnung: SDB oder EN/ENV-Material), da die zu bestimmenden Substanzen unpolarer Natur sind.
Zunächst wurden die zur Routineanalytik von Pestiziden angewendeten, handelsüblichen Baker RP-18-endcapped Kartuschen getestet. Diese hatten einen entscheidenden Nachteil: Aus den Kartuschen gelangten große Mengen an technischem Nonylphenol und Phthalaten in die Extrakte und kontaminierten diese, wenn nur mit 3 ml Methanol vorgespült/konditioniert wurde (sdiehe Kap.
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Auf der Suche nach Alternativen wurden in einem Screening-Test mehrere erhältliche Festphasenkartuschen nur mit reinem Lösungsmittel eluiert und auf die enthaltenen Verunreinigungen untersucht. Die mit den Produkten von Restek, Supelco und Macherey & Nagel erhaltenen Blindproben zeigten in den erhaltenen Chromatogrammen schon sehr hohe Basislinien und eine Menge von großen, breiten Peaks, sodass diese Handelsmarken nicht in Betracht gezogen wurden.
Eine gesamte Marktübersicht kann an dieser Stelle allerdings nicht geboten werden, da von einigen Herstellern keine Festphasen vorlagen oder die Produkte nicht bekannt waren, z.B. von Varian. So
• Baker RP-C18 endcapped, 1g Sorbens, 6 ml Polypropylen-Hülse, Polypropylen-Fritte
• Merck Lichrolut EN, 200 mg Sorbens, 3 ml Polypropylen-Hülse, Polypropylen-Fritte
• Baker RP-C18 Polar Plus, 1g Sorbens, 6 ml Polypropylen-Hülse, Polypropylen-Fritte
• ict Kombiphase: RP-C18 / ENV-plus, 500 mg und 200 mg, 3 ml Glas-Hülse, mit Teflon-Fritten
Es wurden 4 parallele Wiederfindungsversuche mit den aufgeführten Substanzen auf dem Konzentrationslevel von 100 ng/l durchgeführt, dotiert in Leitungswasser. Gleichzeitig lief je ein Reagenzienblindwert des Leitungswassers mit eingestelltem pH 7,0 ± 0,2 dessen Ergebnisse subtrahiert wurden, sowie ein Kartuschen-Leerwert (Kartusche gemäß Arbeitsanweisung konditioniert und eluiert) mit. Die korrigierten Mittelwerte aus den jeweils 4 Messungen sind in Tabelle 6 und Tabelle 7 unter „korr. MW“ angegeben; „VK“ ist der relative Variationskoeffizient in Prozenten.
Tabelle 6: Vergleich der Wiederfindung von ausgewählten Xenoestrogenen auf SPE-Kartuschen verschiedener Hersteller mit verschiedenen Packungsmaterialien, Messung ohne Derivatisierung:
Kartuschen Baker
8. Diethylhexylphthalat 60 22 73 25 202 8 98 14
9. Benzylbutylphthalat 88 7 87 4 100 13 107 12
10. Dibutylphthalat 72 22 77 37 133 14 95 85
11. Diethylphthalat 65 38 71 9 86 16 84 17
alle Werte in % Wiederfindung von 100 ng/l
Tabelle 7: Vergleich der Wiederfindung von ausgewählten Xenoestrogenen auf SPE-Kartuschen verschiedener Hersteller mit verschiedenen Packungsmaterialien, Messung nach Derivatisierung mit TMSH oder TBSH:
Derivatisierung mit TMSH Deriv. mit TBSH
1. Ethinylestradiol 87 20 67 16 91 8 90 7
2. Diethylstilbestrol 60 11 50 15 46 9 2 117
3. Bisphenol A 93 1 82 8 85 19 7 31
4. techn. Nonylphenol 99 5 69 7 84 9 106 3
5. i-Octylphenol 83 1 77 7 80 6 110 4
alle Werte in % Wiederfindung von 100 ng/l
Die 4 getesteten handelsüblichen Kartuschen waren mit folgenden Einschränkungen zur Anreicherung der aufgeführten Substanzen geeignet:
Diethylstilbestrol war nicht effektiv anzureichern oder wurde nicht quantitativ von den Kartuschen eluiert. DES zeigte mit 60% Wiederfindung den höchsten Wert bei Baker C18ec; bei Merck Lichrolut EN, Baker C18 Polar Plus und der ict Kombiphase RP-C18/ENV+ nur 2 bis 50% Wiederfindung.
Lindan (16 und 32% WF) und z.T. die DDT-Derivate (um 50% WF) traten mit unzureichender Wiederfindung bei den Kartuschen mit SDB-Sorbentien: (Merck Lichrolut EN sowie ict-Kombiphase RP-C18/ENV+) auf; dies ist wahrscheinlich auf unzureichende Elution oder zu starke Retention auf diesem Phasenmaterial zurückzuführen.
α- und β-Endosulfan zeigten mit 13% und 8% geringe Wiederfindungen auf Baker RP-C18ec-Material.
Bisphenol A wird wie Diethylstilbestrol auf der ict-Kombiphase kaum angereichert.
