Spektroskopische Charakterisierung ausgewählter SH-Varianten mittels

Die in der biochemischen Charakterisierung auffälligen SH-Varianten SH^C39G, SH^C39S, SH^C41S und SH^W42S sollten im Folgenden in Zusammenarbeit mit der AG Hildebrandt von der TU Berlin spektroskopisch charakterisiert werden. Mittels UV-vis-Absorptions- und Elektronenspinresonanz-(EPR – für electron paramagnetic resonance)-Spektroskopie sollte hierbei untersucht werden, ob die Aminosäureaustausche in HoxY zu einer Veränderung der spektroskopischen Eigenschaften des Enzyms führen. Der FeS-Cluster in HoxY hatte in vorangegangen EPR-Untersuchungen am wildtypischen SH-Komplex, möglicherweise durch Kopplung mit einem nahegelegenen paramagnetischen Zentrum, keine Signale gezeigt (Lauterbach et al., 2011b, Horch et al., 2012). Sollte es sich bei dem postulierten Kopplungspartner um das aktive [NiFe]-Zentrum in HoxH handeln, wären durch eine Aufhebung des EPR-inaktiven Zustands eventuell auch neue Erkenntnisse über das aktive Zentrum zu erwarten.

Die UV-vis-Absorptionsspektren der SH-Varianten zeigten in dem für die Absorption durch FeS-Cluster charakteristischen Bereich von 320 nm bis 500 nm keine erkennbaren Unterschiede zum Spektrum der Wildtyp-SH (Abb. 36). Geringfügige Veränderung in der durch das HoxY-Cluster hervorgerufenen Absorption könnten jedoch durch die unverändert starke Absorption der für das NADH:Akzeptor-Oxidoreduktasemodul postulierten Kofaktoren, ein [2Fe2S]-Cluster und drei [4Fe4S]-Cluster, überlagert worden sein.

Abb. 36 UV-vis-Absorptionsspektren des SH^WT-Komplexes und verschiedener SH-Varianten im luftoxidierten Zustand. Die Spektren wurden auf eine Proteinkonzentration von 1 mg ml^-1 normalisiert.

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Die EPR-Messungen wurden von Dr. Friedhelm Lendzian, Marius Horch und Stefan Wahlefeld am Max-Volmer-Laboratorium der TU Berlin durchgeführt und ausgewertet. Es wurden 9,5 GHz-X-Band-Spektren der unbehandelten, luftoxidierten SH-Komplexe (as isolated) sowie von H2/NADH-reduzierten und nur NADH-reduzierten Proben aufgezeichnet (Abb. 37). Die EPR-Spektren aller oxidierten Proteinproben ähneln sich. Sie zeigen ein Signal bei g = 2.010, das einem [3Fe4S]⁺-Cluster zugeordnet werden kann (vgl. Abb. 37A). Die Spin-Quantifizierung zeigt jedoch, dass dieses Signal nur einem Anteil von etwa 10 % der SH-Komplexe entspricht (Abb. 37B). Wie schon in früheren Arbeiten lässt sich dieses Signal somit als oxidative Schädigung eines oder mehrerer [4Fe4S]-Cluster interpretieren (Horch et al., 2012). In diesem Kontext ist es interessant, dass für den SH^C41S-Komplex die Signalintensität auf 18 % erhöht ist, was auf das FeS-Cluster in HoxY als Ort der oxidativen Schädigung hindeutet (Abb. 37B). Weiterhin zeigen die Spektren der SH^C39G-, des SH^C39S- und des SH^WT-Proteine Spuren eines Signals (2-3 %), das dem paramagnetischen „Ni-B“-Zustand des aktiven [NiFe]-Zentrums zugeordnet werden kann (Abb. 37). Dieser durch einen verbrückenden Hydroxyl-Liganden zwischen dem Ni³⁺- und dem Fe²⁺-Ion charakterisierte Zustand des aktiven Zentrums konnte erst in jüngeren EPR-Studien in SH^WT-Proben nachgewiesen werden (Marius Horch, Lars Lauterbach und Dr. Friedhelm Lendzian, persönliche Kommunikation). Die physiologische Relevanz dieses Zustands ist aufgrund des substöchiometrischen Auftretens noch unklar. In den Spektren der SH^C41S- und SH^W42S -Varianten wurde kein „Ni-B“-Signal detektiert (Abb. 37).

