Untersuchungsmethoden

pH-Wertmessung

Die Messung des pH-Wertes erfolgte mithilfe einer Einstechelektrode der Firma Ebro mit der Bezeichnung AT 206. Die Kalibrierung wurde mittels einer basischen (pH 7,01 ± 0,02) und einer sauren Pufferlösung (pH 4,01 ± 0,02) durchgeführt. Für die Reinigung von eiweißhaltigen Pufferlösungen wurde ein Elektrodenreiniger (Pepsin-HCl-Gemisch) verwendet. Die Elektrode wurde in einer Kaliumchloridlösung mit einer Konzentration von 3 mol/l aufbewahrt. Das pH-Meter wurde stets am Tag der Nutzung neu kalibriert.

Material und Methoden

78 Farbmessung

Zur Erfassung der Farbveränderungen wurde die Farbe anhand einer Fünffachbestimmung mit dem Minolta Chroma-Meter CR-200 (München, Deutschland) bestimmt. Zur Messung wird das L*a*b*-System angewandt (Loos et al. 1989). Jede Farbe wird dabei im dreidimensionalen Farbraum durch den Farbort mit den Koordinaten L*a*b* dargestellt. Die L-Werte bilden die Helligkeitsachse und stehen auf den a* und b* Achsen senkrecht. Dabei wird die Rot-Grün-Achse durch die a*-Werte und Gelb-Blau-Achse durch die b*-Werte dargestellt. Aus den ermittelten L*a*b*-Farbwerten kann mit folgender Formel die Gesamtfarbdifferenz berechnet werden.

√ (7)

Gesamtstickstoff (Gesamtproteinbestimmung)

Nach § 64 LFGB L06.00-7 wurde der Rohproteingehalt in g/100g nach Kjeldhal bestimmt.

Proteingehalt der löslichen Proteine

Um eine Veränderung des Anteils an löslichen Proteinen quantitativ zu bestimmen, wurde 1 g Fleisch klein geschnitten und mit der 20-fachen Menge an einer 1 %igen NaCl-Lösung versetzt. Bei 20.000 U min^-1 wurde für 1 min mit dem Ultraturrax (IKA T25 Digital Ultraturrax, Staufen, Deutschland) homogenisiert. Anschließend wurde der Überstand abzentrifugiert (15.000 U min^-1) mit der Zentrifuge HettichUniveral 320R (Mühlheim an der Ruhr, Deutschland) und nach Kjeldhal (siehe Gesamtproteingehalt) der Anteil des Proteingehalts im Überstand bestimmt.

Porteinzusammensetzung qualitativ (SDS-Page)

Die Auftrennung der Zusammensetzung löslicher Proteinanteile erfolgte mit der SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese). Die Proteine werden hierbei im elektrischen Feld nach Größe getrennt. Große Proteine haben eine kürzere Laufstrecke als kleine Proteine. Die Probenaufarbeitung erfolgte bei Raumtemperatur. Es wurde 1 g klein geschnittenes Fleisch mit der 20-fachen Menge NaCl-Lösung (1 %ig) versetzt. Bei 20.000 U min^-1 wurde für 1 min mit dem Ultraturrax (IKA T25 Digital Ultraturrax, Staufen, Deutschland) homogenisiert. Anschließend wurden 10 µl des Überstandes nach dem Zentrifugieren in der

Material und Methoden

79 Zentrifuge Universal 320R (Hettich, Mühllheim an der Ruhr) (15.000 U min^-1) in 250 µl Laemmlipuffer in E-Cups aufgefangen und bei 95 °C für 5 min im Wasserbad erhitzt. Das Laufmittel der Elektrophorese besteht aus 12,1 g Tris/7,5 g Glycin/1,0 g SDS auf 1 Liter mit bidest. H₂O gelöst. Es werden folgende Gele und Molekularmarker verwendet: CuterioPre Cast 4 – 20 % TrisHCl, Sigma Marker Wide Range 6.500 – 205.000 kDa (Sigma Aldrich).

Laufbedingungen siehe Tabelle 12.

