3 Ergebnisse
3.1 ESR1-Amplifikationen beim Mammakarzinom
3.1.5 Validierung der ESR1-Amplifikation mit qRT-PCR
3.1.5.1 qRT-PCR mit Geweben aus dem „Amplifikations-Test-TMA“
Um die ESR1-Amplifikation methodenübergreifend, stichprobenartig aber prinzipiell und DNS-spezifisch zu verifizieren, wurden zunächst 14 verfügbare Mammakarzinome aus dem
„Amplifikations-Test-TMA“, welche gemäß FISH-Analyse eine ESR1-Amplifikation aufwiesen, sowie zehn Karzinome ohne erkennbare ESR1-Amplifikation mit der qRT-PCR-Methode untersucht (siehe auch Kapitel 2.1.1.4).
Dieser Versuchsansatz wurde mit ESR1 als Zielgen und den beiden Genen ESR2 und SOD2 als Referenz durchgeführt. Alle PCR-Reaktionen dieses Ansatzes wurden im Triplikat angesetzt und für jedes Triplikat ein durchschnittliche relative Ratio von Zielgen zu Referenzgen errechnet. Die Normalisierung erfolgte über eine käufliche Normalstandard-DNS (siehe Kapitel 2.7.2.2). Die Kontrollansätze zeigten kein signifikantes Signal oberhalb des Hintergrundrauschens (siehe Kapitel 1.4.4 bzw. Abbildung 15).
In Tabelle 6 sind die Ergebnisse aufgeführt und in Abbildung 27 bzw. Abbildung 28 im Balkendiagramm graphisch dargestellt.
Proben der qRT-PCR
Koordinate auf dem „ESR1-
Ampflikations- Karterungs-TMA“
Ratio ESR1 / ESR2 (normalisiert)
Ratio ESR1 / SOD2 (normalisiert)
ESR1-5’-Ampflikationsstatus
ESR1-3’-Ampflikationsstatus
N25 - 1,00 1,00 - -
P1 1b 13,03 2,53 amplifiziert nicht amplifiziert
P2 1c 2,63 0,73 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
P3 1f 5,72 1,19 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
P4 1h 1,94 0,77 „gain“ nicht amplifiziert
P5 1k 3,26 1,41 „gain“ / amplifiziert nicht amplifiziert
P6 1l 2,84 1,22 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
P7 1n 3,14 1,67 amplifiziert nicht amplifiziert
P8 1o 2,64 0,95 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
P9 1p 2,92 1,79 amplifiziert nicht amplifiziert
P10 2a 1,87 1,35 mögl. amplifiziert nicht amplifiziert
P11 2b 5,12 1,66 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
P12 2d 4,5 1,14 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
P13 2f 5,29 2,23 mögl. amplifiziert nicht amplifiziert
P14 2h 8,18 1,85 amplifiziert amplifiziert
P15 2k 1,09 0,64 - -
P16 2l 1,09 0,66 - -
P17 2m 2,18 0,51 - -
P18 2n 1,52 1,04 - -
P19 2o 0,78 0,2 - -
P20 2p 1,62 0,46 - -
P21 2q 0,17 0,08 - -
P22 2r 0,78 0,34 - -
P23 3a 1,83 0,75 - -
P24 3b 3,69 1,56 - -
Mittelwert
P1-P14 4,51 1,46 - -
Mittelwert
P15-P24 1,48 0,62 - -
Median
P1-P14 3,20 1,38 - -
Median
P1-P14 1,31 0,58 - -
U-Test (p-Wert, zweiseitig)
P1-P14 / P15-P24
0,0001 0,0003 - -
Tabelle 6 Ratios des qRT-PCR-Experiments mit den Proben aus dem „Amplifikations-Test-TMA“ sowie ESR2 und SOD2 als Referenz
Ergebnisse 102
Abbildung 27 Balkendiagramm der qRT-PCR-Ratios bzgl. ESR2 als Referenz.
ESR1-amplifizierte Proben: P1 - P14. Nicht ESR1-amplifizierte Proben: P15 – P24. DNS-Normalstandard: N25.
Eigene Abbildung.
Abbildung 28 Balkendiagramm der qRT-PCR-Ratios bzgl. SOD2 als Referenz.
ESR1-amplifizierte Proben: P1 - P14. Nicht ESR1-amplifizierte Proben: P15 – P24. DNS-Normalstandard: N25.
Eigene Abbildung.
Die mit Hilfe der FISH-Methode gebildeten Gruppen der ESR1-amplifizierten Proben und der nicht ESR1-amplifizierten Proben unterscheiden sich sowohl bei ESR2 als auch bei SOD2 als Referenzgen signifikant voneinander (p = 0,00002 für ESR2 und p = 0,0001 für SOD2 als Referenz, entsprechend zweiseitigem U-Test nach Wilcoxon, Mann und Withney) (siehe auch Kapitel 2.7.2.3).
