Messung der ESR1-Kopiezahl mit qPCR

von 22,6 % (FISH) und der starken Assoziation zwischen ESR1-Kopiezahl und der ER-Proteinexpression (Holst, Stahl et al. 2007), zusammen mit den Ergebnissen von Nessling et al., die durch eine eindeutig DNS-spezifische Methode ermittelt wurden (aCGH) (Nessling, Richter et al. 2005) und der Verfizierung einer ESR1-spezifischen DNS-Kopiezahlvermehrung in repräsentativen Tumoren durch qPCR (inkl. solcher Fälle, in denen die Amplifikation auf ESR1 beschränkt ist, siehe auch Kapitel 3.1.5) und dem Ausbleiben von FISH-Signalclustern bei vergleichbar transkribierten Genen (PGR, C6orf97), ist es naheliegend, daß es sich bei den als ESR1-Amplifikation beschriebenen kleinen Signalclustern, im wesentlichen Anteil der Fälle, weder um physikalische Artefakte noch um subjektive Zähl-Artefakte handelt.

Bzgl. der ESR1-Amplifikationsrate bei Mammakarzinomen (FISH) ist diesbezüglich auch die Arbeit von Tsiambas et al. mit 21,6 % interessant (Tsiambas, Georgiannos et al. 2010).

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die derzeitige Datenlage bzgl. der ESR1-Amplifikation in Brustkrebs nahelegt, daß die Detektion von ESR1-Amplifikationen schwierig ist und die Berücksichtigung anderer methodischer Kriterien erfordert als die Detektion von HER2-Amplifikationen.

Die HER2-Amplifikation wird allgemein als ein Paradigma einer Genamplifikation angesehen und es scheint, als sei im allgemeinen die methodische Handhabung der Auswertung zur Detektion von Genamplifikationen lediglich an eine ausreichende Erkennung von Amplifikationen dieses Gens angepaßt. Insofern säen diese Unterschiede zwischen ESR1- und HER2-Amplifikationen Zweifel bzgl. der Anwendbarkeit der entsprechenden Handhabung für die Analyse von ESR1-Amplifikationen.

Diskussion 146 anderen Studien und der Reproduktion der Ergebnisse bzgl. eines alterntiven Gewebekollektivs wurde in einem weiteren Ansatz mit anderen Proben zusätzlich zu SOD2 auch das Gen ASXL2 als Referenz gewählt . Die Ergebnisse bzgl. aller drei Referenzgene und beider Gewebekollektive zeigen in den DNS-Proben der Gewebe, die gemäß FISH-Analyse eine ESR1-Amplifikation tragen, im Vergleich zu den Kontrollproben ohne entsprechend festgestellte ESR1-Amplifikation gleichermaßen deutlich eine signifikant erhöhte Ratio von ESR1 zu Referenzgen (Kapitel 3.1.5). Dies zeigt, daß nicht genetische Abberrationen bzgl.

einzelner Referenzgene für erhöhte qRT-PCR-Ratios verantwortlich sind (Brown, Hoog et al.

2008; Reis-Filho, Drury et al. 2008).

Etwa durch frequente Deletionen des Referenzgens fälschlich als amplifiziert eingestuften Proben müßten zudem, bei gewöhnlicherweise einem deletierten Allel und über einen Normal-DNS-Standard normalisiert, eine 2-fach, also verhältnismäßig gering erhöhte Ratio der Kopiezahl aufweisen. Die selben Proben müßten gleichzeitig bei der Messung gegen andere Referenzgene wie SOD2 eine normale Ratio von 1 (ESR1 / SOD2) haben. Als mögliche Fälle kämen hierfür nur zwei der vierzehn Proben (ca. 14 %), nämlich Nummer 4 und 10, in Frage (für Ratio ESR1 / ESR2 > 1,5 aber < 2,5 und Ratio ESR1 / SOD2 > 0,5 aber

< 1,5 und Ratio ESR1 / ESR2 - Ratio ESR1 / SOD2 % 0,5). Jedoch zeigen die Ergebnisse auch, daß bzgl. ESR2 die Ratios durchschnittlich dreifach so hoch ausfallen wie bei SOD2 (ebenso bei den Kontrollen).

Zudem müßten bei generell häufigem Auftreten von ESR2-Deletionen die Kontrollproben der Tumore, die gemäß FISH-Analyse eine normale ESR1-Kopiezahl aufweisen, ebenfalls prinzipiell ESR2-Deletionen aufweisen. Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen „FISH-amplifiziert“ und „nicht FISH-amplifiziert“ wäre so also nur dadurch zu erklären, daß sich ESR2-Deletionen zufälligerweise nur in der gemäß FISH-Analyse ESR1-amplifizierten Gruppe häufen würden.

Hinzu kommt, daß die meisten (sieben von neun) der Proben, die bzgl. ESR2 als Referenz durch deutliche erhöhte (> 3) Ratios auffallen (Probe P1, P3, P5, P7, P9, P11, P12, P13, P14), auch bzgl. SOD2 als Referenz eine verhältnismäßig stark (Ratio ca. % 1,5) erhöhte Ratio aufweisen (Probe P1, P5, P7, P9, P11, P13, P14). Auch dadurch wird die Möglichkeit unwahrscheinlich, daß ein ausschlaggebendes Maß deutlich erhöhter Ratios (ESR1 / Referenzgen) lediglich durch Deletionen des einen bzw. anderen Referenzgens entstünde.

