Vergleich der Monomere

Vergleicht man die Strukturen eines Proteins in unterschiedlichen Umgebungen, sei es nun der Vergleich unabhängiger Monomere in der asymmetrischen Einheit eines Kristalls oder die Struktur des Enzyms in unterschiedlichen Kristallformen, kann man flexible und starre Bereiche zuteilen. Überlagert man die starren Bereiche aus den einzelnen Strukturen, kann man die Flexibilität des Proteins untersuchen. Das zum Vergleich der Monomere benutzte Programm ESCET (SCHNEIDER, 2002) sucht die starren Teile des Moleküls über die Unterschiede in den interatomaren Abständen. Das Programm berücksichtigt bei der Zuordnung zu starren und

flexiblen Regionen außerdem die unterschiedliche Güte der verglichenen Strukturen. Die Güte der Werte für die interatomaren Abstände wird dabei ausgehend von der Zahl und Vollständigkeit der Daten, des R- bzw. R_free-Wertes, der maximalen Auflösung und der Zahl der vollständig besetzten Lagen über eine modifizierte Form des diffraction-component precision index DPI (CRUICKSHANK, 1999) unter Einbeziehung der B-Werte der einzelnen Atome berechnet. Dies hat gegenüber einer einfachen Überlagerung nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate den Vorteil, dass das Ergebnis unabhängig davon ist, welcher Teil des Moleküls als starre Gruppe definiert und superpositioniert wurde und dass die Ungenauigkeit der Messung berücksichtigt wird.

Bei der Verfeinerung der apo-Form der AtsK wurde, wie in Kapitel 0 beschrieben, aufgrund der guten Auflösung der Struktur von 1.9 Å auf die Anwendung von ncs-restraints verzichtet.

Daher sind die Modelle der vier Monomere der asymmetrischen Einheit voneinander unabhängig.

Abb. 15 Auszüge aus der Protokoll-Datei des Programms ESCET beim Vergleich der vier Monomere der asymmetrischen Einheit der apo-Form der AtsK. Als Untergrenze für die fehlergewichteten Abstandsdifferenzen wurde 2σ verwendet. Basierend auf dem DPI sind im oberen Teil die mittleren Standardabweichungen für die Atomkoordinaten angegeben, weiterhin wurde die Zahl der Aminosäuren (bzw. der Cα-Atome) pro Monomer angegeben. Nachfolgend sind die Aminosäuren aufgelistet, die Teile starrer Gruppen sind. Im unteren Teil findet sich eine Kreuztabelle zum Vergleich der Monomere untereinander. Monomer A und B sowie C und D können als annähernd gleich angesehen werden.

In Abb. 15 ist ein Auszug aus der Protokoll-Datei des Progammes ESCET dargestellt. Es zeigte sich, dass die Güte der Modelle für die vier Monomere unterschiedlich ist. Die Monomere A und B sind etwa vergleichbar bezüglich B-Werte und Vollständigkeit des Modells und insgesamt deutlich besser als die Monomere C und D.

Abb. 16 Cartoon-Darstellung der Struktur der AtsK. Bereiche mit geringer Flexibilität sind blau, solche mit hoher Flexibilität rot dargestellt. Die Unterschiede zwischen den vier unabhängigen Monomere der asymmetrischen Einheit der apo-Form der AtsK sind auf kleine Teile des Proteins beschränkt.

In der Cartoon-Darstellung des Proteins in Abb. 16 wurden die flexiblen Regionen des Proteins in rot hervorgehoben. Die beweglichsten Teile des Proteins sind die sich an den jelly roll-Zylinder anlagernden α-Helices A und B, die nicht an der Ausbildung des Tetramers beteiligt sind und im Kristall an den Lösungsmittelbereich grenzen.

Weiterhin wurde das jeweils beste Modell einiger AtsK-Komplexe untereinander verglichen.

Der Grund, warum nicht alle untersuchten Komplexe in den Vergleich einbezogen wurden, liegt in der Ungenauigkeit der Modelle. Die Ungenauigkeit der Bindungslängen und -winkel ist im Falle der Strukturen niedriger Auflösung so hoch, dass diese Strukturen bei einem Vergleich untereinander als identisch im Rahmen der Messungenauigkeit angesehen werden.Wie in der Kreuztabelle in Abb. 17 erkennbar, kann man die Strukturen der AtsK-Komplexe in zwei Gruppen einteilen. Die erste Gruppe ist strukturell mit der apo-Form der AtsK verwandt, die zweite Gruppe umfasst den Fe-αKG-Substrat- und den Fe-Succinat-Komplex, die einen größeren Unterschied zu der apo-Form aufweisen. Der Na-αKG-Hexylsulfatkomplex (AL[7]) muss formal zu beiden Gruppen gezählt werden, da die Ungenauigkeit der Atomkoordinaten keine Zuordnung erlaubt. Die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen sind jedoch sehr gering, da – bei einer Untergrenze von 3σ für signifikante Abweichungen der Strukturen – alle Komplexe als gleich anzusehen sind. In Abb. 18 sind die flexiblen Bereiche des Enzyms im Vergleich der verschiedenen Komplexe graphisch dargestellt. Wie schon im Vergleich der vier Monomere der asymmetrischen Einheit der apo-AtsK wird die Beweglichkeit des an Lösungsmittelbereiche grenzenden Teils des jelly roll-Zylinders und der angelagerten Helix deutlich. Weiterhin variiert die Lage der Aminosäuren, die an den fehlenden loop zwischen Glu165 und Tyr191 grenzen. Dies kann einerseits auf eine wichtige Rolle der Aminosäuren in

diesem loop hindeuten. Andererseits muss berücksichtigt werden, dass die Qualität der Elektronendichte zu diesen Bereich hin abnimmt und es in der Folge während der Verfeinerung zur Fehlinterpretation gekommen sein kann.

Abb. 17 Auszüge aus der Protokoll-Datei des Programms ESCET beim Vergleich der jeweils besten Monomere der asymmetrischen Einheit verschiedener Komplexe der AtsK. "Fe_αKG_substrat"

bezeichnet den Fe-αKG-2-Ethylsulfat-Komplex, "Na_αKG_substrat" den Na-αKG-Hexylsulfat-AtsK-Komplex. Als Untergrenze für die fehlergewichteten Abstandsdifferenzen wurde 1.5σ verwendet.

Basierend auf dem DPI sind im oberen Teil die mittleren Standardabweichungen für die Atomkoordinaten angegeben, weiterhin wurde die Zahl der Aminosäuren (bzw. der Cα-Atome) pro Struktur angegeben.

Nachfolgend sind die Aminosäuren aufgelistet, die Teile starrer Gruppen sind. Im unteren Teil findet sich eine Kreuztabelle zum Vergleich der Strukturen untereinander.

Abb. 18 Cartoon-Darstellung der Struktur der AtsK. Bereiche mit geringer Variation zwischen den verglichenen AtsK-Strukturen sind blau, solche mit strukturellen Veränderungen >1.5σ rot dargestellt.