Tabelle 12: Laufbedinungen der SDS-Page Zeit

[min]

Spannung [V]

Stromstärke [mA]

Leistung [Watt]

10 200 100 150

50 200 60 150

GPC-Bestimmung

Die GPC-Analyse erfolgte mittels einer Waters 2695 Alliance SeperationModule (Waterd, Milford MA, USA). Als Puffer wurde ein wasserlöslicher Phosphatpuffer (0,15 M) verwendet.

Proben wurden bei Raumtemperatur vorbereitet und bei einer Flussrate von 0,5 ml min^-1n einer Superdex 200 10/300 aufgetrennt (10 * 300 mm, 13µ, GE Healthcare, München, Deutschland). Peakdetektion erfolgte bei 214 nm.

DSC-Messungen

Die Differential-Scanning-Calometrie Methode ist eine Methode, um Strukturveränderungen von Polymeren wie z. B. Proteinen nachzuvollziehen. Dabei wurd der Enthalpiestrom von mariniertem Fleisch im Vergleich zu einer Referenzprobe gemessen und dadurch ein auf den Denaturierungsgrad rückgeschlossen. Hierzu wurde 0,20  0,01 mg Fleisch in einen Aluminiumtiegel eingewogen und verschlossen. Zunächst wurde die Probe auf 5 °C heruntergekühlt und 5 min temperiert. Im Anschluss erfolgte die Erhitzung im Temperaturbereich zwischen 5 und 95 °C mit einer Heizrate von 5 K min^-1n in der DSC 2920 CE der Firma TA Instrument (Alzenau, Deutschland).

Material und Methoden

80 Texturanalyse

Mit dem Textur-Analyser Expert TA-XT2 (Texas Instruments, Hannover, Deutschland) wurde die Festigkeit der Probe nach und vor der HP-Behandlung bestimmt. Diese Texturanalyse dient zur Bestimmung der Druck-Zug-Belastung im Messbereich bis 50 N. Das Messer (Prüfkörper) fährt dabei mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 2 mm s^-1 nach unten (Kompression). Die Maximalkraft zur angegebenen Messtrecke wird bestimmt. Somit ist die Maximalkraft abhängig vom Prüfweg und dem Widerstand der Probe selbst. Gemessen wird somit der Widerstand, den das Probestück entgegensetzt. Beim Fleisch erfolgte die Materialprüfung durch ein Messer, das quer zur Faserung mit einer Geschwindigkeit v = 1 mm s^-1 in einer Halbschale geführt wird. Darstellung der Ergebnisse erfolgt in einem Kraft-Weg-Diagramm und unter Angabe der Maximalkraft pro Fläche. Die Proben wurden in Stücke der Kantenlänge 3 auf 3 cm und einer Höhe von 1,5 ± 0,2 cm (abh. Vom Putensteak) vorgeschnitten. Es wurde darauf verzichtet, eine einheitliche Höhe zurechtzuschneiden, da dadurch bereits eine Veränderung der nativen Struktur bewirkt würde. Die Untersuchungen erfolgte im Dreifachansatz von verschiedenen Putenstücken.

Oszillation

Der Oszillationsversuch erfolgte mit einem Rheometer der Firma TA Instruments (AR 2000).

Dabei werden Strukturelemente gedehnt, jedoch nicht zerstört. Sobald die Kraft nicht mehr auf die Matrix einwirkt, wird die ursprüngliche Struktur soweit wie möglich wiederhergestellt.

Mithilfe des Speichermoduls G‘ und des Verlustmoduls G‘‘ lassen sich Rückschlüsse auf die elastischen und viskosen Eigenschaften im Käse ziehen. Dadurch ist man in der Lage, die Struktur sowie das Proteinnetzwerk des hochdruckbehandelten und unbehandelten Camemberts näher zu beschreiben.

Das Speichermodul G‘ kennzeichnet die Spannung, die aufgewendet werden muss, um eine reversible Deformation zu erzeugen. Bei dem Verlustmodul G‘‘ hingegen geht es um die Spannung, die aufgewendet werden muss, um Energie in eine andere Energieform (z. B.

thermische Energie) umzuwandeln.