Auch ergeben sich keine Hinweise auf ESR2- oder SOD2-Deletionen in entsprechender Literatur (Chin, DeVries et al. 2006). Lediglich für Mammakarzinome des sogenannten

„basal-like“-Typs, welche als ER-negativ bekannt sind (Perou, Sorlie et al. 2000; Nielsen, Hsu et al. 2004), sind 14q-Deletionen beschrieben (Adelaide, Finetti et al. 2007).

Auch ergaben die FISH-Untersuchungen der vorliegenden Arbeit keinen Hinweis auf ESR2-Deletionen in den verwendeten Proben (Kapitel 3.4).

Zudem ist es unwahrscheinlich, daß gleich erscheinende clusterartige Amplifikationsmuster mit einzeln separierbaren Signalen in einem Fall eine durch qPCR validierbare echte Genamplifikation darstellen, in dem nicht durch qPCR validierbaren Fall mit gleichem Erscheinungsbild in der FISH-Analyse, jedoch ein Artefakt. Es ist daher unwahrscheinlich, daß sich die Gruppe der gemäß FISH-Analyse amplifizierten Proben nur aufgrund weniger

„Ausreißer-Proben“ mit tatsächlich erhöhter Ratio der Kopiezahl (ESR1 zu Referenzgen auf DNS-Ebene) durschnittlich signifikant von der Gruppe der gemäß FISH-Analyse nicht amplifizierten Proben unterscheidet. Eine mögliche Erklärung für die schwierige Nachweisbarkeit der Amplifikation mit qRT-PCR wäre eine eine massive Kontamination mit Zellen, die keine ESR1-Amplifikation tragen (siehe Kapitel 4.4.3). Zu diesen Werten ist zudem festzustellen, daß diese gegen den Standard normalisiert sind. Betrachtet man die Ratios der in der FISH-Analyse als normal eingestuften Proben, so fällt auf, daß diese im Durchschnitt deutlich unter 1 liegen. Gegen das auf 1 gesetzte Mittel der in der FISH-Analyse als normal eingestuften Proben würden die Ratios der in der FISH-Analyse ESR1-amplifizierten Proben auch in der Ratio ESR1 / SOD2 deutlich höher liegen. Hier zeigt sich darin, daß für die Normalisierung auf nur eine und zudem käufliche Standard-Probe mit DNS-Material, das sich qualitativ von dem der Tumorproben stark unterscheidet, zurückgegriffen wurde, möglicherweise eine Schwäche des Experiments. Die Standardabweichung der CT-Werte der drei Triplikate des Standards lag bzgl. SOD2 bei 0,24 Zyklen.

Bzgl. des Normalstandards scheint dadurch, daß die gegen ESR2 gemessenen Ratios der Proben im Mittel tatsächlich deutlich höher ausfallen als die gegen SOD2 gemessenen, die ESR1-Amplifikationsrate bei ESR2 als Referenz wesentlich höher als bei SOD2. Jedoch ergibt die Analyse zwar deutlich höhere Ratios, aber im Vergleich zu der Kontrollgruppe keine deutlich höhere Rate von Proben mit erhöhter Kopiezahl („Amplifikationsrate“). Lediglich 2 3 (Probe P2, P4 und P8) der 14 Proben (14 – 21 % der amplifizierten Proben) bewegen sich im Bereich des Durchschnitts der in der FISH-Untersuchung normal erscheinenden Proben.

Sowohl die bzgl. ESR2 als auch die bzgl. SOD2 als Referenz gemessenen Ratios bei den in der FISH-Untersuchung nicht amplifiziert erscheinenden Proben (vor allem Probe P24) machen die Möglichkeit erwähnenswert, daß bei der mit Hilfe der Array-Technologie durchgeführten FISH-Analyse, aufgrund der geringen zur Verfügung stehenden

Diskussion 148 Analysefläche des einzelnen „Gewebespots“, Amplifikationen übersehen worden sein könnten. Solche Fälle würden in der Kontrollgruppe der gemäß FISH-Analyse nicht amplifizierten Gewebe bei der qPCR-Analyse eine erhöhte Ratio zeigen, da im analysierten Gewebematerial ESR1-amplifizierte Zellkerne vorhanden wären. Aufgrund möglicher Heterogenität bei den in der FISH-Untersuchung als amplifiziert gewerteten Proben ist es, durch die gleichen Einschränkung der Array-Technologie, zudem möglich, daß für die qPCR-Methode weitgehend nicht oder weniger amplifiziertes Material untersucht worden ist. Bzgl.

der Bewertung der Ergebnisse der qRT-PCR ist daher zu betonen, daß die Einteilung der Proben in „amplifiziert“ und „nicht amplifiziert“ durch die FISH-Technik erfolgte und anschließend die Untersuchung der beiden Gruppen mit der qRT-PCR-Technik durchgeführt wurde.

Betrachtet man, wie gut die relativen Ratios der Proben bzgl. des Referenzgens ESR2 zueinander mit den Ratios bzgl. des Referenzgens SOD2 bei den Normalkontrollen korrespondieren, so fällt auf, daß die absoluten Werte der Ratios bzgl. einer Probe bei beiden Referenzgenen sehr unterschiedlich, d. h. die Ratios bei ESR2 deutlich höher ausfallen. Eine ähnliche Beobachtung ergibt sich bei ASXL2 und SOD2. Dies unterstützt ebenfalls die Beobachtung, daß der absolute Wert der Ratio generell abhängig vom gewählten Referenzgen ist und nicht lediglich von den Mengenverhältnissen der jeweiligen DNS-Sequenzen einer bestimmten Probe.