Optimierung des Puffersystems hinsichtlich der maximalen Aktivitäten

Zur Optimierung der Reaktionsbedingungen für die SH wurden die heterohexamere Form (mit 2 Kopien von HoxI) und die heterotetramere Form (ohne HoxI) der Wildtyp-SH wie unter 2.5.3 beschrieben gereinigt. Zunächst wurde mit dem einfach durchzuführenden und gut reproduzierbaren NAD⁺-Reduktionsassay (2.7.2.1) die Langzeitstabilität sowie die Aktivität in verschiedenen Puffersystemen für beide SH-Varianten getestet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der SH-Komplexe bei Lagerung in Gegenwart 5 % (v/v) Glycerin bei -80 °C über einen Zeitraum mehr als 24 Monaten stabil bleibt (Abb. 16).

Abb. 16 Langzeitstabilität der bei –80 °C gelagerten SH-Komplexe. Der heterohexamere und heterotetramere SH-Komplex (SH6 bzw. SH4) wurden am Tag der Reinigung aliquotiert und bei -80 °C eingefroren. Die Lagerung erfolgte in 50 mM K-PO4 (pH 7,1) mit 5 % (v/v) Glycerin. Zu den angegeben Zeitpunkten wurde die H2-abhängige NAD⁺-Reduktionsaktivität in 50 mM TrisHCl (pH 8,0) mit 1,8 µM FMN und 0,6 mM DTT bestimmt. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden die Stoffumsätze auf die Zahl der SH-Komplexe bezogen.

Die NAD⁺-Reduktionsaktivitäten wurden in verschiedenen Puffersystemen bestimmt unter anderem in den standardmäßig für die Aktivitätsmessungen an der SH bzw. dem PSI verwendeten Puffern (Abb. 17). Dabei zeigte sich, dass die SH-Komplexe außer in dem

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standardmäßig für die SH verwendeten TrisHCl-Puffer auch in K-PO4-Puffer, in mit KOH eingestelltem HEPES-Puffer und in PSI-Puffer (30 mM HEPES-KOH (pH 7,5) mit 3 mM MgCl2, 50 mM KCl, 330 mM Mannitol und 0,03 % (w/v) DDM) gute Aktivitäten besitzen. Im Bereich zwischen pH 7,5 und pH 8,5 hatte der pH-Wert dabei nur einen geringen Einfluss auf die SH-Aktivität (Abb. 17). Interessanterweise wurde nur in dem den heterohexameren SH-Komplex stabilisierenden K-PO4-Puffer (50 mM, pH 7,0) ein signifikanter Aktivitätsunterschied zwischen den beiden Formen der SH beobachtet (Abb. 17).

In diesem Puffer zeigt der heterotetramere SH-Komplex eine höhere Aktivität als die heterohexamere Form der SH. Möglicherweise dissoziiert der heterohexamere SH-Komplex in allen anderen Puffersystemen in den HoxFUYH-Komplex und freie HoxI-Untereinheiten, so dass dort effektiv nur die Aktivitäten des heterotetrameren SH-Komplexes bestimmt wurden. Wie bereits in früheren Arbeiten gezeigt wurde, wirken sich Na⁺-Ionen negativ auf die NAD⁺-Reduktionsaktivität der SH aus (Keefe et al., 1995), was hier durch die Messungen in mit NaOH-eingestelltem HEPES-Puffer bestätigt werden konnte (Abb. 17).

Abb. 17 H2-abhängige NAD⁺-Reduktionsaktivität in verschiedenen Puffersystemen. Aktivitäten des heterohexameren und heterotetrameren SH-Komplexes (SH6 bzw. SH4) wurden jeweils in 50 mM Puffer mit 1,8 µM FMN und 0,6 mM DTT bestimmt. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden die Stoffumsätze auf die Zahl der SH-Komplexe bezogen. Der PSI-Puffer enthielt 30 mM HEPES-KOH (pH 7,5) mit 3 mM MgCl2, 50 mM KCl, 330 mM Mannitol und 0,03 % (w/v) DDM.