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00
N25 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24
ESR1 / ESR2
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
N25 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24
ESR1 / SOD2
Nach Ausschluß der Gewebe (P1, P4, P5, P7, P9, P10, P13 und P14) deren ESR1-Amplifikation entweder auf der 3’- oder der 5’-Seite nach den Daten der Kartierung nachweisbar oder möglicherweise über ESR1 hinausgeht, oder deren FISH-Analyse mindestens auf einer Seite nicht auswertbar waren (siehe Tabelle 6: 3’- bzw. 5’-Amplifikationsstatus), wurde der statistische Unterschied beider Gruppen erneut berechnet.
Die Berechnung zeigt, daß ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen bestehen bleibt. Der p-Wert des zweiseitigen U-Tests für die qPCR mit ESR2 als Referenz beträgt nun 0,0017 und für SOD2 als Referenz 0,015. Die entsprechenden Ergebnisse sind als Balkendiagramm der Ratios in Abbildung 29 und Abbildung 30 dargestellt.
Ergebnisse 104
Abbildung 29 Balkendiagramm der qRT-PCR-Ratios bzgl. ESR2 als Referenz.
Die Proben, deren ESR1-Amplifikation sich nicht eindeutig auf ESR1 selbst beschränkt, wurden hier von der Auswertung ausgeschlossen. ESR1-amplifizierte Proben: P2 – P12. Nicht ESR1-amplifizierte Proben: P15 – P24.
DNS-Normalstandard: N25. Eigene Abbildung.
Abbildung 30 Balkendiagramm der qRT-PCR-Ratios bzgl. SOD2 als Referenz.
Die Proben, deren ESR1-Amplifikation sich nicht eindeutig auf ESR1 selbst beschränkt, wurden hier von der Auswertung ausgeschlossen. ESR1-amplifizierte Proben: P2 – P12. Nicht ESR1-amplifizierte Proben: P15 – P24.
DNS-Normalstandard: N25. Eigene Abbildung.
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
N25 P2 P3 P6 P8 P11 P12 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24
ESR1 / ESR2
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80
N25 P2 P3 P6 P8 P11 P12 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24
ESR1 / SOD2
3.1.5.2 qRT-PCR mit Geweben aus einem alternativen Kollektiv
Mit einem alternativen Kollektiv von zehn weiteren Mammakarzinomen, welche gemäß FISH-Analyse eine ESR1-Amplifikation trugen und zehn weiteren entsprechenden Kontrollgeweben wurde eine neue qRT-PCR durchgeführt (siehe auch Kapitel 2.1.1.4 und 4.4.2).
Um sicherzustellen, daß hierbei nur Teile der Gewebeproben mit einer möglichst hohen Dichte an Tumorzellen zur Analyse kamen, wurde die Lasermikrodissektion eingesetzt.
Neben SOD2 wurde in diesem Ansatz auch ASXL2 ausgewählt.
Auch hier zeigte sich entsprechend dem zweiseitigen U-Test ein signifikanter Unterschied in der Ratio sowohl bei ESR1 zu SOD2 (Median: 1,25 bzw. Mittelwert 1,33) als auch bei ESR1 zu ASXL2 (Median: 2,00 bzw. Mittelwert 1,99) zwischen den gemäß FISH-Untersuchung als ESR1-amplifiziert und den als nicht amplifiziert eingestuften Mammakarzinomen (Median auf den Wert 1 gesetzt ) (p = 0,0007 für SOD2 und p = 0,003 für ASXL2 als Referenz) (Tabelle 7, Abbildung 31 und Abbildung 32).
Bezüglich des Referenzgens ASXL2 erreichen vier bis fünf der zehn gemäß FISH-Analyse ESR1-amplifizierten Proben eine Ratio % 2,0. Dies entspricht ca. 40 - 50 %. Wiederum hochgerechnet auf eine Amplifikationsrate gemäß FISH-Analyse der vorliegenden Arbeit von 20,6 %, ergibt sich hypothetisch eine durch qPCR bestätigte Amplifikationsrate von ca. 8 10 % einer entsprechenden Gesamtheit an Mammatumoren.
Ergebnisse 106
Tabelle 7 Ratios des qRT-PCR-Experiments mit den Proben des alternativen Gewebekollektivs sowie SOD2 und ASXL2 als Referenz
Probe
Ratio (Median N = 1)
ESR1 / SOD2
Ratio (Mittelw. N = 1)
ESR1 / SOD2
Ratio (Median N = 1)
ESR1 / ASXL2
Ratio (Mittelw. N = 1)
ESR1 / ASXL2
ESR1-5’-Ampflikationsstatus
ESR1-3’-Ampflikationsstatus
1A 1.01 1,10 1,31 1,16 nicht amplifiziert n.a.
2A 1.74 1,89 2,46 2,19 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
3A 1.68 1,82 3,71 3,31 n.a. n.a.
4A 1.25 1,36 1,37 1,22 n.a. n.a.
