Vergleich der spektroskopischen Eigenschaften

Bereits in früheren Arbeiten sind der SH-Komplex aus R. opacus sowie dessen Hydrogenase- und NADH:Akzeptor-Oxidoreduktase-Modul mittels EPR-Spektroskopie charakterisiert worden (Schneider et al., 1984a, C. Zaborosch, 1989, Zaborosch et al., 1995). Die dabei detektierten Signale, die den FeS-Clustern zugeordnet wurden, zeigten zum Teil andere Ausprägungen als in den EPR-Spektren der SH aus R. eutropha (Schneider et al., 1979, Lauterbach et al., 2011b, Lauterbach et al., 2011a). Ob sich diese Unterschiede auch für den heterolog produzierten und unter gleichen Bedingungen gereinigten SHRoMR11-Komplex reproduzieren lassen, sollte hier untersucht werden. Außerdem wurden erstmals die Redoxzustände des aktiven [NiFe]-Zentrums der SH aus R. opacus mittels FTIR-Schwingungsspektroskopie untersucht und mit denen des SHReH16-Komplexes verglichen.

Die in diesem Kapitel gezeigten X-Band-EPR-Spektren sowie die FTIR-Spektren wurden von Dr. Friedhelm Lendzian, Marius Horch und Stefan Wahlefeld am Max-Volmer-Laboratorium der TU Berlin aufgenommen und ausgewertet. Eine weiterführende Diskussion der FTIR-Spektren findet sich auch in der Masterarbeit von Stefan Wahlefeld (S. Wahlefeld, 2013). Die NADH-reduzierte SHReH16-Probe wurde von Lars Lauterbach präpariert.

Abb. 44 UV-vis-Absorptionsspektren der SH-Proteine aus R. eutropha und R. opacus im luftoxidierten Zustand. Die Spektren wurden auf eine Proteinkonzentration von 1 mg ml^-1 normalisiert.

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Ein initialer Vergleich der Absorptionseigenschaften der SH-Proteine aus R. eutropha und R. opacus im luftoxidierten Zustand mittels UV-vis-Absorptionsspektroskopie zeigte eine perfekte Überlagerung der Absorptionsspektren im für die FeS-Cluster charakteristischen Bereich von 320 bis 500 nm (Abb. 44). In den EPR-Spektren der beiden Enzymkomplexe konnten jedoch Unterschiede beobachtet werden (Abb. 45). Auffallend ist, dass das für [3Fe4S]⁺-Cluster spezifische Signal im Spektrum der oxidierten SHRoMR11 verbreitert ist und einen zusätzlichen Peak bei g=1.95 aufweist (Abb. 45). Weiterhin fällt auf, dass in dem bei 10 K aufgenommenen Spektrum der NADH/H2-reduzierten SHRoMR11 die Intensität der für [4Fe4S]⁺-Zentren charakteristischen Signale geringer ist als in den äquivalenten Spektren der SH aus R. eutropha (Abb. 45). Eine unvollständige Entkopplung der paramagnetischen Zustände des [2Fe2S]⁺- und des/der [4Fe4S]⁺-Cluster(s) bei 10 K im Fall der SH aus R. opacus wären eine mögliche Erklärung hierfür. Der Umstand, dass die Intensität des Semichinon-Signals bei g=2.01 im Spektrum der NADH-reduzierten SHReH16 deutlich erhöht ist, ist der Zugabe von externem FMN geschuldet (Abb. 45). Insgesamt lassen sich den Spektren der beiden SH-Varianten jedoch die gleichen Typen von [FeS]-Zentren zuordnen.

Dies sind substöchiometrische Mengen eines [3Fe4S]⁺-Clusters im oxidierten Zustand, ein [2Fe2S]⁺-Cluster im reduzierten Zustand bei T=20/35 K sowie ein [2Fe2S]⁺- und ein [4Fe4S]⁺-Cluster im reduzierten Zustand bei T=10 K (Abb. 45). Auch die Signale des aktiven Zentrums, d. h. Ni-B in oxidierten Proben und Ni-C in NADH-reduzierten Proben, treten in den Spektren beider SH-Komplexe mit gleicher Intensität auf (Abb. 45). Aufgrund der Sensitivität der EPR-Spektroskopie gegenüber kleinsten strukturellen und elektromagnetischen Änderungen kann die Ausstattung beider Enzyme mit EPR-aktiven Kofaktoren trotz geringer spektraler Unterschiede als äquivalent betrachtet werden.

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Abb. 45 EPR-Spektroskopie an der SHRoMR11 und der SHReH16. X-Band-Spektren (9,3 GHz) der unbehandelten, luftoxidierten Proben (as isolated) wurden bei 20 K aufgezeichnet. Zur Reduktion mit NADH/H2

wurden 5 mM NADH zur Proteinlösung gegeben und die Proben 30 min unter H2-Atmosphäre inkubiert.