Da im SH-PSI-Hybridkomplex besonders die Fähigkeit der SH zur H⁺-Reduktion von Interesse ist, wurde für eine Auswahl der Puffersysteme auch die MV-abhängigen H2 -Produktionsaktivitäten der SH-Komplexe bestimmt (Abb. 18). Wie zu erwarten konnte dabei die höchste H2-Produktionsaktivität von 3 µmol H2 min^-1 nmol^-1 SH bei einem niedrigen pH-Wert, d. h. einer hohen Konzentration an H⁺-Ionen, beobachtet werden (Abb. 18). Die

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Aktivität des heterotetrameren SH-Komplexes in K-PO4-Puffer (50 mM, pH 7,0) war erneut höher als die des heterohexameren Komplexes (Abb. 18). Der Einfluss von Na⁺-Ionen auf die H2-Produktionsaktivität der SH konnte hier nicht untersucht werden, da das im Versuchsansatz verwendete Natriumdithionit (Na2S2O4) nur als Natriumsalz erhältlich ist. In den weiterführenden Experimenten wurde Na⁺ jedoch, soweit dies möglich war, in den Reaktionsansätzen vermieden. Im Hinblick auf Temperatur- und pH-Wert-Toleranz der SH wurden die im Folgenden verwendeten Versuchsbedingungen auch an die Beobachtungen aus der Doktorarbeit von Juliane Ratzka (J. Ratzka, 2011) angepasst.

Abb. 18 MV-abhängige H2-Produktionsaktivität in verschiedenen Puffersystemen. Aktivitäten des heterohexameren und heterotetrameren SH-Komplexes (SH6 bzw. SH4) wurden jeweils in 50 mM Puffer mit 1,8 µM FMN und 0,6 mM DTT gaschromatographisch bestimmt. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden die Stoffumsätze auf die Zahl der SH-Komplexe bezogen.

Zur Optimierung der Reaktionsbedingungen für den PSI-Komplex wurde die O2 -Reduktionsaktivität des PsaE-freien PSI-Trimerkomplexes in verschiedenen Puffersystemen untersucht. Neben dem standardmäßig verwendeten PSI-Puffer stellte sich dabei 20 mM K-PO4-Puffer (pH 7,0) mit 10 mM MgCl2 und 0,03 % (w/v) DDM als ein für das PSI geeignetes Puffersystem heraus (vgl. Abb. 19). Die Löslichkeitsgrenze ließ für diesen Puffer keinen Zusatz von CaCl2 zu. Der Zusatz von MgCl2 war jedoch für hohe und stabile Aktivitäten des PSI essentiell (vgl. Abb. 19). In dem in früheren Arbeiten für Aktivitätsmessungen am PSI verwendeten HEPES-Puffer (20 mM, pH 7,5) mit 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 und 0,03 % (w/v) DDM konnte hier nur eine um 50 % reduzierte O2 -Reduktionsaktivität bestimmt werden (Abb. 19).

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Abb. 19 O2-Reduktionsaktivität des PSI-Komplexes in verschiedenen Puffersystemen. Die Aktivität des PsaE-freien PSI-Trimerkomplexes wurde in den angegebenen Puffern (20 mM) bestimmt. MgCl2 und CaCl2

wurden, wenn angegeben, in einer Endkonzentration von 10 mM hinzugegeben. Der PSI-Puffer enthielt 30 mM HEPES (pH 7,5) mit 3 mM MgCl2, 50 mM KCl, 330 mM Mannitol und 0,03 % (w/v) DDM.

Zusammenfassend konnte hier gezeigt werden, dass die SH in diversen Puffersystemen ähnlich hohe NAD⁺-Reduktionsaktivitäten besitzt, unter anderem in dem standardmäßig für das PSI verwendeten Aktivitätspuffer. Die MV-abhängige H2-Produktion des heterotetrameren SH-Komplexes war in K-PO4-Puffer bei pH 7,0 maximal. Da bei Zusatz von MgCl2 auch das PSI in diesem Puffer sehr gute Aktivitäten zeigte, sollte neben dem PSI-Puffer (HEPES-KOH (30 mM, pH 7,5) mit 3 mM MgCl2, 50 mM KCl, 330 mM Mannitol und 0,03 % (w/v) DDM) auch 20 mM K-PO4-Puffer (pH 7,0) mit 10 mM MgCl2 und 0,03 % (w/v) DDM für die In-vitro-Charakterisierung der SH-PSI-Hybridkomplexe zum Einsatz kommen.

3.2.2.4 Analyse der SH-PSI-Hybridkomplexe hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur H2