5A 1.11 1,21 2,29 2,04 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
6A 1.05 1,14 1,92 1,71 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
7A 1.13 1,23 2,00 1,78 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
8A 1.25 1,36 2,47 2,21 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
9A 1.37 1,49 1,19 1,06 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
10A 1.74 1,89 1,63 1,45 nicht amplifiziert nicht amplifiziert
1N 0.87 0,94 0,68 0,60 - -
2N 1.03 1,12 2,17 1,93 - -
3N 0.77 0,83 0,95 0,85 - -
4N 1.01 1,10 1,37 1,22 - -
5N 1.23 1,34 1,53 1,36 - -
6N 0.46 0,50 0,58 0,51 - -
7N 0.99 1,07 1,22 1,09 - -
8N 1.03 1,12 1,02 0,91 - -
9N 1.07 1,16 0,73 0,65 - -
10N 0.75 0,81 0,98 0,88 - -
Median (A) 1,25 1,36 2,00 1,74 - -
Mittelw. (A) 1,34 1,45 1,99 1,81 - -
Median (N) 1,00 1,09 1,00 0,89 - -
Mittelw. (N) 0,92 1,00 1,12 1,00 - -
- -
U-Test (zweitseitig)
p-Wert 0,0007 0,001 0,003 0,003
- -
Abbildung 31 Balkendiagramm der qRT-PCR-Ratios des alternativen Kollektivs bzgl. SOD2 als Referenz ESR1-amplifizierte Proben: 1A – 10A. Nicht ESR1-amplifizierte Proben: 1N – 10N (Median N = 1). Eigene Abbildung.
Abbildung 32 Balkendiagramm der qRT-PCR-Ratios des alternativen Kollektivs bzgl. ASXL2 als Referenz ESR1-amplifizierte Proben: 1A – 10A. Nicht ESR1-amplifizierte Proben: 1N – 10N (Median N = 1). Eigene Abbildung.
Der Box-Plot für die Ratios der ESR1-qRT-PCR mit dem Referenzgen ASXL2 ist in Abbildung 33 dargestellt.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00
1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 8A 9A 10A 1N 2N 3N 4N 5N 6N 7N 8N 9N 10N
ESR1 / SOD2
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00
1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 8A 9A 10A 1N 2N 3N 4N 5N 6N 7N 8N 9N 10N
ESR1 / ASXL2
Ergebnisse 108
Abbildung 33 Box-Plot für die Ratios der ESR1-qPCR bzgl. des Referenzgens ASXL2 (Median N = 1).
Eigene Abbildung in der Zusammenarbeit mit R. Simon und O. Hellwinkel .
Auch hier wurde nach Ausschluß der Gewebe (1A, 3A und 4A) deren ESR1-Amplifikation mindestens auf einer Seite über ESR1 hinausgeht, oder deren FISH-Analyse mindestens auf einer Seite (3’ oder 5’) nicht auswertbar war (siehe Tabelle 7), der statistische Unterschied beider Gruppen erneut berechnet. Der diesbezügliche p-Wert des zweiseitigen U-Tests (nach Wilcoxon, Mann und Withney) für die qPCR mit SOD2 als Referenz beträgt nun 0,001 (Median und Mittelwert) und für ASXL2 als Referenz 0,005 (Median und Mittelwert), berechnet sowohl für den auf den Wert 1 gesetzten Median als auch den auf 1 gesetzten Mittelwert der gemäß FISH-Analyse nicht amplifizierten Proben. Die entsprechenden Ergebnisse sind als Balkendiagramm der Ratios (für den auf 1 gesetzten Median der Ratios der gemäß FISH-Analyse nicht ESR1-amplifizierten Gewebeproben) in Abbildung 34 und Abbildung 35 dargestellt.
Abbildung 34 Balkendiagramm der qRT-PCR-Ratios des alternativen Kollektivs bzgl. SOD2 als Referenz.
Die Proben, deren ESR1-Amplifikation sich nicht eindeutig auf ESR1 selbst beschränkt, wurden hier von der Auswertung ausgeschlossen. ESR1-amplifizierte Proben: 2A – 10A. Nicht ESR1-amplifizierte Proben: 1N – 10N (Median N = 1). Eigene Abbildung.
Abbildung 35 Balkendiagramm der qRT-PCR-Ratios des alternativen Kollektivs bzgl. ASXL2 als Referenz.
Die Proben, deren ESR1-Amplifikation sich nicht eindeutig auf ESR1 selbst beschränkt, wurden hier von der Auswertung ausgeschlossen. ESR1-amplifizierte Proben: 2A – 10A. Nicht ESR1-amplifizierte Proben: 1N – 10N (Median N = 1). Eigene Abbildung.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00
2A 5A 6A 7A 8A 9A 10A 1N 2N 3N 4N 5N 6N 7N 8N 9N 10N
ESR1 / SOD2
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
2A 5A 6A 7A 8A 9A 10A 1N 2N 3N 4N 5N 6N 7N 8N 9N 10N
ESR1 / ASXL2
Ergebnisse 110