Die EPR-Spektren der mit H2 und NADH reduzierten Proben zeigten keine offensichtlichen Unterschiede zwischen den vier SH-Varianten und dem wildtypischen SH-Komplex. Signale, die laut Spin-Quantifizierung einem [2Fe2S]⁺- und einem [4Fe4S]⁺-Cluster zugeordnet werden können, dominieren diese Spektren (Abb. 37). Dies belegt, dass die Mehrzahl der für die SH postulierten [4Fe4S]-Cluster unter diesen Bedingungen offensichtlich EPR-inaktiv ist.

Das Spektrum einer zusätzlichen mit 10 mM DTT reduzierten SH^C41S-Probe zeigte keinen Unterschied zu dem Spektrum der NADH/H2-reduzierten Probe (F. Lendzian - persönliche Kommunikation). Nach Reduktion mit NADH zeigten sich deutliche Unterschiede in den EPR-Spektren der SH^WT-, SH^C41S- und SH^W42S-Komplexe. Unter diesen Reduktionsbedingungen akkumulierte in der Probe des SH^WT-Komplexes ein als „Ni-C“

bezeichneter Zustand, der durch einen Hydrid-Liganden in der Brückenposition zwischen dem Ni³⁺- und dem Fe²⁺-Ion des aktiven Zentrums charakterisiert ist (Brecht et al., 2003, Lacey et al., 2007). Laut Spin-Quantifizierung befinden sich bis zu 65 % der SH^WT-Komplexe in diesem Zustand (Abb. 37). Für die Probe der SH^C41S-Variante liegt der Anteil bei nur 7-8 %

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Abb. 37 EPR-Spektren der SH-Varianten SH^C39G, SH^C39S, SH^C41S und SH^W42S im Vergleich zum SH^WT -Komplex. (A) Spektren der unbehandelten, luftoxidierten Proben (as isolated) wurden bei 20 K aufgezeichnet (linker Teil). Zur Reduktion mit NADH/H2 wurden 5 mM NADH zur Proteinlösung gegeben und die Proben 30 min unter H2-Atmosphäre inkubiert. Spektren dieser Proben wurden bei 10 K (mittlerer Teil) aufgezeichnet.

Zur Reduktion mit NADH wurden den Proteinlösungen 10 mM NADH in einer H2-freien Atmosphäre zugesetzt.

Die Spektren wurden bei 35 K aufgezeichnet (rechter Teil). Die Zuordnung der Signale basierend auf den charakteristischen g-Werten ist angegeben. Die Quantifizierung der Signalintensitäten ist in (B) zusammengefasst. ¹Die Signalintensitäten der [2Fe2S]-Cluster im ungekoppelten Zustand (> 20 K) wurden als Referenzwert für 1 Spin pro Proteinkomplex (= 100 %) verwendet. Die Fehlerspanne liegt bei 2 %. Die Abwesenheit eines eindeutigen Signals wurde als < 2 % angegeben. ²Signalintensitäten der [4Fe4S]-Cluster in den bei 10 K-aufgezeichneten Spektren ³Die einem Semichinon-Radikal entsprechenden Signale bei g= 2.01 wurden nicht quantifiziert. ⁴Signal-zu-Rausch-Verhältnis deutet auf eine unvollständige Reduktion dieser Probe hin. n.d. – nicht bestimmt

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und für die SH^W42S-Variante konnte kein „Ni-C“ nachgewiesen werden (Abb. 37). Die vollständige Reduktion des [2Fe2S]-Clusters und das Auftreten eines Flavin-spezifischen Semichinon-Signals deuten jedoch daraufhin, dass in der SH^W42S-Probe wie in den anderen beiden Proben das NADH:Akzeptor-Oxidoreduktasemodul der SH noch funktionsfähig ist (Abb. 37).

Zusammenfassend konnten im Hinblick auf die FeS-Cluster-spezifischen Signale nur wenige Unterschiede zwischen den SH-Varianten und dem SH^WT-Protein beobachtet werden. Die SH^C41S- und SH^W42S-Komplexe zeigten jedoch Veränderungen in den EPR-aktiven Zuständen des katalytischen [NiFe]-Zentrums. Zur ergänzenden Charakterisierung der Redoxzustände des [NiFe]-Zentrums in den SH-Varianten wurde im Folgenden Fourier-Transform-Infrarot (FTIR)-Schwingungsspektroskopie eingesetzt.

3.3.2.7 FTIR-Untersuchungen an den aktiven [NiFe]-Zentren der ausgewählten