Aus diesen Modulen beiden lässt sich der Verlustfaktor mit der nachstehenden Formel berechnen

(8)

Material und Methoden

81 Drip loss

WHC definiert die Fähigkeit von Fleisch verstanden, eigens Wasser, bei Anwendung einer Bestimmten Kraft festzuhalten. Drip loss entspricht dabei dem Tropfsaftverlust. Die ausgepresste Flüssigkeitsmenge ist eine Funktion des angewandten Drucks, mathematisch ausgedrückt V = f(p). Die WHC wurde mit einer modifizierten Pressmethode nach Grau/Hamm (1952) (Hamm 1972) bestimmt. Hierzu wurden 1 ± 0,19 g Fleischstücke (quadratisch 1 cm auf 1 cm und ca. 2 mm hoch) zwischen zwei Filterpapierstücken für 5 min mit einem Gewicht von 5 kg belastet. Der Verlust an Fleischsaft wurde gravimetrisch bestimmt und bezieht sich auf das Gesamtgewicht. Die Bestimmung erfolgte ebenfalls an drei verschiedenen Versuchstagen in je einem Doppelansatz, um eine möglichst weite Streuung gewährleisten zu können.

(8)

Bestimmung des Gesamtfettgehalts

Die Untersuchung zur Bestimmung des Gesamtfettgehalts wurde mithilfe der Methode nach Caviezel durchgeführt. Diese ermöglicht es, den Gesamtfettgehalt und auch das Fettsäureprofil in kurzer Zeit zu erfassen. Das Fett wird dabei unter Zugabe eines internen Standards (Tridekansäure) und eines hochsiedenden, relativ polaren Lösungsmittels extrahiert und anschließend mit Kaliumhydroxid alkalisch aufgeschlossen. Die Verseifung erfolgt in der BÜCHI Extraktion Unit B-815. Die entstehenden Kaliumsalze werden unter Zugabe von Natriumhydrogenphosphat in die entsprechenden Fettsäuren überführt, anschließend gaschromatographisch in der BÜCHI Fat Determination B-820 getrennt und daraufhin mittels Flammenionisationsdetektor gemessen. Der Gesamtfettgehalt kann gleichzeitig in den Triglyceridanteil umgerechnet werden.

Bestimmung des Kochsalzgehalts

Die Bestimmung des Kochsalzgehalts erfolgte über den Nachweis des Chloridanteils nach Volhard (Anonym 2005c). Das Chlorid in der Probe wurde mit einem Überschuss an Silbernitrat-Lösung zunächst ausgefällt und abfiltriert. Anschließend erfolgte die Rücktitration mit einer Ammoniumthiocyanat-Lösung. Dadurch wurde der Überschuss der Silber-Ionen in Anwesenheit von Eisen(III)-Ionen unter Bildung von rotem Eisen(III)-thiocyanat zur Indikation des Äquivalenzpunktes ermittelt (§ 64 LFGB L 06.00-5).

Material und Methoden

82 Anteil an extrahierbarem Fett

Für die Ermittlung des extrahierbaren Fettanteils muss die spezifische Oberfläche des Käses zunächst vergrößert werden. Um durch einen erhöhten Energieeintrag eine Schädigung der Struktur und somit ein zusätzliches Austreten an extrahierbarem Fett zu verhindern, wurden die Käse in gefrorenem Zustand zerkleinert. Dazu wurde zunächst Trockeneis in einem Mixer (Blendtec, Modul ES3 HP3A) in den Pulverzustand überführt. Anschließend wurde der Käse, welcher zuvor in Scheiben vorzerkleinert wurde, in den Mixer mit dem Trockeneispulver gegeben, schockgefroren und gleichzeitig bis auf eine Pulvergröße von wenigen Millimetern Durchmesser zerkleinert. Nach der Zerkleinerung wurden die Proben bis zur Analyse des extrahierbaren Fettanteils bei 4 °C gelagert.

Die Untersuchung erfolgte anschließend nach folgendem Prinzip.

Der extrahierbare Fettanteil wird mittels Petroleumbenzin aus der Käsematrix gelöst.

Daraufhin wird das Lösungsmittel über einen Rotationsverdampfer entfernt. Über die Rückwaage der verwendeten Kolben kann der Anteil des Fettes bestimmt werden. Das Verfahren ist an die Methoden zur Bestimmung des extrahierbaren Fettanteils nach Kielmeyer und Schuster (1986) angelehnt.

Die Berechnung des Anteils an extrahierbarem Fett wird in der folgenden Formel beschrieben.