Spektren dieser Proben wurden bei 20 K und 10 K aufgezeichnet. Zur Reduktion mit NADH wurden den Proteinlösungen 10 mM NADH in einer H2-freien Atmosphäre zugesetzt. Die entsprechenden Spektren wurden bei 35 K aufgezeichnet. Die NADH-reduzierte SHReH16-Probe enthielt zusätzlich 1 mM FMN. Alle Reduktionen wurden in 50 mM K-PO4 (pH 7,15) mit 5 % (v/v) Glycerin in Abwesenheit von Ni²⁺- und Mg²⁺-Ionen durchgeführt.

Auch die zur Charakterisierung der Zustände des aktiven [NiFe]-Zentrums aufgenommenen FTIR-Spektren der SHRoMR11-Proben zeigen große Ähnlichkeit zu den entsprechenden Spektren der SH aus R. eutropha (Abb. 46). Das Spektrum der luftoxidierten SHRoMR11-Probe lässt, wie beim SHReH16-Komplex, eine CO-spezifische Bande bei 1958 cm^-1 sowie vier CN^-

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spezifische Banden bei 2098, 2088, 2080 und 2070 cm^-1 erkennen (Abb. 46). Dieses Spektrum wird als Überlagerung zweier oxidierter [NiFe]-Spezies interpretiert (vgl. 3.3.2.7).

Bei den im SHRoMR11-Spektrum zusätzlich auftretendenen Banden (~2170 cm^-1 und 2027 cm^-1) handelt es sich höchstwahrscheinlich um Artefakte, die durch Wasserdampf bzw.

Verunreinigungen im Druckluftstrom hervorgerufen wurden (Stefan Wahlefeld und Marius Horch, persönliche Mitteilung). Im Spektrum der NADH/H2-reduzierten SHRoMR11-Probe waren Schwingungsmodi zu erkennen, die den CN^-- und CO-Liganden in den SR-, Ni-SR'-, Ni-SR''- und Ni-SR2-Zuständen zuzuordnen sind. Auffällig im Vergleich zum Spektrum der SH aus R. eutropha ist, dass die Intensitäten der Banden, die charakteristisch sind für die Ni-SR- und Ni-SR‘/SR‘‘-Zustände, 1946 cm^-1 sowie 1922, 1913 und 2052 cm^-1, deutlich schwächer waren als die der Ni-SR2-spezifischen Banden bei 1956, 2070 und 2080 cm^-1. Dies deutet auf einen höheren Anteil von [NiFe]-Zentren im Ni-SR2-Zustand hin, welcher sich durch geringe Unterschiede in den Redoxpotentialen der Kofaktoren in den beiden SH-Proteine erklären ließe. Möglich ist allerdings auch, dass die letztgenannten Schwingungsmodi nicht dem Ni-SR2-Zustand zugeordnet werden können, da sie möglichweise eine nichtreduzierbare, oxidierte [NiFe]-Spezies repräsentieren (vgl. Abb. 46, oxidiert (as isolated)). Für Letzteres spricht, dass auch das Spektrum des nach Reduktion reoxidierten SHRoMR11-Proteins Banden bei 1956, 2070 und 2080 cm^-1 zeigte (Daten nicht gezeigt, vgl. S. Wahlefeld, 2013). Das FTIR-Spektrum der NADH-reduzierten SHRoMR11 -Probe besitzt wiederum große Ähnlichkeit zu dem der NADH-reduzierten SH aus R. eutropha (Abb. 46). Beide Spektren zeigen CO- und CN^--Streckschwingungen bei 1946, 1956-1960 cm^-1 sowie 2070, 2080 und 2090 cm^-1 (Abb. 46), die den katalytisch aktiven Zuständen des [NiFe]-Zentrums, Ni-SR und Ni-C, sowie einem verbleibenen Anteil an oxidierten [NiFe]-Spezies zugeordnet werden können.

Insgesamt zeigen die spektroskopischen Untersuchungen, dass unter den verschiedenen Bedingungen äquivalente Zustände des SHRoMR11- und des SHReH16-Komplexes detektiert werden können. Ob sich die in der FTIR-Spektroskopie abzeichnenden Unterschiede in der Besetzung der verschiedenen reduzierten Zustände des [NiFe]-Zentrums durch die Reduktionsbedingungen des SHRoMR11-Komplexes, z. B. die Reduktion in Gegenwart von Ni²⁺-Ionen, modulieren lassen, muss in zukünftigen Studien untersucht werden.

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Abb. 46 FTIR-Spektren der SHRoMR11 und der SHReH16. Die Spektren (2. Ableitung) der unbehandelten (as isolated) und luftoxidierten Proben sowie der in Abwesenheit von Ni²⁺- und Mg²⁺-Ionen mit NADH/H2 (5 mM NADH und 30-minutige Inkubation unter H2-Atmosphäre) bzw. NADH (10 mM) reduzierten Proben sind gezeigt.