Ethinylestradiol als Vertreter der Steroidhormone zeigte eine gute Wiederfindung um 90% auf allen Phasenmaterialien bis auf das Merck EN-Material, wo lediglich 67% WF erreicht wurden.
Durch die Subtraktion der Reagenzienblindwerte konnten die Wiederfindungen der Phthalate auf zumeist 70-100% korrigiert werden. Überhöhte Werte fanden sich dennoch bei DEHP und DBP im Baker RP-18 Polar Plus-Material. Der Fehler relativiert sich a) jedoch beim Arbeiten mit Oberflächenwasser, in welchem später höhere Konzentrationen gefunden wurden. Der Arbeitsbereich
wurden dem Vorkommen der Substanzen in Wasserproben entsprechend angepasst und für die Phthalate ein höherer Arbeitsbereich eingeführt. (siehe Kap. 4.1.2). Außerdem wurde hier b) in Abweichung zum unten beschriebenen, verbesserten Verfahren (Verwendung von selbstgepackten Kartuschen) noch mit handelsüblichen Polypropylenkartuschen und –Fritten gearbeitet. Bei Verwendung von Glaskartuschen und Teflonfritten wurden die Kontaminationen weiter verringert.
Die PCB besaßen eine schlechte Wiederfindung von wenigen Prozenten und sind deswegen nicht in der Tabelle aufgeführt. Sie verblieben auf dem Sorbensmaterial und wurden nicht von dem Elutionsmittel Ethylacetat, welches eine geringe Polarität besitzt, heruntergelöst. Die Elution, die in Abweichung zum unten beschriebenen Verfahren bis hierher mit 2 ml Ethylacetat durchgeführt worden war, wurde um einen Schritt mit 2 ml Hexan ergänzt (verbessertes Verfahren) und zeigte in der späteren Messreihe bessere Ergebnisse.
Insgesamt besaßen die Baker RP-C18 Polar Plus-Kartuschen mit generell 70-100% die höchsten Werte für die Wiederfindungen. Dieses Phasenmaterial wurde für die weitere Vorgehensweise ausgewählt. Dieses Material wurde in der Spurenanalytik zur Anreicherung verschiedener Stoffgruppen von [HEBERER 1994] bereits verwendet. Als Einschränkung gilt hier die schwache WF von 46% bei DES.
Eine ähnliche Eignung mit tendenziell etwas darunter liegenden Werten zeigten die Baker RP18ec-Kartuschen. Als Einschränkung ist die unzureichende WF von α- und β-Endosulfan und die knapp unter 70% liegende WF von Lindan und DES sowie von DEHP und DEP zu sehen.
Aufgrund der o.a. Gehalte von Phthalaten waren die Hülsen und Fritten der handelsüblichen Kartuschen mit Nachteilen behaftet. Durch Ausdehnung der bis hierher mit nur 3 ml Methanol durchgeführten Konditionierung zu einem Reinigungsschritt mit 15 ml Methanol konnte die Kontamination des Eluates auf ein akzeptables Maß heruntergesetzt werden. Durch die konsequente Mitführung eines Blindwertes (Konditionierung, Extraktion von undotiertem Leitungswasser, Elution) und eines Leerwertes (Kartuschen werden lediglich konditioniert und eluiert) in jeder Mess-Serie konnten die geringen restlichen Kontaminationen von technischem Nonylphenol (wenige ng/l) und Phthalaten (10-70 ng/l) subtrahiert werden.
Als weitere Punkte waren zu vermerken:
Auf blindwertfreie Materialien (Glas, Stahl, Teflon) der Probeflaschen, Zuleitungsschläuche und Adapter ist zu achten.
Handlingvorteil des SDB-Materials: Die Extraktion lief gleichmäßiger, schneller und leichter, bei einem geringerem Unterdruck zur Erzielung einer Flussrate von 10 ml/min. Der Grund war das grobkörnigere Packungsmaterial und das kleinere Sorbensbettvolumen.
pH 7 hat sich in vorangegangenen Wiederfindungsversuchen in verschiedenen Matrices (Kläranlagenauslauf und bidestilliertes Wasser) als am günstigsten erwiesen (siehe Anhang, Kap. 7). Ein alkalischer pH kam nicht in Betracht, da eine Deprotonierung der phenolischen Hydroxigruppen zu erwarten war, bei pH 2 zeigten sich empirisch schlechtere Werte für die AP, für BPA, DES, BCPS und EED.
Für die Extraktion von endokrin wirksamen Substanzen in verschiedenen Wässern arbeiteten auch andere Autoren mit RP-18 Kartuschen [BRÜLL 2000; SPENGLER 1999, 2000; TERNES 1999;
WEGENER 2000] meist bei pH 7, zum Teil bei pH 2 (bei Abwasser). Eine Kombi-Phase mit 10 mg Lichrolut EN und 250 mg RP-18 Material wurde von [STUMPF 1996] verwendet; er erreichte für Steroidhormone Wiederfindungen von 76-97 % bei einem ARF von 10.000 bei dotiertem Tiefstollenwasser. Ebenfalls Steroidhormone wurden an einer normalen RP-18-Phase von [SCHLETT 1996] mit Wiederfindungen von 64 bis 152 % angereichert.