[

[

[ [ (9)

Bestimmung der Trockenmasse und des Wassergehalts

Bei der Bestimmung der Trockenmasse (Anonym 2005b) wird zunächst das Leergewicht einer Nickel- oder Aluminiumschale eingewogen. Anschließend werden 3 g der vorzerkleinerten Probe in die Schale gegeben und erneut gewogen. Die Probe wird nun mithilfe eines Glasstabes sorgfältig verrieben und daraufhin bei 105 °C für 4 h im Trockenschrank getrocknet. Im nächsten Schritt werden die Proben im Exsikkator gekühlt und die Schale erneut gewogen. Die Trocknung wird so lange fortgesetzt, bis die Gewichtskonstanz erreicht wurde. Die Trocknung erfolgt dabei für 30 min (§ 64 LFGB L 06.00-3).

Material und Methoden

83 Der Wassergehalt ergab sich aus der Differenz der eingewogenen Probe und der ermittelten Trockenmasse.

Laktosebestimmung

Der Gehalt an Laktose wurde anhand einer HPLC-Hausmethode bestimmt. Dabei wurde ein Teil der Rohmilchprobe mit Milli-Q-Wasser (Millipore Corporation, USA) versetzt und unter Wärmeeinfluss für einige Zeit gerührt. Anschließend wurden die in der Probe enthaltenen Proteine mit Carrez I (1,5 g/l Kaliumhexacyanoferrat-Lösung) und II (3,0 g/l Zinkacetat-Dihydrat) gefällt. Mit Milli-Q-Wasser wurde dann auf ein definiertes Volumen aufgefüllt und daraufhin filtriert. Aus dem Filtrat wurde ein Aliquot entnommen, in ein Vial gegeben und mit Acetonitril (ACN) auf 1 ml aufgefüllt. Ein ACN-Wasser-Gemisch dient als Eluent, in dem die Probe isokratisch über eine amino-modifizierte Kieselgelphase (-NH₂) gefahren wurde. Die Detektion erfolgte schließlich mithilfe eines Brechungsindex-Detektors (Waters 2996 Photodiode Array Detector). Die Trennung wurde auf dem HPLC-Alliance System (Waters 2695 Separations Module) der Firma Waters Corporation durchgeführt.

Bestimmung der POZ (Peroxidzahlen)

Zunächst wurde das Fett aus dem Probematerial per Kaltextraktion gewonnen. Dazu wurde am Tag der Analyse die Probe zerkleinert. Ca. 100 – 500 g Probenmaterial wurden in eine Braunglasflasche gefüllt und mit ca. 200 – 300 ml Hexan aufgefüllt, zwei Stunden auf einen Schüttler gestellt und rühren gelassen. Das Lösungsmittelextrakt wurde mittels Faltenfilter in einen Rundkolben abgefiltert. Das Filtrat wurde trocken einrotiert (Bad 40 °C). Der Rückstand wurde min. 10 Minuten abgekühlt.

Vom Rückstand wurden 0,9 g bis 1,1 g Fett in ein Becherglas (100 ml) eingewogen. Es wurden 10 ml Lösungsmittelgemisch (Eisessig/Dekanol 3:2) sowie 200 SlKaliumjodidlösung dazugegeben und gemischt. Das Becherglas wurde für 1 min ins Dunkle gestellt. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von 50 ml entmin. Wasser. Das gebildete Jod im Gemisch wurde mit 0,005 M Natiumthiosulfatlösung titriert. In gleicher Weise wurde (ohne Fetteinwaage) der Blindwert erstellt. Die Titration erfolgte im Titrino, die Auswertung über die Berechnung (über Titrino):

Material und Methoden

84 [ ] (10)

C00– Probeneinwaage in Gramm

C01– 5 bei Verwendung einer 0,005 M Natriumthiosulfatlösung C22– Verbrauch in ml Natriumthiosulfatlösung für den Blindwert C23– Titer der verwendeten Thiosulfatlösung

EP1– Verbrauch in ml Natriumthiosulfatlösung die Probe

Das Verfahren erfolgte in Anlehnung an § 64 LFGB: L13.00-6.

Material und Methoden

85

Im Dokument Hydrostatischer Hochdruck (Seite 91-99)